Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Podsumowanie

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Streszczenie

Idealne systemy ekspresji bezkomórkowej mogą teoretycznie emulować środowisko komórkowe in vivo na kontrolowanej platformie in vitro. ¹ Jest to przydatne do kontrolowanej ekspresji białek i obwodów genetycznych, a także do zapewnienia środowiska prototypowania biologii syntetycznej. ^2,3 Aby osiągnąć ten ostatni cel, bezkomórkowe systemy ekspresji, które zachowują endogenne mechanizmy transkrypcji-translacji Escherichia coli, są w stanie dokładniej odzwierciedlić dynamikę komórkową in vivo niż te oparte na transkrypcji polimerazy T7 RNA. Opisujemy przygotowanie i wykonanie wydajnego endogennego systemu ekspresji bezkomórkowego opartego na transkrypcji i translacji (TX-TL) opartym na E. coli, który może wytwarzać równoważne ilości białka jak systemy oparte na T7 przy 98% redukcji kosztów w porównaniu z podobnymi systemami komercyjnymi. ^4,5 Opisano przygotowanie i surowego ekstraktu komórkowego, jak również przeprowadzenie trzyprobówkowej reakcji TX-TL. Przygotowanie całego protokołu trwa pięć dni i daje wystarczającą ilość materiału do przeprowadzenia do 3000 pojedynczych reakcji w jednym preparacie. Po przygotowaniu każda reakcja trwa mniej niż 8 godzin od konfiguracji do zebrania i analizy danych. Mechanizmy regulacji i transkrypcji egzogenne dla E. coli, takie jak represory lak/tet i polimeraza RNA T7, mogą być uzupełniane. ⁶ Właściwości endogenne, takie jak tempo degradacji mRNA i DNA, można również dostosować. ⁷ Wykazano, że bezkomórkowy system ekspresji TX-TL umożliwia składanie obwodów na dużą skalę, badanie zjawisk biologicznych i ekspresję białek zarówno pod promotorami T7, jak i endogennymi. ^6,8 Dostępne są towarzyszące modele matematyczne. ^9,10 Powstały w ten sposób system ma unikalne zastosowania w biologii syntetycznej jako środowisko prototypowe lub "biomolekularna płytka prototypowa TX-TL".

Wprowadzenie

Technologia ekspresji bezkomórkowej rozpoczęła się w latach 50. jako czysto translacyjna, rozwijając się lata później, aby objąć sprzężone mechanizmy transkrypcji-translacji za pomocą DNA bakteriofaga T7. ^11,12 Od tego czasu podjęto liczne wysiłki w celu optymalizacji tworzenia surowego ekstraktu komórkowego (lub ekstraktu z E. coli S30). ^13,14 Optymalizacje te obejmują wydłużenie bezkomórkowej syntezy białek poprzez regenerację ATP lub modyfikacje szczepów oraz skrócenie czasu i kosztów protokołu. ^15-17 Istnieją alternatywne, bezkomórkowe systemy ekspresji, które wykorzystują do ekspresji odtworzone składniki zamiast surowego ekstraktu komórkowego. ⁵ Zarówno metody ekstrakcji z komórek surowych, jak i rekonstytucji zostały opracowane do użytku komercyjnego.

Wraz z pojawieniem się biologii syntetycznej, wzrasta zapotrzebowanie na dobrze scharakteryzowaną platformę do testowania i wyrażania zaprojektowanych modułów i obwodów biologicznych. ^18,19 Platforma ta musi być wszechstronna, dobrze scharakteryzowana, łatwa w obsłudze i skoncentrowana na komponentach dostarczanych przez użytkownika. Pomimo tego, że zostały opracowane pół wieku wcześniej, systemy bezkomórkowe oparte na E. coli z natury mają te same wymagania, ponieważ są uproszczoną reprezentacją procesów komórkowych in vitro bez złożoności wzrostu i metabolizmu. Ponadto cała podstawowa wiedza z badań in vivo nad E. coli ma zastosowanie do systemów bezkomórkowych E. coli.

Chociaż bezkomórkowe systemy ekspresji mogą mieć zastosowanie w biologii syntetycznej, do tej pory celem większości bezkomórkowych systemów ekspresji była maksymalizacja wydajności białek i metabolitów. Osiąga się to za pomocą transkrypcji bakteriofagów T7 sekwencji sterowanych przez promotory T7. ²⁰ Chociaż systemy te są skuteczne i solidne, służą one ściśle wyspecjalizowanym celom. Metody regulacji komórek są ograniczone, docelowe matryce DNA muszą zostać przeprojektowane tak, aby zawierały promotory T7, a niektóre sekwencje, takie jak kompleksy rybosomalne, nie mogą być transkrybowane i składane. ^21,22 Istniejące bezkomórkowe systemy ekspresji nie są w stanie utrzymać wysokiej wydajności przy jednoczesnym zachowaniu endogennych mechanizmów regulacyjnych, co jest uniwersalnością niezbędną w biologii syntetycznej.

Opracowaliśmy endogenny system ekspresji E. coli, który zachowuje skuteczność ekspresji białek wykazywaną przez poprzednie systemy, ale dodaje dodatkową wszechstronność, umożliwiając ekspresję i regulację opartą zarówno na endogennych, jak i egzogennych (T7 lub inne) mechanizmach. Opisany tutaj protokół jest pierwotnie oparty na Kigawa et al. (2004) i Liu et al. (2005), ale ma znaczące modyfikacje. Wykorzystuje glutaminian Mg i K zamiast octanu Mg i K w celu zwiększenia wydajności, usuwa 2-merkaptoetanol i lizuje komórki za pomocą ubijaka do kulek. ^17,23,24 Bicie koralików jest wybierane zamiast homogenizacji, metod opartych na ciśnieniu lub sonikacji ze względu na niższy koszt i porównywalną wydajność z konkurencyjnymi systemami. ²³ Kwas 3-fosfoglicerynowy (3-PGA) jest używany jako źródło energii, ponieważ stwierdzono, że daje wyższą wydajność białka w porównaniu z fosforanem kreatyny i fosfoenolopirogronianem. ^4,25 Nasz system może wyprodukować do 0,75 mg/ml białka reporterowego przy użyciu promotora opartego na sigma70 z operatorami lambda-fagowymi lub promotora sterowanego T7, podobnie jak w przypadku innych systemów komercyjnych. ^4,6 Do wyprodukowania wszystkich niezbędnych odczynników potrzeba pięciu dni (rysunek 1). Co więcej, zapewnia 98% redukcję kosztów w porównaniu z porównywalnymi komercyjnymi systemami bezkomórkowymi - koszty materiałów wynoszą 0,11 USD za 10 μl reakcji, które wzrastają do 0,26 USD z uwzględnieniem robocizny (ilustracja 2).

Protokół

1. Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego

Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego przez trzy dni wymaga dwóch osób do efektywnego przeprowadzenia. Protokół funkcjonalnie składa się z trzech części: wzrostu hodowli (krok 1.1 do kroku 1.11), lizy komórek (krok 1.12 do kroku 1.37) i klarowania ekstraktu (krok 1.38 do kroku 1.52). Dla wygody jest on podzielony na dni. Idealny ekstrakt może wytwarzać 0,75 mg / ml deGFP z plazmidu pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019) i ma stężenie surowego ekstraktu komórkowego między 27-30 mg / ml białka. ⁴ Właściwości ekstraktu różnią się jednak w zależności od partii. Poniższa receptura wystarcza na około 3 000 pojedynczych reakcji (6 ml surowego ekstraktu komórkowego). W przypadku skalowania w dół zaleca się użycie nie mniej niż 1/6 podanych tutaj wartości. Ze względu na ograniczenia czasowe skalowanie w górę nie jest zalecane.

Dzień 1

1. Przygotować pożywki do hodowli bakteryjnych, płytkę hodowlaną i suplementy pożywki zgodnie z opisem w Tabeli 1. Zobacz Materiał uzupełniający 1, aby zapoznać się z przepisami.
2. Szczep BL21-Rosetta2 należy przecisnąć od -80 °C do płytki agarowej 2xYT+P+Cm i inkubować przez co najmniej 15 godzin w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy kolonie będą łatwo widoczne. Uwaga: Chloramfenikol (Cm) służy do selekcji plazmidu kodującego rzadkie tRNA w szczepie BL21-Rosetta2.

