Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Podsumowanie

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Streszczenie

In vivo ¹⁹F MRI umożliwia ilościowe śledzenie komórek bez użycia promieniowania jonizującego. Jest to nieinwazyjna technika, którą można zastosować u ludzi. W tym miejscu opisujemy ogólny protokół znakowania komórek, obrazowania i przetwarzania obrazu. Technika ta ma zastosowanie do różnych typów komórek i modeli zwierzęcych, chociaż tutaj skupiamy się na typowym mysim modelu do śledzenia mysich komórek odpornościowych. Opisano najważniejsze kwestie związane z etykietowaniem komórek, ponieważ są one istotne dla wszystkich modeli. Podobnie wymienione są kluczowe parametry obrazowania, chociaż szczegóły będą się różnić w zależności od systemu MRI i indywidualnej konfiguracji. Na koniec dołączamy protokół przetwarzania obrazu w celu oceny ilościowej. Warianty tej i innych części protokołu są oceniane w sekcji Dyskusja. W oparciu o szczegółową procedurę opisaną tutaj użytkownik będzie musiał dostosować protokół do każdego konkretnego typu komórki, etykiety komórki, modelu zwierzęcego i konfiguracji obrazowania. Należy pamiętać, że protokół może być również dostosowany do stosowania u ludzi, o ile spełnione są ograniczenia kliniczne.

Wprowadzenie

Śledzenie komórek in vivo jest niezbędne do optymalizacji i monitorowania terapii komórkowych¹. Ze względu na swój nieinwazyjny charakter, obrazowanie daje doskonałe możliwości monitorowania komórek in vivo. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) jest niezależne od promieniowania jonizującego i umożliwia uzyskanie doskonałej rozdzielczości obrazowania oraz wewnętrznego kontrastu tkanek miękkich. Śledzenie komórek na podstawie MRI zostało już wykorzystane klinicznie do śledzenia komórek dendrytycznych u pacjentów z czerniakiem². Konwencjonalny kliniczny rezonans magnetyczny przeprowadza się na jądrze ¹H, obecnym w ruchomej wodzie w tkankach. Możliwe jest również przeprowadzenie rezonansu magnetycznego na innych jądrach aktywnych, takich jak ¹³C, ¹⁹F i ²³Na. Jednak tylko ¹⁹F MRI został z powodzeniem zastosowany do śledzenia komórek in vivo, ponieważ oferuje najwyższą czułość po ¹godzinie. Brak wykrywalnego przez MRI endogennego ¹⁹F w tkankach pozwala na wysoką selektywność sygnału do wykrywania egzogennych środków kontrastowych ¹⁹F i umożliwia ilościowe określenie stężenia fluoru bezpośrednio na podstawie danych obrazowych. Szczegółowe omówienie ¹⁹F MRI znajduje się w^3-5. Kluczową kwestią związaną z ¹⁹F MRI jest potrzeba opracowania i optymalizacji odpowiednich etykiet dla komórek ¹⁹F, chociaż opracowano kilka etykiet, z tendencją do stosowania środków multimodalnych⁶.

Protokół, który tutaj opisujemy, jest oparty na badaniach przeprowadzonych przez nasze grupy^7-9, w tym na pierwszych artykułach, które opisywały in vivo ilościowe ^{śledzenie komórek 19}F MRI^{oparte na 10,11}. Ogólna procedura śledzenia komórek za pomocą ¹⁹F MRI jest podsumowana na rysunku 1. Opisujemy ogólny protokół znakowania i obrazowania komórek dendrytycznych (DC) przy użyciu specjalnie wykonanego środka kontrastowego z perfluorowęglowodoru⁸. Protokół obrazowania ma ogólne zastosowanie do różnych typów komórek, etykiet i modeli zwierzęcych. Opisany tutaj typ komórki i model zwierzęcy należy traktować jedynie jako przykład, dlatego nie podajemy szczegółów na temat izolacji i znakowania komórek, ale raczej skupiamy się na protokole obrazowania. Modyfikacje będą konieczne dla każdej etykiety, typu komórki, modelu zwierzęcego i konfiguracji obrazowania, a można je znaleźć w literaturze lub mogą wymagać optymalizacji przez naukowców. W dyskusji uwzględniono kilka typowych modyfikacji.

