In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Podsumowanie

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

Streszczenie

Wyczerpanie limfocytów T jest głównym czynnikiem nieudanego usuwania patogenów podczas przewlekłych infekcji wirusowych. Szlaki immunoregulacyjne, takie jak PD-1 i IL-10, są regulowane w górę po tej ciągłej ekspozycji na antygen i przyczyniają się do utraty proliferacji, zmniejszonej funkcji cytolitycznej i upośledzonej produkcji cytokin przez limfocyty T CD4 i CD8. W mysim modelu zakażenia LCMV podanie przeciwciał blokujących przeciwko tym dwóm szlakom zwiększyło odpowiedź limfocytów T. Jednak obecnie nie ma testu in vitro, który mierzyłby wpływ takiej blokady na wydzielanie cytokin w komórkach z próbek ludzkich. Nasz protokół i podejście eksperymentalne umożliwiają nam dokładne i skuteczne ilościowe określenie przywrócenia produkcji cytokin przez specyficzne dla HIV limfocyty T CD4 od osób zakażonych wirusem HIV.

Tutaj przedstawiamy eksperymentalny projekt in vitro, który umożliwia pomiary wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV i ich wpływ na inne podzbiory komórek. Limfocyty T CD8 zubożono z krwi pełnej, a pozostałe PBMC wyizolowano metodą rozdzielania Ficoll. PBMC zubożone w CD8 inkubowano następnie z przeciwciałami blokującymi przeciwko PD-L1 i/lub IL-10Rα, a po stymulacji pulą peptydów HIV-1 Gag komórki inkubowano w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Po 48 godzinach supernatant pobrano do analizy cytokin za pomocą układów kulek, a osady komórkowe pobrano do analizy fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy transkrypcyjnej za pomocą qRT-PCR. W celu bardziej szczegółowej analizy uzyskano różne populacje komórek przez selektywne zubożenie podzbiorów z PBMC lub przez sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej przed oceną w tych samych testach. Metody te zapewniają bardzo czułe i specyficzne podejście do określania modulacji produkcji cytokin przez specyficzne dla antygenu limfocyty T pomocnicze oraz do określania funkcjonalnych interakcji między różnymi populacjami komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

Podczas uporczywych infekcji wirusowych, specyficzne dla wirusa komórki T nabywają funkcjonalne defekty w procesie znanym jako wyczerpanie limfocytów T. Wczesne badania in vivo na mysim modelu LCMV przewlekłej infekcji wirusowej wykazały, że wyczerpane limfocyty T specyficzne dla wirusa mają zmniejszoną funkcję cytolityczną wobec komórek zakażonych wirusem, tracą zdolność do proliferacji i mają zmniejszoną zdolność do wytwarzania cytokin, takich jak IL-2, TNF-α i IFN-γ^1,2. Złożona sieć szlaków immunoregulacyjnych, takich jak PD-1 i IL-10, jest regulowana w górę podczas przewlekłych infekcji i przyczynia się do dysfunkcji limfocytów T (przegląd w^3,4). Podanie in vivo przeciwciał blokujących przeciwko tym szlakom hamującym w mysim modelu LCMV przywróciło funkcję wyczerpanych limfocytów T specyficznych dla wirusa i zwiększyło klirens wirusa, co wskazuje, że wyczerpanie limfocytów T jest zjawiskiem częściowo odwracalnym (przegląd w ⁵).

Wyniki modelu LCMV zostały szybko rozszerzone na przewlekłe infekcje wirusowe u ludzi, takie jak HBV, HCV i HIV⁵. W przewlekłym zakażeniu HIV-1 szlaki PD-1 i IL-10 są regulowane w górę u osób zakażonych i korelują z parametrami progresji choroby, bezpośrednio z wiremią i odwrotnie z liczbą CD4^6-8. Blokada przeciwciał szlaków PD-1 lub IL-10 in vitro przywróciła proliferację limfocytów T CD4 i CD8 specyficznych dla HIV, co wskazuje, że podobnie jak w modelu mysim LCMV, wyczerpanie limfocytów T u ludzi jest zjawiskiem częściowo odwracalnym. Jednak ze względu na delikatny charakter eksperymentów na próbkach ludzkich, a także ograniczenia w czułości testów in vitro, uderzający jest brak dokładnych badań profili odbudowy funkcjonalnej osiągniętych dzięki tym interwencjom. Testy proliferacji były do tej pory jedynymi wiarygodnymi testami in vitro testowanymi w większości badań, jednak istnieje znaczący brak dowodów na wpływ tych interwencji na: 1) zdolność zabijania cytotoksycznych limfocytów T, 2) przeciwwirusowe działanie limfocytów T na replikację wirusa, 3) profil wydzielania cytokin i 4) wpływ na pomoc limfocytów T CD4 na inne podzbiory komórek.

Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS) jest bardzo użytecznym i szeroko stosowanym testem opartym na cytometrii przepływowej, który służy do wykrywania produkcji cytokin w różnych typach komórek zarówno u myszy, jak i u ludzi. Został również wykorzystany do zbadania wpływu blokady przeciwciał na szlaki hamujące. W testach ICS wydzielanie cytokin jest blokowane przez dodanie Brefeldiny i (lub) Monenzyny. Cytokiny uwięzione w komórkach są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych za pomocą polichromatycznej cytometrii przepływowej. Czas trwania testu jest zwykle ograniczony do 6 lub 12 godzin po stymulacji antygenem, ponieważ zarówno Brefeldin, jak i Monensin, które są zwykle dodawane w ciągu 2 godzin od dodania antygenu, są toksyczne dla komórek. Test ICS jest potężną techniką, która okazała się przydatna w badaniu wpływu podawania in vivo na interwencję przeciwciał blokujących u myszy, u których komórki zostały wyekstrahowane po pewnym czasie po ekspozycji na przeciwciała⁹. Istnieje jednak kilka ograniczeń w stosowaniu tego eksperymentalnego podejścia do oceny wpływu blokady receptorów hamujących w próbkach ludzkich. Podczas wykonywania interwencji przeciwciałami szlaków hamujących w 6 lub 12-godzinnej stymulacji in vitro (zwykle w przypadku próbek ludzkich), blokada receptorów hamujących w większości przypadków nie zmienia częstotliwości odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, mierzonej za pomocą standardowych testów ICS^{6, 7} . Pomiary produkcji cytokin na komórkę mierzone średnią lub medianą intensywności fluorescencji dały niespójne wyniki^{6, 7, 10}. Z drugiej strony, gdy ICS jest wykonywany w późnym punkcie czasowym po stymulacji (tj. sześć dni), można zaobserwować zmiany w liczbie komórek wydzielających cytokiny. Różnice są połączonym efektem zmienionej proliferacji, przeżycia i zmian w funkcji efektora, które kumulują się w określonym czasie⁶. Jednym ze sposobów częściowego przezwyciężenia tych ograniczeń jest inkubacja przez dłuższy czas (np. 36 godzin, 60 godzin itp.) z antygenem przed dodaniem blokera wydzielania cytokin bez czekania na proliferację. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do określenia kinetyki wydzielania cytokin przez specyficzne dla HIV limfocyty T CD4 i CD8^11,12; Jednak takie podejście nie jest w stanie wykryć małych odpowiedzi i nie da zintegrowanego wyniku całkowitego wydzielania cytokin występującego od czasu stymulacji. W związku z tym ICS nie jest wystarczająco czułą metodą do wykrywania wpływu blokady szlaków hamujących na ilość cytokin wytwarzanych przez aktywowane limfocyty T w porównaniu z kwantyfikacją mRNA cytokin lub pomiarami wydzielania cytokin w supernatancie w tych samych punktach czasowych. Ponadto większość cytokin wytwarzanych przez aktywowane limfocyty T działa w sposób autokrynny, przyczyniając się do pętli dodatniego lub ujemnego sprzężenia zwrotnego poprzez interakcję z komórkami prezentującymi antygen. Dlatego dodanie Brefeldyny lub Monenzyny podczas testu ICS zapobiega wydzielaniu cytokin, a tym samym stymulacja limfocytów T nie jest optymalna. Wreszcie, wykrywanie wielu cytokin za pomocą ICS jest ograniczone dostępnością i czułością przeciwciał do wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej, a także ograniczeniami liczby fluorochromów, które mogą być używane jednocześnie w danym panelu.

Opracowaliśmy bardzo czułe eksperymentalne podejście in vitro, aby ocenić wpływ szlaków immunoregulacyjnych na regulację wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV, a następnie pomoc CD4 w komórkach prezentujących antygen (APC) i komórkach NK (komórki NK). Metoda ta może być również stosowana do oceny wpływu blokady cząsteczek hamujących na funkcję limfocytów T CD8 poprzez zubożenie limfocytów T CD4 z PBMC lub poprzez stymulację optymalnymi peptydami, które są rozpoznawane tylko przez limfocyty T CD8. W przeciwieństwie do wewnątrzkomórkowych testów barwienia cytokin, zdecydowaliśmy się nie ingerować w wydzielanie cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV, aby móc: 1) przeprowadzić dokładniejszą kwantyfikację wytwarzanych cytokin; 2) zbadać szerszy panel cytokin lub cząsteczek efektorowych; oraz 3) ocenić wpływ cytokin wytwarzanych przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV na inne podzbiory komórek. Stymulujemy PBMC zubożone w CD8 pulą peptydów HIV-1 Gag w obecności przeciwciał blokujących dla interesującego szlaku immunoregulacyjnego. Po pożądanym czasie inkubacji, zwykle 48 godzin, zbieramy supernatanty w celu zmierzenia wydzielania cytokin za pomocą układów kulek i zbieramy osady komórkowe do analizy fenotypowej różnych podzbiorów komórek lub do analizy transkrypcyjnej. Warto zauważyć, że w tym 48-godzinnym punkcie czasowym nie wykrywamy znaczącej populacji proliferujących limfocytów T¹². Jest to elastyczne podejście i można zastosować kilka adaptacji tego projektu w celu uwzględnienia różnych hipotez. Na przykład poszczególne podzbiory komórek (takie jak limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV lub limfocyty T PD-1 o wysokiej zawartości CD4 itp.) można sortować po 12 godzinach inkubacji przed dalszą inkubacją przez 36 godzin, a następnie zbierać supernatanty i osady komórkowe w celu dokładniejszego zbadania wpływu interwencji blokujących na wydzielanie cytokin przez określone subpopulacje PBMC.