Dzień 2

3. Przygotować i suplementy zgodnie z opisem w tabeli 2. Zobacz Materiał uzupełniający 1, aby zapoznać się z przepisami.
4. Przygotuj i wysterylizuj materiały wymagane na dzień 3, w tym: 6 x 4 L kolby Erlenmeyera z pokrywą z folii aluminiowej (autoklawowane), 4 x 1 L sterylne butelki wirówkowe, lejek (autoklawowany), 100 g szklanych kulek 0,1 mm (autoklawowanych), 2 mieszadła (autoklawowane), 1 L i 500 ml cylinder miarowy (autoklawowany), 2 x zlewki 1 L (autoklawowane), 3 ml strzykawka z igłami 18 G (sterylna), 2-3 boje pływakowe, 2-3 kasety dializacyjne 10k MWCO (sterylne), kuwety.
5. Przygotuj mini-kulturę 1. Dodać 4 ml pożywki 2xYT+P i 4 μl Cm do sterylnej probówki hodowlanej o pojemności 12 ml i podgrzewać do temperatury 37 °C przez 30 minut.
6. Zaszczepić mini-kulturę 1 kolonią z płytki agarowej 2xYT+P+Cm. Inkubować przy 220 obr./min, 37 °C przez 8 godzin.
7. 7 godzin i 30 minut później przygotuj mini-kulturę 2. Dodać 50 ml pożywki 2xYT+P i 50 μl Cm do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml i podgrzewać do temperatury 37 °C przez 30 minut.
8. Zaszczepić minikulturę 2 100 μl minikultury 1 i inkubować w temperaturze 220 obr./min, 37 °C przez 8 godzin.