Protokół

Uwaga: Wszystkie eksperymenty i procedury z udziałem zwierząt muszą być przeprowadzane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi etycznymi i zgodnymi ze standardowymi wymaganiami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i humanitarnej.

1. Etykietowanie komórek (Standardowy protokół z Coincubation)

1. Dodać ¹⁹F etykieta⁸ do niedojrzałych DC w stężeniu 4 mg/10⁶ komórek (w 2 ml pożywki). Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.
2. Inkubować komórki z etykietą przez 3 dni przed dojrzewaniem i zbieraniem DC.
3. Zbierz kontrolery domeny i usuń nadmiar etykiety, myjąc co najmniej 3 razy w PBS. Policz komórki.
4. Zawiesić w małej objętości PBS do wstrzyknięcia lub dalszych badań.

Uwaga: Ten protokół jest odpowiedni dla tych konkretnych DC i etykiet. Procedura została zoptymalizowana w innej publikacji⁸ i zawiera tutaj tylko kroki przygotowania próbki do obrazu, ponieważ ten protokół koncentruje się na obrazowaniu. W związku z tym protokół izolacji, hodowli i znakowania określonego typu komórek będzie musiał zostać znaleziony w literaturze lub zoptymalizowany przez badacza. Podsumowanie wszystkich ^{pozostałych 19}oznaczeń F, które zostały użyte w literaturze, znajduje się w innym miejscu⁶.

2. Oznaczanie ¹⁹F/komórkę za pomocą ¹⁹F NMR

1. Umieść znaną liczbę znakowanych komórek (zwykle więcej niż 0,5 x 10⁶ lub liczbę, która daje wystarczający sygnał) w probówce NMR.
2. Dodać 10 μl 5% kwasu trifluorooctowego (TFA). Jeśli częstotliwość rezonansowa TFA jest nieodpowiednia ze względu na nakładanie się na etykietę, należy użyć alternatywnego związku rozpuszczalnego, najlepiej z pojedynczym rezonansem ¹⁹F.
3. Umieścić próbkę w spektrometrze NMR i uzyskać widmo ¹⁹F. Upewnij się, że przepustowość jest wystarczająca zarówno dla TFA (odwołania), jak i agenta.

Uwaga: TR powinien być wystarczająco długi, aby uzyskać pełne rozluźnienie odniesienia i obracanie próbki (około 5 razy czas relaksacji T₁ najdłuższego składnika T₁ w probówce, zazwyczaj TR ~5-8 sekund). Niektóre spektrometry wymagają D_2Odla sygnału blokady częstotliwości. Wystarczające jest standardowe widmo ¹⁹F. Szerokie uśrednianie lub wyższa liczba komórek będzie wymagana, jeśli pobieranie komórek przez etykietę jest słabe lub jeśli liczba komórek jest niska. Widmo powinno być wyśrodkowane między pikami odniesienia i odpowiednimi pikami oznaczonymi, chyba że dokonuje się korekt w celu uwzględnienia częściowego wzbudzenia.

4. Obliczyć względne obszary pod pikami odniesienia i próbki (lub głównego piku próbki), a następnie obliczyć średnią liczbę ¹⁹F/komórkę w próbce.

Uwaga: Cały proces musi być powtórzony i uśredniony na tyle obszernie, aby osiągnąć statystyczną istotność. Można to również zrobić za pomocą spektroskopii bezpośrednio na skanerze MRI. Należy jednak pamiętać, że ta procedura ujawnia tylko średnie obciążenie ¹⁹F dla dużej liczby komórek, a nie zmienność między komórkami. Sprawdzenie jednorodności wychwytu komórkowego wymaga obecności składnika fluorescencyjnego przy czynniku ¹⁹F, dzięki czemu wychwyt komórek może być analizowany za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej.

