Wytrącanie fosforanu wapnia jest wygodną i ekonomiczną metodą transfekcji hodowanych komórek. Dzięki optymalizacji możliwe jest zastosowanie tej metody na trudnych do transfekcji komórkach, takich jak neurony pierwotne. Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół transfekcji fosforanu wapnia neuronów hipokampa hodowanych wspólnie z komórkami astrogleju.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja fosforanu wapnia pierwotnych neuronów hipokampa
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wytrącanie fosforanu wapnia jest wygodną i ekonomiczną metodą transfekcji hodowanych komórek. Dzięki optymalizacji możliwe jest zastosowanie tej metody na trudnych do transfekcji komórkach, takich jak neurony pierwotne. Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół transfekcji fosforanu wapnia neuronów hipokampa hodowanych wspólnie z komórkami astrogleju.
Wprowadzenie
Pierwotne neurony są jednym z najtrudniejszych typów komórek do transfekcji, ponieważ są postmitotyczne i są bardzo wrażliwe na zmiany mikrośrodowiska. Istnieją cztery powszechnie stosowane typy metod ekspresji genów egzogennych i krótkich RNA (shRNA) w tych komórkach1. Każdy ma swoje zalety i wady. Na przykład elektroporacja jest zwykle wykonywana na świeżo wyizolowanych neuronach2, ponieważ komórki muszą być przenoszone do kuwet w celu transfekcji. Infekcja wirusowa może zwykle osiągnąć bardzo wysoką skuteczność3, ale jest bardziej pracochłonna i ryzykowna dla operatorów. Na rynku dostępnych jest wiele odczynników do transfekcji za p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie hodowli astrocytów szczurów do pożywek kondycjonowanych i kokultur astrocytów i neuronów.
- Przygotować bufor do preparacji (BSS, przepis znajduje się w Tabeli 1) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
- Znieczulenie nowonarodzonych szczeniąt szczurów (P0-P2) izofluranem w zlewce o pojemności 500 ml.
- Kiedy szczenięta są nieruchome, spryskaj je 70% etanolem i odetnij głowę.
- Usuń mózg.
- Przytrzymaj mocno głowę za pomocą kleszczy Dumont #5 i użyj cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej przez skórę i czaszkę.
- Odsłoń mózg, odbijają....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Gdy poszczególne parametry transfekcji są zoptymalizowane i starannie kontrolowane z eksperymentu na eksperyment, możliwe jest uzyskanie wydajności transfekcji do 50%. Rysunek 1 przedstawia pole neuronów poddanych transfekcji GFP w 4. dniu in vitro (DIV4). W polu znajduje się łącznie 28 neuronów, z czego 16 zostało poddanych transfekcji. Odpowiada to wydajności powyżej 50%. Próbkowanie innych pól na tej samej szkiełku nakrywkowym wykazuje, że całkowita wydajność wynosi około 50% (dane niepokazane). W sys.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka kluczowych parametrów, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby transfekcje były konsekwentnie udane10,11. Najbardziej krytycznym parametrem dla transfekcji fosforanu wapnia jest wartość pH 2x HBS, która w naszych rękach zwykle waha się w granicach 7,10-7,15. Zalecamy wykonanie trzech partii zapasów z wartościami pH w krokach co 0,05, aby uwzględnić różnicę między pH-metrami. Alternatywnie, zestaw do transfekcji ssaków Clontech zapewnia 2x HBS, który konsekwentnie zapewnia dobrą wydajność. Na.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez NS065183 grantów NIH i fundusze na rozpoczęcie działalności z Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kleszcze Dumont #5 | Narzędzia do nauki o wysokiej | 11251-20 | |
| Drobne nożyczki | Fine Science Tools | 14090-09 | proste / ostre 8,5 cm |
| Nożyczki sprężynowe Vannas-Tubinger | Fine Science Tools | 15008-08 | kątowe / ostre / krawędź tnąca 8,5 cm / 5 mm |
| Kleszcze o standardowym wzorze | Narzędzia do nauki o | 11000-16 | |
| Student chirurgiczny nożyczki | Fine Science Tools | 91401-14 | / 14,5 cm |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15006-09 | kątowe na bok / krawędź tnąca 9 cm / 10 mm |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lizyna | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Pirogronian sodu | Sigma | S8636 | |
| Glukoza | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7,3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobaseal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Suplement (50x) | Gibco/ Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Suplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Albumina jaja kurzego | Sigma | A5503 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2,5% Trypsyna | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNaza I | Sigma | DN-25 | |
| Cytozyna arabinozyd | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kwas kynureninowy | Sigma | K3375 |
Bibliografia
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