Dzień 3

9. Zważyć cztery puste sterylne probówki Falcon o pojemności 50 ml i zanotować masę w tabeli 3. Schłodzić rurki Falcon na lodzie; Zostaną one następnie wykorzystane w kroku 1.18.
10. 7 godzin i 30 minut po kroku 1.8 przygotować końcowe podłoże do hodowli bakterii. Używając sterylnego cylindra z podziałką o pojemności 1 l, przenieś 660 ml pożywki 2xYT+P do każdej z sześciu 4-litrowych kolb Erlenmeyera i podgrzej do temperatury 37 °C przez 30 minut. Uwaga: Do prawidłowego napowietrzenia zaleca się 4 litry lub większe kolby Erlenmeyera.
11. Dodać 6,6 ml minikultury 2 do każdej 4 l kolby Erlenmeyera. Inkubować przy 220 obr./min, 37 °C, aż kultura osiągnie OD 1,5-2,0 przy 600 nm (co odpowiada środkowej fazie wzrostu). Okresowo sprawdzaj OD za pomocą rozcieńczenia kultury 1:10 w celu uzyskania dokładności. Ten krok powinien zająć nie więcej niż 3 godziny - 3 godziny 45 minut; szybki wzrost i zbiór w środkowej fazie logarytmicznej ma kluczowe znaczenie dla jakości ekstraktu.
12. Natychmiast po wzroście przenieść wszystkie kultury równomiernie do czterech 1-litrowych butelek wirówkowych i odwirować przy 5000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek bakteryjnych.
13. Podczas wirowania należy uzupełnić przygotowanie buforu S30A, dodając 4 ml 1 M DTT do 2 L wcześniej przygotowanego S30A. Wymieszaj i utrzymuj bufor na lodzie.
14. Po zakończeniu wirowania całkowicie usunąć supernatant z kroku 1.12, dekantując i osuszając butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.
15. Dodać 200 ml buforu S30A w temperaturze 4 °C do każdej z czterech butelek wirówki i energicznie wstrząsać butelkami, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu bez pozostałych grudek. Odwirować cztery butelki o stężeniu 5 000 g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
16. Całkowicie usuń supernatant z poprzedniego kroku, dekantując i osuszając butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.
17. Powtórz kroki 1.15 i 1.16.
18. Dodać 40 ml buforu S30A o temperaturze 4 °C do każdej butelki wirówki. Przenieś każdą kombinację granulek i S30A do schłodzonej probówki Falcon z 1,9). Uwaga: Ten krok polega na przeniesieniu granulek do mniejszego pojemnika.
19. Odwirować probówki Falcona o masie 2 000 g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez dekantację.
20. Ponownie odwirować probówki Falcon o masie 2 000 g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć resztki supernatantu za pomocą pipety. Trzymaj na lodzie.
21. Zważyć cztery probówki Falcona z osadem i zapisać masę w tabeli 3. Obliczyć masę granulki, potrzebną objętość bufora S30A i potrzebną masę kulek na podstawie konkretnych wzorów w tabeli 3.
22. Prawidłowe ładowanie i ubijanie granulatu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości ekstraktu i jest najtrudniejszym krokiem. Zaleca się przejrzenie filmu przed próbą. Nieunikanie pęcherzyków powietrza i równomierne rozprowadzanie kulek spowoduje nieefektywną ekstrakcję.
23. Dodać ilość buforu S30A obliczoną w tabeli 3 do każdej probówki Falcona, wirować aż do uzyskania jednorodności i powrócić do lodu.
24. Trzymając pozostałe rurki Falcon na lodzie, dodawaj koraliki z przerwami do pojedynczej rurki Falcon w trzech porcjach, z których każda wykorzystuje 1/3 wszystkich kulek. Po dodaniu każdej porcji kulek, wiruj przez 30 sekund. Umieść rurkę Falcona na lodzie między stopniami wiru i po końcowym wirze. Po dodaniu ostatniej porcji upewnij się, że koraliki są równomiernie rozłożone. Należy uformować gęstą pastę.
25. Przygotuj końcówkę do pipety o pojemności 5 ml (objętość), odcinając koniec za pomocą sterylnej żyletki, aby uzyskać otwór o średnicy 3-4 mm. Ustawić pipetę na 2 ml. Uwaga: Różne zestawy pipet i końcówki zapewniają różne ilości ssania, które mogą być niewystarczające do wyciągnięcia i uwolnienia gęstego roztworu kulawego; zamiast tego można użyć końcówki do pipety o pojemności 1 ml z usuniętym końcem.
26. Umieść 20 rurek do ubijania koralików na lodzie.
27. Sprawdź wysoką lepkość roztworu kulki komórkowej za pomocą zmodyfikowanej pipety. Pipeta powinna być lepka do tego stopnia, aby ledwo wychodziła z końcówki pipety podczas wysuwania. Jeśli jest zbyt lepka, ponownie wyreguluj końcówkę pipety zgodnie z krokiem 1.25. Jeśli nie są wystarczająco lepkie, kulki można dodawać w przyrostach (masa granulek * 0,05), do maksymalnej masy (masa granulek * 5,1). Po każdym dodaniu kulek wiruj przez 30 sekund i wróć do lodu. Patrz rysunek 3a, aby zapoznać się z demonstracją lepkości.
28. Usunąć roztwór komórek perełkowych z probówki Falcon za pomocą zmodyfikowanej pipety i przenieść do sterylnej probówki do ubijania kulek, wypełniając ją do trzech czwartych roztworem komórek koralikowych. Wiruj bardzo krótko (1 s) na mini-wirówce licznikowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza bez redystrybucji kulek. Patrz rysunki 3b-d, aby zobaczyć nieruchome obrazy obciążenia rurki do bicia koralików.
29. Zakończ dodawanie roztworu komórek koralików, aby utworzyć wklęsłą menisk.
30. Dodaj bardzo małą kroplę roztworu komórek kulki na wewnętrzną stronę nasadki rurki do ubijania koralików, uważając, aby nie zasłaniać zewnętrznej krawędzi nasadki; w przeciwnym razie rurka do ubijania koralików nie zamknie się wystarczająco. Postukaj nakrętką o płaską powierzchnię i sprawdź, czy na spodzie nakrętki nie ma pęcherzyków powietrza.
31. Zakryj rurkę do ubijania koralików nasadką do ubijania koralików z poprzedniego kroku. Ręka do asystenta do bicia koralików. Jeśli zrobisz to prawidłowo, nakrętka powinna być szczelnie zamknięta, żadne pęcherzyki powietrza nie powinny być widoczne, a niewielka (jeśli w ogóle) roztworu komórek perełkowych powinna się przelać. Ponów proces ładowania, jeśli widoczne są pęcherzyki powietrza lub nasadka nie zamyka się całkowicie.
32. Rurkę Vortex Falcon z kroku 1.24 z pozostałym roztworem komórek koralikowych, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kulek. Powtarzaj kroki od 1.28 do 1.31, aż rurka Falcon będzie pusta; następnie powtórz kroki od 1.24 do 1.31 dla każdej dodatkowej rurki Falcon.
33. Wykonaj jednocześnie kroki od 1.33 do 1.38. Poproś asystenta, aby wziął napełnione rurki do ubijania koralików od 1.31 i umieścił je na lodzie. Po zebraniu dwóch wypełnionych rurek do ubijania koralików i przebywaniu na lodzie przez co najmniej jedną minutę, rozpocznij ubijanie koralików.
34. Ubijaj jedną rurkę przez 30 sekund przy 46 obr./min. Połóż do góry nogami na lodzie na 30 sekund, ubijając drugą rurkę.
35. Powtórz poprzedni krok tak, aby każda napełniona rurka do ubijania koralików była ubijana łącznie przez 1 minutę.
36. Powtarzaj kroki od 1.33 do 1.35, aż 8 napełnionych probówek do ubijania kulek (lub maksymalna ilość, jaką może pomieścić wirówka) zostanie przetworzonych. Następnie należy skonstruować aparaturę filtrującą z 15 ml Falcona (ryc. 3e). Dodaj nową nasadkę do ubijania koralików, płaską częścią skierowaną do góry, na spód 15 ml Falcona. Następnie zdejmij nakrętkę z przetworzonej rurki do ubijania kulek i mocno dociśnij kolumnę mikrochromatograficzną do końca przetworzonej rurki do ubijania kulek, aż do całkowitego uszczelnienia. Oderwij koniec elucji kolumny mikrochromatograficznej i umieść kolumnę mikrochromatograficzną, końcem elucyjnym do dołu, w pustej probówce z perełkami. Umieść ten kompleks w 15 ml Falcon. Powtórz tę czynność dla wszystkich 8 wypełnionych rurek do ubijania koralików; Trzymaj na lodzie po zakończeniu.
37. Odwirować 8 aparatów filtracyjnych, probówka Falcon bez korka, przy 6 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia ekstraktu i osadu od kulek.
38. Sprawdź, czy każda rurka do ubijania koralików wytworzyła żywotny ekstrakt. Odpowiednio ubity ekstrakt nie będzie mętny, a granulat będzie miał dwie wyraźne warstwy. Wyrzuć wszystkie mętne probówki i przenieś supernatant z probówek niemętnych do pojedynczych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,75 ml, pobierając jak najmniej granulek. Trzymaj na lodzie, aż wszystkie rurki do ubijania koralików zostaną przetworzone. Patrz rysunek 3f, porównując prawidłowo i nieprawidłowo przetworzoną rurkę do ubijania koralików.
39. Odwirować probówki mikrowirówek z poprzedniego etapu przy 12 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
40. Przenieść supernatant bez granulek do pustych probówek do ubijania kulek za pomocą pipety, konsolidując 500 μl w nowej probówce do ubijania kulek.
41. Inkubować poprzedni etap, ze zdjętymi nasadkami do ubijania kulek, przy 220 obr./min, w temperaturze 37 °C przez 80 minut. Ten etap trawi pozostałe kwasy nukleinowe przy użyciu endogennych egzonukleaz uwalnianych podczas procesu perełkowania kulek i można go wykonać, umieszczając rurkę do ubijania kulek w probówce do hodowli tkankowej.
42. Przygotuj materiały do dializy. Kompletne przygotowanie buforu S30B poprzez dodanie 2 ml 1 M DTT do 2 L wcześniej przygotowanego S30B. Wymieszać i dodać 900 ml do każdej z dwóch sterylnych zlewek o pojemności 1 l. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do każdej zlewki; przechowywać w temperaturze 4 °C.
43. Po kroku 1.41 ekstrakt powinien wyglądać na mętny. Skonsolidować ekstrakt w 1,5 ml podwielokrotności w 1,75 ml probówkach do mikrowirówek i odwirować przy 12000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
44. Za pomocą pipety skonsolidować bezosadowy supernatant w 15 ml probówkach Falcon na lodzie i dobrze wymieszać, zamykając probówkę i odwracając. Zaoszczędź 10 μl supernatantu na lodzie dla kroku 1.47.
45. Określ całkowitą ilość wyprodukowanego ekstraktu i uwodnij niezbędną liczbę 10 tys. kaset dializacyjnych MWCO, zanurzając w S30B na 2 minuty, przyjmując 2,5 ml ekstraktu na kasetę.
46. Załaduj kasety 2,5 ml ekstraktu. Każda zlewka może pomieścić do 2 kaset; Dializować, mieszając, w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Uwaga: dopuszczalne jest częściowe ładowanie kaset. Dializa zwiększa wydajność produkcji białka.
47. W poprzednim kroku scharakteryzuj stężenie białka ekstraktu za pomocą testu Bradforda, używając ekstraktu zapisanego w kroku 1.44. Szczegółowe informacje można znaleźć w Materiałach Uzupełniających 2.
48. Po zakończeniu dializy podwielokrotny ekstrakt w ilości 1,5 ml do probówek mikrowirówek o pojemności 1,75 ml. Wirować przy 12 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie rurki utworzy się granulka.
49. Skonsolidować klarowny supernatant z poprzedniego etapu, pipetując do 15 ml probówki Falcon na lodzie. Homogenizować, odwracając 5-10x.
50. Na podstawie stężenia określonego przez Bradforda w kroku 1.47 określić ilość ekstraktu do porcji do poszczególnych probówek o pojemności 1,75 ml. Każda pojedyncza tubka powinna mieć objętość zawierającą 810-900 mg białka ogółem. Ekstrakt powinien mieć całkowite stężenie białka większe niż 27 mg/ml. Ten krok wymaga pomocy w szybkim przeprowadzeniu. Uwaga: Podwielokrotny ekstrakt poniżej 30 mg/ml na 30 μl podwielokrotności i skalować, jeśli stężenie jest wyższe; na przykład podwielokrotny ekstrakt w ilości 28 mg/ml na 30 μl, a podwielokrotny ekstrakt w ilości 32 mg/ml na 28,1 μl.
51. Podwielokrotność ekstraktu należy sporządzić zgodnie z krokiem 1.50, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Ekstrakt z szybkiego zamrażania w ciekłym azocie. Uwaga: Podwielokrotności z pęcherzykami można usunąć przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C.
52. Wyjąć probówki z ciekłego azotu za pomocą sitka i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C. Bezpieczeństwo: Nosić okulary ochronne; nakrętki probówek z ekstraktem mogą odpaść z powodu różnicy temperatur między ciekłym azotem a temperaturą pokojową.

2. Przygotowanie roztworu aminokwasów

Roztwór aminokwasów powinien być przygotowany w dużych ilościach. Poniższa receptura wykorzystuje jeden pełny zestaw RTS Amino Acid Sampler, dostarczając wystarczającą ilość na około 11 000 pojedynczych reakcji. W przypadku zmniejszania skali zaleca się użycie nie mniej niż połowy zestawu. Każdy aminokwas w zapasie jest dostarczany w ilości 1,5 ml 168 mM, z wyjątkiem leucyny w ilości 140 mM. Ostateczny skład roztworu aminokwasów to: leucyna, 5 mM, wszystkie inne aminokwasy, 6 mM. Jest to 4x stężenie robocze.