3. Rozważania dotyczące projektu eksperymentalnego - iniekcja komórkowa

Ze względu na stosunkowo słabą czułość ¹⁹F MRI do śledzenia komórek, model zwierzęcy, w którym komórki będą lokalizować się w dużej liczbie, jest niezbędny do udanego obrazowania in vivo. Typowe wartości czułości wahają się od 1 000 do 100 000 komórek/woksel/1 godzina skanowania⁶, przy obciążeniu komórek w zakresie 10^{11-10 13} atomów fluoru.

Liczba i częstotliwość sesji obrazowania musi być starannie zaplanowana, ponieważ wpływa to na wybór środka znieczulającego. Należy zauważyć, że izofluran może nie być odpowiedni do ¹⁹F MRI, jeśli częstotliwość rezonansowa ¹⁹F izofluranu jest zbliżona do częstotliwości zastosowanego związku znakowanego. Izofluran może być nadal odpowiedni, jeśli sesje obrazowania są wystarczająco krótkie, aby zapobiec znacznemu nagromadzeniu. W literaturze stosowano kilka alternatywnych środków znieczulających^10,11; Przykład znajduje się w protokole obrazowania. Znieczulenie może wymagać optymalizacji dla różnych szczepów myszy i modeli chorób.

4. Projektowanie zewnętrznego odniesienia ¹⁹F

1. Do oznaczania ilościowego¹² należy użyć zewnętrznego odniesienia zawierającego znaną ilość sygnału ¹⁹F. Wybierz natężenie sygnału odniesienia, aby było w przybliżeniu porównywalne z natężeniem oczekiwanym od obiektu.

Uwaga: Generalnie, najprościej jest, jeśli związek odniesienia jest taki sam jak etykieta komórki, aby dopasować parametry relaksacji. Jeśli stosuje się sekwencje spektroskopowe lub sekwencje bez lokalizacji przestrzennej, może być konieczne zastosowanie związku o innym przesunięciu chemicznym.

2. W razie potrzeby zmodyfikuj położenie, rozmiar i kształt odniesienia, w zależności od obszaru zainteresowania (ROI). Uwaga: Generalnie najłatwiej jest użyć rur o jednolitym przekroju jako odniesienia.

5. Obrazowanie i przygotowanie myszy

1. Rozcieńczyć dostępną w handlu ketaminę i ksylazynę w stosunku 1:10 v/v solą fizjologiczną, aby otrzymać roztwory podstawowe 10 mg/ml ketaminy i 2 mg/ml ksylazyny.
2. Włącz system ogrzewania w skanerze (zazwyczaj ciepłe powietrze), aby upewnić się, że otwór będzie ciepły przed obrazowaniem myszy.
3. Wstrzyknąć dootrzewnowo 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny w celu rozpoczęcia znieczulenia. Uwaga: Dawki te zostały przetestowane na CD1(ICR) i NU-Foxn1^nu 8-tygodniowych samców myszy. Inne szczepy mogą wymagać nieco innych dawek, które powinny zostać zoptymalizowane w osobnym eksperymencie. Ta dawka utrzyma mysz w stanie znieczulenia przez około 45 minut. Uwaga: Głębokość znieczulenia jest zwykle wystarczająca, jeśli zwierzę nie wykazuje reakcji na uszczypnięcie stopy.
4. Po znieczuleniu umieść zwierzę w kołysce dla zwierząt i unieruchom, aby zapobiec ruchowi podczas rezonansu magnetycznego. W razie potrzeby umieść odniesienie zewnętrzne obok zwierzęcia. Zarówno odniesienie, jak i ROI (oczekiwana lokalizacja wstrzykniętych komórek) powinny znajdować się w środku cewki. Zwierzę powinno być podłączone do kontroli temperatury i oddechu w celu monitorowania fizjologicznego podczas skanowania.
5. Przykryj oczy myszy sterylną maścią do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas długich sesji obrazowania.
6. Jeśli czas obrazowania przekracza 40 minut, przygotuj dodatkowe cewniki do wstrzyknięcia dodatkowej ketaminy/ksylazyny, zanim zwierzę będzie mogło się obudzić. Umieścić dwa oddzielne cewniki podskórne z roztworami roboczymi ketaminy i ksylazyny. Użyj tego cewnika, aby podać myszy dodatkowe 2,5 mg ketaminy co 20 minut po pierwszych 40 minutach. W razie potrzeby należy przedłużyć znieczulenie, wstrzykując dodatkowe 0,5 mg ksylazyny przez cewnik, 100 minut po pierwszym wstrzyknięciu. We wszystkich przypadkach czas eksperymentu nie powinien przekraczać 3 godzin, z wyjątkiem ewentualnie znieczulenia terminalnego.
7. Upewnić się, że mysz jest ogrzana bezpośrednio po pierwszym wstrzyknięciu i utrzymywana w temperaturze ciała wynoszącej 37 °C. Dzięki temu protokołowi wykryto <80% natlenienia krwi podczas oddychania powietrzem w atmosferze. Aby zapobiec skutkom ubocznym obniżonego natlenienia krwi, należy stosować 100% tlenu (0,3 l/min). Temperatura ciała i oddech powinny być kontrolowane przez cały czas trwania eksperymentu i do momentu pełnego wyzdrowienia zwierzęcia. Należy pamiętać, że częstość spontanicznych oddechów pod ketaminą/ksylazyną jest bardzo wysoka (200-250/min). Nieprawidłowości we wzorcu oddychania, a nie częstość oddechów, mogą wskazywać, że do utrzymania odpowiedniego stanu znieczulenia konieczna jest wyższa dawka. Mysz obudzi się spontanicznie w ciągu 20-30 minut po ostatniej dawce środka znieczulającego.

Uwaga: Do śledzenia komórek konieczne jest zobrazowanie tego samego zwierzęcia więcej niż raz. W takim przypadku sesje obrazowania powinny być zaplanowane z uwzględnieniem czasu niezbędnego do usunięcia znieczulenia z systemu i wytycznych instytutu dotyczących stosowania zwierząt.

6. Obrazowanie

¹H regulacje i obrazowanie

1. Umieść zwierzę wewnątrz skanera tak, aby zwrot akcji znajdował się w izocentrum, za pomocą skanu anatomicznego o niskiej rozdzielczości z różnymi orientacjami plastrów (lokalizator).
2. Użyj zwykłego protokołu podkładkowania na ¹godzinie, np. globalnej podkładki na całej objętości wewnątrz cewki.
3. Dostosuj wzmocnienie impulsu referencyjnego (RG), tj. moc nadajnika mierzoną w dB dla impulsu RF Hermite 90° 1 ms, korzystając ze skanu regulacyjnego dostarczonego przez dostawcę.

Uwaga: Ta regulacja będzie się różnić w zależności od typu cewki RF i jest niezbędna dla ¹⁹F MRI, ponieważ sygnał na częstotliwości ¹⁹F jest zwykle zbyt niski do bezpośredniej regulacji. W związku z tym należy dokonać oszacowania RG na podstawie pomiarów na sygnale ¹H. W przypadku transmisji RF z cewką powierzchniową ¹H RG należy ustawić w płaszczyźnie równoległej do cewki przez część będącą przedmiotem zainteresowania, w przypadku cewki objętościowej o jednorodnym profilu B₁ dokładne ustawienia regulacji są mniej ważne.