1. Usuń wszystkie 20 aminokwasów z -20 °C i rozmroź w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu wirować, aż aminokwasy się rozpuszczą, w razie potrzeby inkubując w temperaturze 37 °C. Po rozpuszczeniu aminokwasów umieść wszystkie aminokwasy na lodzie z wyjątkiem Asn, Phe i Cys, które są przechowywane w temperaturze pokojowej. Cys może nie rozpuścić się całkowicie.
2. Na lodzie dodaj 12 ml sterylnej wody do sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
3. Dodać 1,5 ml każdego aminokwasu w następującej kolejności, uważając, aby po każdym dodaniu zawirować probówkę Falcona i utrzymać roztwór na lodzie: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys może być dodawany jako zawiesina. Po dodaniu mieszać do momentu, aż roztwór będzie stosunkowo klarowny, inkubując w temperaturze 37 °C, jeśli to konieczne. Cys może nie rozpuścić się całkowicie.
4. Podwielokrotny roztwór aminokwasów rozlać na lód do 50 probówek po 26 μl każda. Resztę podzielić na lód w ilości 500 μl na probówkę. Porcje o objętości 26 μl zostaną użyte do kalibracji ekstraktu, natomiast podwielokrotności o objętości 500 μl zostaną użyte do przygotowania buforu. Podczas porcjowania należy często wirować główny zapas, aby uniknąć nierównomiernego rozprowadzenia zawiesiny.
5. Błyskawiczne zamrożenie porcji w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Bezpieczeństwo: Nosić okulary ochronne; nakrętki probówek z ekstraktem mogą odpaść z powodu różnicy temperatur między ciekłym azotem a temperaturą pokojową.
6. Opcjonalnie: Przeprowadź test aktywności nowo przygotowanego roztworu aminokwasów w porównaniu z wcześniej przygotowanymi roztworami aminokwasów.

3. Przygotowanie roztworu energetycznego

Roztwór energetyczny jest używany zarówno do kalibracji surowego ekstraktu komórkowego, jak i do tworzenia bufora, i powinien być przygotowywany w ilościach hurtowych. Poniższy przepis wystarcza na około 10000 pojedynczych reakcji. W przypadku skalowania w dół zaleca się użycie nie mniej niż 1/24 podanych tutaj wartości. Ponieważ rozwiązanie energetyczne wiąże się ze znacznym kosztem pieniężnym, początkujący użytkownicy mogą chcieć przygotować się w skali 1/24. Ostateczny skład Energy Solution to: HEPES pH 8 700 mM, ATP 21 mM, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, tRNA 2,8 mg/ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mM, kwas folinowy 0,95 mM, Spermidyna 14 mM, 3-PGA 420 mM. Jest to 14-krotne stężenie robocze. W razie potrzeby każdy pojedynczy element w tabeli 4 może być przechowywany w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

1. Usuń wszystkie chemikalia z Tabeli 4 z -80 °C, -20 °C lub 4 °C do temperatury pokojowej na 30 minut.
2. Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z opisem w Tabeli 4. Zobacz Materiał uzupełniający 1, aby zapoznać się z przepisami. Po przygotowaniu umieść wszystkie roztwory na lodzie.
3. Do 15 ml probówki Falcon dodać w następującej kolejności, uważając, aby po każdym dodaniu zawirować probówkę Falcon i utrzymać roztwory na lodzie: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 μl wody, 1,39 ml mieszaniny nukleotydów, 576 μl 50 mg/ml tRNA, 576 μl 65 mM CoA, 276 μl 175 mM NAD, 170 μl 650 mM cAMP, 288 μl 33,9 mM kwasu folinowego, 144 μl 1 M spermidyny i 3,09 ml 1,4 M 3-PGA.
4. Podwielokrotność roztworu energetycznego rozdzielić na 50 probówek po 7 μl każda na lodzie. Resztę podzielić w ilości 150 μl na probówkę na lodzie. Porcje o objętości 7 μl zostaną użyte do kalibracji ekstraktu, natomiast podwielokrotności o objętości 150 μl zostaną użyte do przygotowania buforu. Podczas porcjowania często wiruj główny zapas.
5. Błyskawiczne zamrożenie porcji w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Bezpieczeństwo: Nosić okulary ochronne; nakrętki probówek z ekstraktem mogą odpaść z powodu różnicy temperatur między ciekłym azotem a temperaturą pokojową.
6. Opcjonalnie: Przeprowadź test działania nowo utworzonego rozwiązania energetycznego w porównaniu z poprzednio wykonanymi rozwiązaniami energetycznymi.

4. Przygotowanie bufora

Przygotowanie bufora wymaga ukończenia przygotowania surowego ekstraktu komórkowego, przygotowania roztworu aminokwasów i przygotowania roztworu energetycznego. Każdy bufor jest unikalny dla partii surowego ekstraktu komórkowego. Mg-glutaminian, K-glutaminian i DTT (w tej kolejności) są zoptymalizowane w tej sekcji w celu wywołania reakcji o maksymalnych poziomach ekspresji. Poniższy protokół wykorzystuje wstępnie napisany szablon TXTL_e(szablon)_calibration_JoVE.xlsx (Materiał uzupełniający 3), do kalibracji wstępnie przygotowanego surowego ekstraktu komórkowego i przygotowania buforu. Można jednak również skalibrować surowy ekstrakt komórkowy i przygotować bufor bez matrycy, optymalizując ręcznie Mg-glutaminian, K-glutaminian i DTT oraz ustawiając bufor tak, aby wraz z ekstraktem stanowił 75% całkowitej objętości reakcji. W przypadku kalibracji ręcznej końcowe warunki reakcji można znaleźć w kroku 5.

1. Wypełnij formularz "Dane ogólne".
2. Rozmrażać na lodzie 100 mM Mg-glutaminianu (4 °C), 3 M K-glutaminianu (4 °C), 6 mM roztworu aminokwasów (26 μl, -80 °C), roztworu energetycznego (7 μl, -80 °C), 100 mM DTT (-20 °C), DNA kontroli pozytywnej (-20 °C), 40% PEG-8000 (4 °C), ekstrakt z komórek surowych (-80 °C), i wodą (4 °C). Uwaga: Do kontroli pozytywnej (wzbudzenie 485 nm, emisja 525 nm) należy użyć stężenia roboczego 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (plazmid Addgene 40019) lub innego odniesienia, które wytwarza sygnał o wysokim natężeniu.⁴
3. Przygotuj siedem reakcji o objętości 10,5 μl, testując zakres 4-10 mM dodatkowego Mg-glutaminianu, rozdzielając określone ilości podstawowego Mg-glutaminianu do poszczególnych probówek do mikrowirówek. Uwaga: Chociaż początkowo przygotowuje się reakcje 10,5 μl, końcowa reakcja wynosi 10 μl.
4. Przygotuj mieszankę wzorcową, jak wskazano w szablonie w sekcji "Kalibracja Mg-glutaminianu", dodając dodatkowe 80 mM K-glutaminianu. Trzymaj na lodzie i wiruj po dodaniu każdego przedmiotu. Uwaga: Wartości podane tutaj i w szablonie są dodatkiem do ilości Mg-glutaminianu, K-glutaminianu i DTT obecnych w buforze S30B używanym do produkcji surowego ekstraktu komórkowego.
5. Dodać mieszankę wzorcową do próbek zawierających Mg-glutaminian i przygotować reakcje. Zobacz kroki od 5.10 do 5.13, aby uzyskać szczegółowe instrukcje.
6. Przeprowadzić reakcję w temperaturze 29 °C, w inkubatorze lub czytniku płytek.
7. Określ optymalne stężenie glutaminianu Mg na podstawie końcowego poziomu ekspresji i maksymalnej szybkości ekspresji białka (ryc. 4a). Uwaga: Czas działania różni się w zależności od eksperymentu, ale zwykle trwa krócej niż 8 godzin.
8. Powtórz kroki od 4.2 do 4.7 dla K-glutaminianu w sekcji "Kalibracja K-glutaminianu", ustawiając poziomy Mg-glutaminianu na te znalezione w kroku 4.7.
9. Powtórz kroki od 4.2 do 4.7 dla DTT w sekcji "Kalibracja DTT", ustawiając poziomy Mg-glutaminianu na poziomy znalezione w kroku 4.7 i poziomy K-glutaminianu na te znalezione w kroku 4.8. Uwaga: Odkryliśmy, że dodana naziemna telewizja cyfrowa nie wpływa znacząco na poziomy wyrażeń końcowych.
10. Użyj wartości znalezionych podczas kalibracji w sekcji "Skład buforu", aby określić skład buforu, który ma być przygotowany. Na podstawie ilości wyprodukowanego surowego ekstraktu komórkowego tworzy się recepturę mieszanki wzorcowej dla określonej ilości.
11. Rozmrozić podwielokrotności zgodnie z przepisem na mieszankę główną na lodzie. Po rozmrożeniu przygotuj mieszankę główną, trzymając na lodzie i wirując po dodaniu każdej sztuki.
12. Podwielokrotność według ilości podanej w pozycji "Skład bufora". Probówki buforowe do błyskawicznego zamrażania w ciekłym azocie. Podczas porcjowania często wiruj główny zapas.
13. Wyjąć probówki z ciekłego azotu za pomocą sitka i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C. Bezpieczeństwo: Nosić okulary ochronne; nakrętki probówek z ekstraktem mogą odpaść z powodu różnicy temperatur między ciekłym azotem a temperaturą pokojową.