4. Poniższy protokół regulacji wzmocnienia impulsu referencyjnego ¹⁹F działa tylko wtedy, gdy zarówno transmisja ¹H, jak i ¹⁹F RF jest realizowana przy użyciu tej samej (pojedynczej lub podwójnie dostrojonej) cewki RF. W przypadku takiego układu obrazowania profil cewki (pole transmisyjne B₁) w ¹H powinien być proporcjonalny do profilu cewki ¹⁹F, gdy stosuje się stałą RG, tj. B_1,1H=C*B_1,19F przy stałej proporcjonalności C.
   1. Aby potwierdzić, że profile zwojów są proporcjonalne dla określonej konfiguracji, należy wcześniej uzyskać mapę kąta odwrócenia ¹H i ¹⁹F (patrz następna sekcja dotycząca korekcji B₁) na rurze o wysokim stężeniu ¹⁹F, np. TFA w wodzie (1:1 v/v) przy użyciu identycznych pól widzenia (FOV), (rysunek 3).
   2. Korzystając z tej samej RG, sprawdź, czy obie mapy są identyczne, z wyjątkiem globalnego współczynnika C.
   3. Po ustaleniu ¹H RG zanotuj tę liczbę.
5. Wykonaj konwencjonalne badanie MRI ¹H jako anatomiczny punkt odniesienia dla obrazowania ¹⁹F. Dostosuj system do częstotliwości ¹⁹F markera komórkowego i przeprowadź skan MR ¹⁹F. Idealnie byłoby, gdyby rezonans magnetyczny ¹⁹F miał takie samo pole widzenia i wybór warstw jak rezonans magnetyczny ¹H, chociaż zwykle z niższą rozdzielczością. Zwierzę można reanimować, gdy tylko obrazowanie zostanie zakończone. Przetwarzanie obrazu może być następnie przeprowadzane w trybie offline.
6. Wyznacz ¹⁹F RG poprzez zależność dB_19F=dB_1H-20*log₁₀(C). Oszacuj częstość czynnika ¹⁹F w oddzielnym doświadczeniu in vitro.

Uwaga: In vivo, dokładna częstotliwość może się nieznacznie różnić w zależności od eksperymentu ze względu na różne warunki podkładkowania. Aby zapobiec artefaktom przesunięcia chemicznego, dokładna częstotliwość powinna być określana w każdym doświadczeniu przez ¹⁹F MRS, jeśli to możliwe. Typowym skanem dla bardzo niskiego sygnału ¹⁹F byłaby spektroskopia globalna (impulsowa) (TR=200 ms, NEX=3,000, TA=10 min, BW=50 kHz). NEX, a więc TA, może być znacznie zmniejszony dla wysokiego sygnału ¹⁹F. Częstość czynnika ¹⁹F wyznacza się na podstawie widma po transformacji Fouriera i korekcji fazowej. NEX odnosi się do liczby wzbudzeń, TA to czas akwizycji, a BW to przepustowość.