5. Eksperymentalne przeprowadzenie reakcji TX-TL

Końcowe warunki reakcji to: 8,9-9,9 mg/ml białka (z surowego ekstraktu), 4,5 mM-10,5 mM Mg-glutaminianu, 40-160 mM K-glutaminianu, 0,33-3,33 mM DTT, 1,5 mM każdy aminokwas z wyjątkiem leucyny, 1,25 mM leucyna, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP i GTP, 0,9 mM CTP i UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM kwas folinowy, 1 mM spermidyna, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000. Podstawowa reakcja TX-TL składa się z 3 części (probówek): surowego ekstraktu komórkowego, buforu i DNA. Stosunek wynosi: 75% buforu i ekstraktu, 25% DNA. Reakcje mogą różnić się objętością, a my używamy 10 μl zgodnie z konwencją, aby zminimalizować objętość reakcji i umożliwić pracę na płytce 384-dołkowej. Większe objętości wymagają mieszania w celu prawidłowego natlenienia. Poniższy protokół wykorzystuje wcześniej napisany szablon TXTL_JoVE.xlsx (Materiał uzupełniający 4) do przeprowadzenia reakcji o objętości 10 μl. Elementy w kolorze fioletowym oznaczają wartości wprowadzone przez użytkownika, a elementy w kolorze niebieskim wskazują dodatkowe odczynniki, które należy dodać do reakcji. Można jednak również przeprowadzić reakcję bez szablonu, postępując zgodnie z warunkami reakcji opisanymi powyżej.

1. Wypełnij formularz "Dane ogólne".
2. W polu "Master Mix Preparation" wstaw wartość procentową ekstraktu z kroku 4.1 w fioletowym polu.
3. Zaprojektuj swój eksperyment in silico, korzystając z sekcji "Przygotowanie mieszanki głównej" (rzędy 10-17) i "Przygotowanie DNA" (wiersze 19-50). Ogólnie rzecz biorąc, stałe można umieścić w sekcji "Przygotowanie mieszanki głównej", podczas gdy zmienne można umieścić w sekcji "Przygotowanie DNA". Zminimalizuj próbki na eksperyment, aby uniknąć parowania próbki i odchylenia czasu rozpoczęcia eksperymentu. Zobacz rysunek 6, aby zapoznać się z przykładową konfiguracją.
4. W polu "Master Mix Preparation" dodaj odczynniki, takie jak induktory lub białka, które trafią do wszystkich próbek w stałym stężeniu. Zaczynając od wiersza 14, wypełnij niebieskie zacienione obszary, zachowując jeden odczynnik w każdej linii. Jednostki są stosunkami względnymi.
5. W polu "Przygotowanie DNA" dodaj DNA, które będzie specyficzne dla próbki. Identyfikatory próbek #1 i #2 odpowiadają odpowiednio kontrolom pozytywnym i ujemnym. Identyfikatory próbek #3 i wyższe mogą być modyfikowane przez użytkownika dla DNA, stężenia podstawowego w ng / μl, długości w parach zasad, pożądanego stężenia końcowego w nM i powtórzeń (reakcji 10 μl). Ilość podstawowego DNA, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe, jest obliczana automatycznie. Suma w wierszu sumuje się do 10,5*n, gdzie n jest liczbą powtórzeń. Uwaga: Chociaż końcowa objętość reakcyjna wynosi 10 μl, w obliczeniach przyjmuje się, że całkowita objętość wynosi 10,5 μl na reakcję, aby uwzględnić objętość traconą podczas pipetowania.
6. W sekcji "Przygotowanie DNA" dodaj odczynniki lub dodatkowe DNA, które będą próbką specyficzną dla niebieskich kolumn. Podstawowe stężenia DNA w nM można obliczyć w sekcji "Przygotowanie DNA", podczas gdy odczynniki specyficzne dla próbki wymagają ręcznych obliczeń na podstawie całkowitej objętości reakcji 10,5*n. Wprowadzone objętości są odejmowane od objętości wody w tym samym rzędzie.
7. Usunąć potrzebną liczbę probówek z buforem, surowym ekstraktem komórkowym i kontrolą pozytywną w "Probówkach do rozmrażania" z temperatury -20 °C lub -80 °C i rozmrozić na lodzie.
8. Przygotuj próbki DNA. Dla każdego identyfikatora próbki należy podwielokrotnić wskazane DNA, wodę i elementy dostarczone przez użytkownika zgodnie z sekcją "Przygotowanie DNA" do probówki z mikrowirówką w temperaturze pokojowej. Uwaga: aby uniknąć utraty próbki, zaleca się stosowanie niedawno skalibrowanych pipet oraz końcówek do pipet o niskim przywieraniu oraz probówek do mikrowirówek.
9. Po rozmrożeniu probówek z kroku 5.7 przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z buforu, ekstraktu i wszelkich globalnych elementów dostarczonych przez użytkownika na podstawie pomarańczowych pudełek, trzymając na lodzie i wirując po dodaniu każdego elementu. Uwaga: Ekstrakt jest niezwykle lepki. Podwielokrotności z pęcherzykami można usunąć przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C.
10. Do każdej próbki DNA dodać ilość mieszanki wzorcowej wskazaną w pomarańczowych komórkach w rubryce "Przygotowanie DNA" (kolumna O) i przechowywać w temperaturze pokojowej. Potraktuj to jako czas rozpoczęcia reakcji.
11. Każdą próbkę należy zawirować i odwirować przy 10 000 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą próbkę i zredukować pęcherzyki.
12. W przypadku przeprowadzania reakcji w probówkach do mikrowirówek, inkubować bezpośrednio w temperaturze 29 °C. W przeciwnym razie należy pobrać pipetą 10 μl próbki na płytkę 384-dołkową. Uwaga: Reakcje w objętościach większych niż 10 μl mogą wymagać mieszania w celu natlenienia.
13. Odwirować płytkę o masie 4 000 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki próbki i zredukować pęcherzyki. Następnie uszczelnij płytę, aby zapobiec parowaniu.
14. Przeprowadzić reakcję w temperaturze 29 °C. Uwaga: Czas pracy różni się w zależności od eksperymentu, ale zwykle trwa poniżej 8 godzin.

Wyniki

Przedstawiliśmy pięciodniowy protokół przygotowania endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. Przykładowy harmonogram tworzenia odczynników - surowego ekstraktu komórkowego i buforu - można znaleźć na rysunku 1. Po utworzeniu można je przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku. Po utworzeniu odczynników konfiguracja i wykonanie eksperymentu mogą zostać wykonane w czasie krótszym niż 8 godzin.

Dodatkowo, zoptymalizowaliśmy warunki ekspresji systemu ekspresji TX-TL bez komórek. Inne dodatki dostarczone przez użytkownika, takie jak lub roztwory DNA, powinny być wcześniej skalibrowane pod kątem toksyczności. Na przykład różne metody przetwarzania plazmidów powodują różną ekspresję ze względu na zawartość soli. Przetestowaliśmy również wpływ buforu elucyjnego Tris-Cl na wydajność reakcji (ryc. 5).

Przykład kalibracji surowego ekstraktu komórkowego, odnoszący się do kroku 4.1 do 4.9, jest pokazany na rysunku 4a. Ogólnie rzecz biorąc, nasze eksperymenty pokazują, że surowy ekstrakt komórkowy jest najbardziej wrażliwy na poziom Mg-glutaminianu, a następnie na poziom K-glutaminianu. Aby zademonstrować bezkomórkowy system ekspresji, skonstruowaliśmy i przetestowaliśmy pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego opartą na represji tet. ²⁶ (Rysunek 6). W bezkomórkowym systemie ekspresji ten sam obwód przebiegający z aTc i bez niego wykazuje 7-krotną zmianę ekspresji w punkcie końcowym reportera deGFP po ośmiu godzinach ekspresji. Chociaż ten eksperyment nie wymaga globalnych induktorów ani represorów, w razie potrzeby można je dodać w sekcji "Przygotowanie mieszanki głównej".

Rysunek 1. Oś czasu dla surowego ekstraktu komórkowego, roztworu aminokwasów i przygotowania roztworu energetycznego. Pięciodniowy harmonogram typowego wykonania protokołu podano powyżej, zoptymalizowany pod kątem inkubacji w nocy i etapów pracy w ciągu dnia.

Rysunek 2. Analiza kosztów i ekspresji konkurencyjnych surowych ekstraktów komórkowych. a) Zestawienie kosztów robocizny i materiałów bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL. Na podstawie kosztów odczynników z grudnia 2012 r. i kosztów pracy w wysokości 14 USD za godzinę. b) Porównanie kosztów bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL z innymi systemami komercyjnymi. Koszty są podzielone na μl, chociaż objętości reakcji mogą się różnić w zależności od zestawu. c) Porównanie wydajności bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL z innymi systemami komercyjnymi. Wydajność ekspresji białka określona przez normy producenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Załadunek i obróbka rurki do ubijania koralików. a) Wykazanie prawidłowej lepkości roztworu kulki komórkowej. Roztwór kulki komórkowej będzie miał lepkość zależną od wielu czynników, w tym ilości dodanego bufora S30A, ilości dodanych kulek i czasu spędzonego na lodzie. b) Załadunek rurki do ubijania koralików przed szybkim odwirowaniem na stole. Wirowanie usuwa pęcherzyki nagromadzone podczas załadunku. c) Pęcherzyki wynurzające się po odwirowaniu na stole. Wielkość bąbelków będzie się różnić; Można je przebić lub usunąć za pomocą końcówki do pipety. d) Całkowicie wypełniona rurka do ubijania koralików przed zamknięciem. W rurce do ubijania koralików tworzy się menisk, a nasadka ma wystarczająco dużo, aby zakryć i spowodować przepełnienie niewielkich ilości. e) Prawidłowo załadowana aparatura filtrująca. Można je ponownie wykorzystać. f) Porównanie prawidłowo i nieprawidłowo przetworzonej rurki do bicia koralików. Rurka po lewej stronie to dobrze bita rurka - ma małą i dobrze zarysowaną górną warstwę oraz bardzo wyraźny supernatant. Rurka po prawej stronie jest nieoptymalna, oparta na większej, zamglonej drugiej warstwie i zamglonym supernatantze. Rury, które są nieoptymalne, nie powinny być poddawane dodatkowej obróbce.

Rysunek 4. Właściwości surowych preparatów ekstraktowych. a) Typowe wykresy kalibracyjne dla surowego ekstraktu komórkowego. Surowy ekstrakt jest kalibrowany pod kątem dodatkowych poziomów Mg-glutaminianu, K-glutaminianu i DTT, w tej kolejności. Pokazano fluorescencję punktu końcowego po 8 godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią kroczącą. Na podstawie tych wykresów dopuszczalny zakres dodatkowego Mg-glutaminianu wynosi 4 mM, K-glutaminianu wynosi 60-80 mM, a DTT wynosi 0-3 mM. Należy pamiętać, że każdy surowy ekstrakt musi być kalibrowany niezależnie dla tych trzech zmiennych. b) Odchylenie od preparatów ekstraktowych. Pokazano fluorescencję końcową dwóch surowych ekstraktów przygotowanych w różnych terminach; Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Wpływ roztworu DNA na wydajność ekspresji. a) Porównanie dwóch różnych metod oczyszczania plazmidów. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 przygotowuje się wyłącznie przy użyciu zestawu QiaPrep Spin Miniprep Kit (metoda oczyszczania 1) lub poddaje się obróbce końcowej za pomocą zestawu do oczyszczania QiaQuick PCR (metoda oczyszczania 2). Pokazano fluorescencję punktu końcowego po 8 godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią kroczącą. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od czterech niezależnych przebiegów w różnych dniach. b) Wpływ buforu elucyjnego (Tris-Cl). Różne stężenia Tris-Cl porównuje się w bezkomórkowej reakcji ekspresji opartej na ekspresji 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Podane stężenia są końcowymi stężeniami Tris-Cl w reakcji; zastosowany bufor elucyjny to 10 mM Tris-Cl. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 6. Przykładowy przebieg TX-TL pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. a) Przykładowy układ reakcji wykonawczej bez komórki. Testuje stan "włączony" i "wyłączony" pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, z kontrolą dodatnią i ujemną. b) Mapa plazmidowa pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. c) Reprezentatywne wyniki. Dane odzwierciedlają eksperyment w a) i b), z kontrolą ujemną odjętą od sygnału. Obwód genetyczny pokazany we wstawce. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

nazwa koncentracja kwota sterylizacja Notatki Chloramfenikol (cm) 34 mg/ml w etanolu Pojemność 1 ml Sterylizacja filtra (0,22 μM) Może być wytwarzany w większych ilościach przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Płytka agarowa 2xYT+P+Cm 31 g/L 2xYT, 40 mM fosforan potasu dwuzasadowy, 22 mM fosforan potasu jednozasadowy, 34 μg/ml chloramfenikolu 1 talerz autoklaw Nośniki 2xYT+P 31 g/L 2xYT, 40 mM fosforan potasu dwuzasadowy, 22 mM fosforan potasu jednozasadowy 4 L autoklaw

Tabela 1. Odczynniki do dnia 1 protokołu Crude Cell Extract.

nazwa koncentracja kwota sterylizacja Notatki Baza Tris 2 mln Pojemność 250 ml Filtracja, sterylizacja (0,22 μM) lub autoklaw Może być przechowywany w temperaturze pokojowej. Naziemna telewizja cyfrowa 1 mln Pojemność 6 ml Sterylizacja filtra (0,22 μM) Może być wytwarzany w większych ilościach i przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Bufor S30A 14 mM Mg-glutaminian, 60 mM K-glutaminian, 50 mM Tris, pH 7,7 2 L autoklaw Aby osiągnąć pH 7,7, miareczkować kwasem octowym. Dodaj DTT do 2 mM końcowego stężenia tuż przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Bufor S30B 14 mM Mg-glutaminian, 60 mM K-glutaminian, ~5 mM Tris, pH 8,2 2 L autoklaw Aby osiągnąć pH 8,2, miareczkować za pomocą 2M Tris. Dodaj DTT do 1 mM końcowego stężenia tuż przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 2. Odczynniki do dnia 2 protokołu Crude Cell Extract.

Sokół 1 cyfra arabska 3 4 Pusty 50 ml Sokół (g) 50 ml Sokół z granulką (g) Masa osadowa (50 ml Falcon z osadem - pusta 50 ml Falcon) (g) Objętość buforu S30A do dodania (masa osadu* 0,9) (ml) Całkowita masa kulek do dodania (masa granulki * 5,0) (g)

Tabela 3. Kalkulator masy buforu i kulki S30A dla 3 dnia protokołu Crude Cell Extract.

nazwa koncentracja kwota sterylizacja Notatki HEPESY 2 M, pH 8 Pojemność 4 ml żaden Aby osiągnąć pH 8, miareczkować za pomocą KOH. Mieszanka nukleotydów 156 mM ATP i GTP, 94 mM CTP i UTP, pH 7,5 Pojemność 1,5 ml żaden Aby osiągnąć pH 7,5, miareczkować za pomocą KOH. tRNA 50 mg/ml 600 μl żaden Certyfikat Autentyczności 65 mM 600 μl żaden NAD 175 mM, pH 7,5-8 300 μl żaden Aby osiągnąć pH 7,5-8, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M. obóz 650 mM, pH 8 200 μl żaden Aby osiągnąć pH 8, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M. Kwas folinowy 33,9 mM 300 μl żaden Chociaż potrzebne jest tylko 300 μl, przepis w uzupełnieniu jest na 1,15 ml. spermidyna 1 mln 150 μl żaden Przechowywać w temperaturze 4 °C, podgrzać do 37 °C do stopienia. 3-PGA (pol. 1,4 m, pH 7,5 3,2 ml żaden Aby osiągnąć pH 7,5, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M.

Tabela 4. Odczynniki do przygotowania do protokołu Rozwiązania Energetycznego.

Materiały uzupełniające 1. Przepisy na przedmioty.