Uwaga: Typowe parametry obrazowania⁹ na dedykowanym skanerze zwierząt 11,7 T/16 cm to: Anatomiczny skan obrazowy ¹H z wykorzystaniem sekwencji turbo spin echo (TSE) z TR/efektywnym czasem echa (TE_eff) = 2,200 msec/42,8 ms, 8 echa na wzbudzenie, NEX = 2, 10 kolejnych plastrów o grubości 1 mm, FOV = 1,92 x 1,92 cm², matryca 128 x 128, czyli rozdzielczość 150 x 150 x 1 000^μm3, TA = 1 min, BW = 50 kHz i liniowy schemat kodowania fazy. ^{Rozdział 19}Obrazy F uzyskano z tą samą sekwencją i dopasowaną geometrią, ale z niższą rozdzielczością w płaszczyźnie i niższą czernią (NEX = 256, matryca 48 x 48, czyli rozdzielczość 400 x 400 x 1 000^μm3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B₁ korekta
   Użycie cewki RF o niejednorodnym profilu B₁, np. cewki powierzchniowej, może utrudnić kwantyfikację danych ¹⁹F, ponieważ sygnał zależy nie tylko od stężenia ¹⁹F, ale także od odległości od cewki. Zdobądź mapę B₁ na kanale ¹H w celu retrospektywnej korekty danych ¹⁹F. Wymaga to, aby profile cewek ¹H i ¹⁹F były identyczne, z wyjątkiem współczynnika proporcjonalności C, oraz aby w obszarach ¹⁹F zapewniony był wystarczający sygnał tła ¹H. Przedstawiono przykładowy protokół korekcji sekwencji echa spinowego ¹⁹F, wykorzystujący jednostrojoną cewkę powierzchniową Tx/Rx przestrajalną zarówno do ¹H, jak i ¹⁹F oraz z proporcjonalnymi profilami B₁ ¹³.
   1. Uzyskaj mapę kąta odwrócenia ¹godziny za pomocą metody dwóch kątów odwrócenia ¹⁴. Uzyskaj skan echa gradientowego z bardzo długim TR (>3 razy ¹H T₁) z szacowanym kątem obrotu nieco poniżej 90°. Blisko cewki. Uzyskaj drugi skan echa gradientowego z RG=dB_1H-6, tj. dwukrotnie większym kątem odwrócenia niż w pierwszym skanowaniu.
   2. Oblicz kąt odwrócenia ¹H, α, przy wokselu (x,y,z) za pomocą intensywności sygnału (SI) pierwszego i drugiego skanu echa gradientowego: α(x,y,z)=arcos(SI_GE,1(x,y,z)/2SI_GE,2(x,y,z)⁾¹⁴. Kąt odwrócenia ¹⁹F jest identyczny (z wyjątkiem współczynnika 1/C) ze względu na proporcjonalne profile B₁. Zgodnie z zasadą wzajemności^{Faradaya 15}, tłumienie intensywności sygnału ¹⁹F z sekwencji echa spinowego (kąt odwrócenia wzbudzenia α, kąt odwrócenia ogniskowania 2α) podczas odbioru sygnału wynosi att_Rx(x,y,z)~α(x,y,z). Tłumienie spowodowane niedoskonałym wzbudzeniem wynosi att_Tx(x,y,z)~sin³(α(x,y,z))¹⁶. Całkowite tłumienie jest zapisywane jako att=attRx*attTx= α*sin³(α)/90°. Zwróć uwagę, że jest znormalizowany do 1 w przypadku idealnego kąta odwrócenia wzbudzenia 90°/180°/ponownego ogniskowania. Intensywności sygnału obrazu B₁ skorygowane ¹⁹F SI_{19F, corr} są obliczane za pomocą SI_{19F, corr}(x,y,z)= SI_19F(x,y,z)/att(x,y,z).
   3. Aby porównać natężenia sygnału z różnych eksperymentów, umieść rurkę referencyjną o zdefiniowanym stężeniu ¹⁹F w polu view i znormalizuj SI_{19F, korygując} do średniego sygnału w odniesieniu .

Uwaga: Inne metody mapowania ¹H B₁/flip angle mogą być używane, a różne sekwencje impulsów ¹⁹F wymagają modyfikacji att_Tx,19F. Każdy schemat korekcji B1 wprowadzi dodatkowy błąd w procedurze oznaczania ilościowego komórek. Jeśli głównym założeniem jest dokładna kwantyfikacja komórek, cewka RF o jednorodnym profilu B1 może być użyta do obejścia tej części protokołu.