Chloramfenikol, 34 mg/ml: Przygotuj 0,51 g chloramfenikolu i dodaj etanol do 15 ml. Filtruj sterylizuj (0,22 μM), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

2xYT+P+Cm płytka agarowa: Przygotuj 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,6 g agaru i wodę do 40 ml. Autoklaw. Ostudzić do temperatury 50 °C i dodać 40 μl cm. Porcję porcji 25 ml do szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i pozostawić do ostygnięcia na godzinę.

2xYT+P podłoża: Przygotuj 124 g 2xYT, 160 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @1 M, 88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, i wodę do 4 L. Podziel na 2 x 1,88 l i 0,24 l Autoklawu.

Tris base, 2 M: Przygotuj 60.57 g Tris base i wodę do 250 ml. Sterylizuj, przechowuj w RT do późniejszego wykorzystania.

DTT, 1 M: Przygotuj 2,31 g DTT i wodę do 15 ml. Sterylizuj filtrem (0,22 μM), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

Bufor S30A: Przygotuj 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, 50 ml Tris w 2M, kwas octowy (do pH 7,7) i wodę do 2 L. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 °C, dodać 4 ml 1 M DTT przed użyciem.

Bufor S30B: Przygotuj 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, Tris w 2 M (do pH 8,2) i wodę do 2 L. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 °C, dodać 2 ml 1 M DTT przed użyciem.

HEPES: Przygotuj 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (do pH 8) i wodę do 4 ml.

tRNA: Przygotuj 30 mg tRNA i wodę do 600 μl.

CoA: Przygotuj 30 mg CoA (MW 767.53) i wodę do 600 μl.

NAD: Dodaj 34.83 mg NAD (MW 663.43), Tris na 2 M (do pH 7.5-8) i wodę do 300 μl. (Dodaj 27 μl Tris na 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7.5-8).

cAMP: Dodaj 42,80 mg cAMP (MW 329,22), Tris w 2 M (do pH 8) i wodę do 200 μl. (Dodaj 73 μl Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 8).

Kwas folinowy (33,9 mM): Do 20 mg stałej soli wapniowej kwasu folinowego (MW 511,5), dodaj 1,15 ml wody.

Spermidyna: Przygotuj 23,55 μl spermidyny (MW 145,25) i wodę do 150 μl. Przygotuj w temperaturze pokojowej po krótkim stopieniu w temperaturze 37 °C.
3-PGA: Dodać 1,03 g 3-PGA (MW 230.02), Tris w 2 M (do pH 7,5) i wodę do 3,2 ml. (Dodać 1,73 ml Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5).

Mieszanka nukleotydów: Dodaj 145 mg dwuwodnej soli dipotasowej ATP (MW 619.4), 133 mg soli disodowej GTP (MW 567.14), 79.4 mg soli disodowej CTP dwuwodnej (MW 563.16), 82.6 mg dwuwodnej soli trisodowej UTP (MW 586.12), KOH w 15% rozcieńczeniu (do pH 7.5) i wodę do 1.5 ml. (Dodaj 353 μl KOH w 15% rozcieńczeniu, aby doprowadzić roztwór do pH 7.5).

Materiały uzupełniające 2. Test Bradforda.

1. Usunąć środek Bradford z 4 °C i ustawić w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować 50 μl wzorca BSA w stężeniach 1 mg/ml i 0,1 mg/ml.
3. Przygotować 40 μl 20x rozcieńczenia ekstraktu z kroku 1.47.
4. Dodaj 800 μl wody do 7 kuwet.
5. Przygotować kuwety wzorcowe na 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA).
6. Przygotować kuwety doświadczalne na 2 μl próbki i 4 μl próbki.
7. Dodać 200 μl środka Bradford do każdej kuwety i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
8. Uzyskać krzywą wzorcową przy średnicy zewnętrznej 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.5. Odrzucić krzywą wzorcową, jeżeli r² < 0,95.
9. Oznaczyć stężenie ekstraktu przy OD 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.6.

Materiał uzupełniający 3. Arkusz kalkulacyjny kalibracji bufora.

Zobacz TXTL_e(szablon)_calibration_JoVE.xlsx.

Materiały uzupełniające 4. Arkusz kalkulacyjny uruchamiania wyrażeń bez komórek.

Zobacz _JoVE.xlsx TXTL.

Dyskusja

Opisany tutaj endogenny bezkomórkowy system ekspresji TX-TL oparty na Escherichia coli jest łatwą do przeprowadzenia reakcją trójprobówkową, która może zająć mniej niż osiem godzin od konfiguracji do zebrania danych. Proces tworzenia wszystkich odczynników wymaga łącznie pięciu dni (przy znacznym nakładzie pracy tylko w jednym dniu), ale daje surowy ekstrakt na 3 000 reakcji i odczynniki buforowe na 10 000 reakcji (rysunek 1). Ponadto odczynniki do sporządzania ekstraktu surowego i buforu są stabilne przez co najmniej 1 rok w temperaturze -80 °C, co pozwala na wielokrotne stosowanie jednego preparatu. ⁴ Przy 0,11 USD za 10 μl reakcji (0,26 USD z robocizną) koszty są o 98% niższe niż w przypadku porównywalnych systemów komercyjnych (ilustracja 2).

Istnieją jednak pewne nierozwiązane ograniczenia systemu. Wydajność końcowa każdego preparatu z ekstraktu z komórek surowych może się różnić w zależności od biegłości użytkownika i warunków środowiskowych, chociaż typowa różnica w wydajności wynosi od 5 do 10% (rysunek 4b). W związku z tym należy spodziewać się zmienności między partiami zarówno w wyrażeniu punktu końcowego, jak i w dynamice wyrażenia. Różnice te prawdopodobnie utrzymają się, dopóki ekstrakt nie zostanie w pełni scharakteryzowany lub dopóki tworzenie ekstraktu nie zostanie w pełni zautomatyzowane. Jeśli bezkomórkowy system ekspresji jest używany do przeprowadzania czułych eksperymentów ilościowych, zaleca się przeprowadzenie wszystkich eksperymentów z tą samą partią surowego ekstraktu komórkowego. Wydajność z pojedynczej partii surowego ekstraktu komórkowego, około 3000 reakcji, powinna być wystarczająca dla typowych kursów eksperymentalnych. Chociaż podejrzewamy, że zmienność można usunąć poprzez zwiększenie skali i automatyzację procedury, takie próby wymagałyby znacznych inwestycji w zasoby.

Ponadto, chociaż poziomy ekspresji w punkcie końcowym są dość łatwe do określenia, należy wykonać więcej pracy w celu zrozumienia dynamiki nieodłącznie związanej z systemem bezkomórkowym. Wiadomo, że zarówno konkurencja o zasoby, jak i ograniczenie zasobów mogą wpływać na dynamikę wyrażeń. Na przykład ograniczona endogenna sigma 70 może powodować reżim nasycenia zwiększoną matrycą DNA, wytwarzając profil ekspresji analogiczny do profilu nukleotydu lub niedoboru aminokwasów. ^9,27 Jednak dynamika nie musi być w pełni zrozumiała, aby można było korzystać z systemu. W celu czystego wzrostu plonów optymalizację można przeprowadzić za pomocą podejść opartych na uczeniu maszynowym. ²⁸ Kwestie konkurencji i ograniczeń zasobów można rozwiązać za pomocą modeli matematycznych zweryfikowanych na podstawie danych eksperymentalnych.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany dla szczepu BL21-Rosetta2, ale można go uogólnić na inne szczepy E. coli . Modyfikacje w BL21-Rosetta2, takie jak usunięcie genu kodującego proteazę lon i dodanie genów kodujących rzadkie tRNA, pozwalają na maksymalną produkcję białka. Próbowaliśmy zastosować protokół z dwoma innymi szczepami ekstraktu - tylko BL21 i nokautem BL21 trxA - i znaleźliśmy o 50% mniejszą wydajność białka. Przypuszczamy, że plony podobnie spadają w przypadku stosowania innych szczepów. Inne zmiany parametrów, takie jak zamiana pożywki 2xYT na LB i inne bogate buliony, spowodowały zmniejszenie wydajności białka.