7. Przetwarzanie obrazu

1. Wykonywanie obrazów nakładkowych ¹H i ¹⁹F
   1. Wyeksportuj ze skanera dane obrazu dla końcowych obrazów o jasności ¹H i ¹⁹F.
   2. Otwórz pliki w programie do przetwarzania obrazów, takim jak ImageJ (freeware, NIH).
   3. W razie potrzeby przeprowadź korekty obrazu (kadrowanie, jasność, kontrast), zachowując takie same ustawienia dla wszystkich obrazów. Obrazy ¹⁹F zazwyczaj będą musiały zostać przeskalowane do wyższej rozdzielczości, aby pasowały do odpowiadających im obrazów ¹H.
   4. Renderuj ¹⁹obrazów F w fałszywych kolorach (wybierz inną tabelę wyszukiwania w menu "obraz" na obrazie J), a następnie nałóż na odpowiednie obrazy ¹H, aby zlokalizować sygnał.
2. ¹⁹F Kwantyfikacja
   1. Wybierz obraz ^{o wielkości 19}F (obraz o dużej wielkości) z widocznymi odpowiednimi komórkami i odniesieniem.
   2. W programie takim jak Image J narysuj ROI na odpowiednich komórkach, odwołaniu i obszarze poza obiektem (szum).
   3. Użyj polecenia Analizuj, a następnie Zmierz (lub po prostu Ctrl+M), aby obliczyć średnią intensywność pikseli w tych obszarach i ich powierzchnię. Niech S(komórki) odnoszą się do średniej intensywności pikseli w ROI nad komórkami. Pomnóż to przez objętość (= powierzchnia x grubość warstwy), aby obliczyć całkowity sygnał.
   4. Oblicz SNR, na przykład za pomocą wzoru SNR = 0,65 x S (komórki) / σ, gdzie σ jest odchyleniem standardowym intensywności pikseli w ROI poza próbką, która jest wolna od artefaktu przesunięcia chemicznego (zwykle w powietrzu tła)¹⁷. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest niższy niż 5, może być konieczna korekta sygnału ze względu na szum, którą można przeprowadzić zgodnie z opisem w innym miejscu^{11 10}.
   5. W przeciwnym razie należy obliczyć całkowitą ilość ¹⁹F odpowiedzialną za sygnał w ROI w stosunku do odniesienia, mnożąc obszar odniesienia w wycinku przez grubość warstwy (w celu obliczenia objętości) przez stężenie ¹⁹F w odniesieniu do którego, o którym wiadomo i zakłada się, że jest jednorodne.
   6. Pomnóż tę wartość przez całkowity sygnał w ROI w komórkach, podzielony przez całkowity sygnał w odniesieniu do odniesienia, aby obliczyć ilość ¹⁹F w komórkach.
   7. Oblicz liczbę komórek, dzieląc tę liczbę przez wartość ¹⁹F/komórkę, która została obliczona w sekcji 2.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiamy typowe wyniki dla protokołu obejmującego transfer komórek znakowanych ¹⁹F migrujących do drenującego węzła chłonnego. Rysunek 2 przedstawia widmo ¹⁹F NMR 10⁶ znakowanych komórek z użyciem referencji TFA. Konfiguracja obrazowania została przeprowadzona zgodnie z opisem w protokole (Rysunek 3). Do obrazowania in vivo wykorzystano referencję w postaci szczelnego cylindra z tym samym znacznikiem, który posłużył do...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje ogólną procedurę śledzenia komórek in vivo ¹⁹F MRI. Pomimo opisanej metody koinkubacji, istnieje kilka różnych protokołów znakowania komórek czynnikiem ¹⁹F. Najczęściej stosowana jest jednak koinkubacja, która może być dodatkowo zoptymalizowana , np. poprzez dodanie środków transfekcyjnych⁶. Rzeczywisty protokół etykietowania komórek będzie zależał od typu komórki. W protokole opisano tylko kluczowe kroki etykietowania. Ogólnie rzecz ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamina (Ketavet)	Pfizer	778-551
Ksylazyna (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	maść do oczu
Nazwa materiału
Skaner MRI	Bruker Biospec
Spektrometr NMR	Bruker Biospec