Bezkomórkowe systemy ekspresji, wykorzystujące zarówno endogenne, jak i egzogenne mechanizmy transkrypcyjno-translacyjne i mechanizmy regulacji, mają szerokie zastosowanie zarówno w ekspresji białek i metabolitów, jak i w biologii syntetycznej. ^Zamiast ograniczać się do obwodów regulowanych przez T7, można sobie wyobrazić wytwarzanie złożonych biomolekuł w warunkach kontrolowanych przez użytkownika przy użyciu mieszanki natywnych promotorów E. coli i egzogennych mechanizmów transkrypcji i regulacji. Bez ograniczeń podziału komórek i metabolizmu, zmienność w obwodach syntetycznych, takich jak represylator, lub w szlakach metabolicznych, takich jak te wytwarzające artemizyninę, może być zmniejszona lub lepiej poznana. ^30,31 Wykorzystaliśmy te zalety do wdrożenia przełączników genetycznych, a także do zrozumienia sekwestracji czynnika sigma. ^9,32 Taka technologia może również stanowić szkielet "minimalnych" lub "sztucznych" komórek - małych, dobrze scharakteryzowanych i samowystarczalnych ucieleśnionych jednostek ekstraktu. ^33,34 pkt.

Docelowo przewidujemy natychmiastowe zastosowanie tego endogennego, bezkomórkowego systemu ekspresji jako środowiska prototypowego dla biologii syntetycznej. Nazywany "biomolekularną płytką prototypową TX-TL", bezkomórkowy system ekspresji zapewnia kontrolowane środowisko, w którym syntetyczne obwody ostatecznie przeznaczone do ekspresji in vivo mogą przejść rundy prototypowania - cykle testowania na podstawowym plazmidzie, liniowym lub chemicznie syntetyzowanym DNA, po których następuje analiza i szybka modyfikacja. Rundy prototypowania mogą być wspomagane przez predykcyjne modele matematyczne, które są obecnie opracowywane. Usuwając klonowanie i manipulację in vivo dla obwodów niekońcowych, przewidujemy, że czas cyklu inżynieryjnego zostanie skrócony do 1-3 dni zamiast standardu z obecnych tygodni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2xYT	MP biomedyczne	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Bacto-agar	BD Diagnostyka	214010
Tubki do ubijania koralików (mikrofiolki polipropylenowe)	BioSpec	522S
Koraliki, średnica 0,1 mm.	BioSpec	11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli szczep	Novagen	71402
Zestaw do oznaczania białek Bradford BSA	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C1919
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
Złącze CTP	USB	14121
Kuwety, 1,5 ml	Fisher	14-955-127
Cyfrowa Umowa	Telekomunikacyjna Sigma-Aldrich	D0632
Kwas folinowy	Sigma-Aldrich	F7878
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
K-glutaminian	Sigma-Aldrich	G1149
Mg-glutaminian	Sigma-Aldrich	49605
Kolumny do chromatografii mikro biospinowej	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Denne płyty optyczne Nunc 384-well	Thermo-Scientific	142761
Taśma uszczelniająca Nunc	Thermo-Scientific	232701
PEG-8000	Promega	V3011
Fosforan potasu dwuzasadowy roztwór	Sigma-Aldrich	P8584
Fosforan potasu roztwór jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P8709
Próbnik aminokwasów RTS	5 Prime	2401530
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (zestaw)	Thermo-Scientific	66382
Spermidyna	Sigma-Aldrich	85558
Podstawa Tris	Fischer	BP1521
tRNA (z E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
Skrętka UTP	USB	23160
Butelka wirówki 1L	Beckman-Coulter	A98813	Jest to specyficzne dla serii Avanti J; Uzyskaj równoważny rozmiar dla wirówki w użyciu.
Kolba Erlenmeyera	4L Kimble Chase	26500-4000
Wirówka Avanti J-26XP	Beckman-Coulter	393127	odpowiednik wirówki o pojemności 1L.
Wytrząsarka orbitalna Forma 480	Thermo Scientific	480	Lub odpowiednik shakera 6x4L wielkości klatki piersiowej.
JLA-8.1000 Rotor	Beckman-Coulter	363688	Lub 1L, odpowiednik wirnika 5000 x g do wirówki.
Mini-Beadbeater-1	BioSpec	3110BX
Materiał uzupełniający 1. Przepisy na Items. Chloramfenikol, 34 mg/ml: Przygotować 0,51 g chloramfenikolu i dodać etanol do 15 ml. Sterylizacja filtra (0,22 μ M), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °; C do późniejszego wykorzystania. 2xYT+P+Cm płytka agarowa: Przygotuj 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,6 g agaru i wodę do 40 ml. Autoklaw. Ostudzić do 50 stopni; C i dodać 40 μ l Cm. Podwielokrotność 25 ml na szalkę Petriego o wymiarach 100x15 mm i pozostawić do ostygnięcia na godzinę. 2xYT+P podłoża: Przygotować 124 g 2xYT, 160 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @1 M, 88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M i wodę do 4 l. Podwielokrotność rozdzielić na 2x1,88 l i 0,24 l. Autoklaw. Baza Tris, 2 M: Przygotuj 60,57 g bazy Tris i wodę do 250 ml. Wysterylizować, przechowywać w temperaturze RT do późniejszego wykorzystania. DTT, 1 M: Przygotuj 2,31 g naziemnej telewizji cyfrowej i wodę do 15 ml. Sterylizacja filtra (0,22 μ M), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °; C do późniejszego wykorzystania. Bufor S30A: Przygotować 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, 50 ml Tris w 2M, kwasu octowego (do pH 7,7) i wody do 2 l. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, przed użyciem dodać 4 ml 1 M DTT. Bufor S30B: Przygotować 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, Tris w 2 M (do pH 8,2) i wodę do 2 l. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, dodać 2 ml 1 M DTT przed użyciem. HEPES: Przygotować 1,91 g HEPESU (MW 238,21), KOH (do pH 8) i wody do 4 ml. tRNA: Przygotuj 30 mg tRNA i wodę do 600 μl. CoA: Przygotować 30 mg CoA (MW 767.53) i wodę do 600 μl. NAD: Dodaj 34,83 mg NAD (MW 663,43), Tris w 2 M (do pH 7,5-8) i wodę do 300 μl. (Dodaj 27 μ l Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5-8). cAMP: Dodać 42,80 mg cAMP (MW 329,22), Tris w 2 M (do pH 8) i wodę do 200 μl. (Dodać 73 μ l Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 8). Kwas folinowy (33,9 mM): Do 20 mg stałej soli wapniowej kwasu folinowego (MW 511,5) dodać 1,15 ml wody. Spermidyna: Przygotuj 23,55 μ l spermidyny (MW 145,25) i wody do 150 μl. Przygotować w temperaturze pokojowej po krótkim stopieniu w temperaturze 37 °C. 3-PGA: Dodać 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris w 2 M (do pH 7,5) i wody do 3,2 ml. (Dodać 1,73 ml Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5). Mieszanka nukleotydów: Dodać 145 mg dwuwodnej soli dipotasowej ATP (MW 619,4), 133 mg soli disodowej GTP (MW 567,14), 79,4 mg dwuwodnej soli disodowej CTP (MW 563,16), 82,6 mg dwuwodnej soli trisodowej UTP (MW 586,12), KOH w 15% rozcieńczeniu (do pH 7,5) i wodę do 1,5 ml. (Dodać 353 μ l KOH w 15% rozcieńczeniu, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5). Materiał uzupełniający 2. Test Bradforda. Usuń agenta Bradforda z 4 ° C i ustawić w temperaturze pokojowej. Przygotuj 50 μ l Wzorzec BSA przy stężeniu 1 mg/ml i 0,1 mg/ml. Przygotuj 40 μ l 20-krotne rozcieńczenie ekstraktu z etapu 1.47. Dodać 800 μ l woda do 7 kuwet. Przygotować kuwety wzorcowe na 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μ l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μ l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μ l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μ l 1 mg/ml BSA). Przygotuj eksperymentalne kuwety dla 2 i mu; l próbki i 4 μ l próbki. Dodaj 200 μ Do każdej kuwety i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut Wytwórz standardową krzywą przy średnicy zewnętrznej 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.5. Odrzucić krzywą standardową, jeśli r2 < 0,95, Określić stężenie ekstraktu przy OD 595nm za pomocą kuwet z tep 6.6. Materiał uzupełniający 3. Arkusz kalkulacyjny kalibracji bufora. Zobacz TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Materiał uzupełniający 4. Arkusz kalkulacyjny z wyrażeniem bez komórek. Patrz TXTL _JoVE.xlsx.