Protokół

1. Zubożenie i izolacja PBMC poprzez separację Ficoll

1. Zuboż limfocyty T CD8 +, dodając ludzki koktajl zubożenia CD8 + w 50 μl / ml pełnej krwi.
2. Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (18-25 °C).
3. Po inkubacji wymieszaj krew pełną z HBSS (Zbilansowany roztwór soli Hanka bez Ca²⁺ lub Mg²⁺) i nałóż warstwę na histopakę. Kręć z prędkością 340 rcf przez 30 minut (bez hamulca, powolne przyspieszanie).
4. Zbierz PBMC i przenieś do nowego stożka o pojemności 50 ml. Przemyć 2x 45 ml RPMI 1640 uzupełnionym 50 IU penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES, wirując przez 10 minut przy 340 rcf.

2. Blokada przeciwciał i specyficzna dla antygenu stymulacja komórek

1. Ponownie zawieś komórki w 2x10⁶ na warunek w RPMI 1640 zawierającym 10% ludzkiej surowicy uzupełnionej 50 IU penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES, co daje 500 μl na stan.
2. Podwielokrotność 500 μl zawiesiny komórek na probówkę FACS.
3. W zależności od badanego szlaku dodać przeciwciała blokujące PD-L1, IL-10Rα i/lub kontrole izotypu w stężeniu 10 μg/ml i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Stymuluj komórki za pomocą puli peptydów HIV-1 Gag o końcowym stężeniu 1 μg/ml/peptyd. Uwzględnij również kontrolę "bez stymulacji" dla każdego warunku blokowania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 48 godzin.

3. Zbieranie i analiza supernatantu

1. Po 48 godzinach odwiruj rurki FACS przez 7 minut przy 340 rcf.
2. Ostrożnie zebrać 2 x 225 μl supernatantu w probówkach Eppendorf do układów kulek Luminex, nie naruszając przy tym osadu.
3. Inaktywować wirusa w pobranym supernatancie za pomocą 25 μl 0,5% PBS-Tween, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05% PBS-Tween.
4. Zebrane supernatanty należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, które nie są natychmiast używane.
5. Zmierz pożądane stężenia cytokin za pomocą zestawu Millipore Luminex zgodnie z protokołem producenta.

4. Pobieranie i analiza fenotypowa komórek za pomocą cytometrii przepływowej

1. Po zebraniu supernatantu umyj komórki w 3ml PBS. Wiruj komórki przez 7 minut przy 340 rcf i zdekantuj nadmiar prania.
2. Barwienie pod kątem żywotności za pomocą zestawu LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit zgodnie z protokołem producenta.
3. Myć komórki w PBS przez 7 minut w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C. Zawiesić ponownie w 100 μl PBS 1% FBS.
4. W przypadku barwienia w poszukiwaniu monocytów lub innych komórek prezentujących antygen, zablokuj receptory Fc, dodając 1,4 μl odczynnika blokującego FcR i wir do mieszania.
5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Dodać przeciwciała powierzchniowe, odwirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
7. Umyj komórki PBS 1% FBS, zdekantuj nadmiar prania i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
8. Przemyć komórki PBS 1% FBS, ponownie zawiesić w 250 μl PBS 1% FBS i pobrać na wielolaserowym cytometrze przepływowym (np. BD LSRII lub Fortessa).

5. Analiza komórek za pomocą qRT-PCR

1. W przypadku komórek, które nie były analizowane za pomocą cytometrii przepływowej: po zebraniu supernatantu komórki należy poddać lizie komórki w 300 μl buforu Qiagen RLT zawierającego 1% beta-merkaptoetanolu. Jeśli protokół nie będzie kontynuowany, komórki można zamrozić w temperaturze -80 °C po tym punkcie.
2. Wyizoluj RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta.
3. Zsyntetyzuj cDNA z RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta.
4. Wykonaj ilościowy PCR przy użyciu technologii SYBR Green.
5. Stwórz mieszankę starterów dla każdego użytego startera, w tym geny porządkowe (np. IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH), dodając startery do wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Trzymaj na lodzie.
6. Utwórz mieszankę wzorcową dla każdego podkładu, dodając 10,5 μl wody wolnej od nukleaz, 12,5 μl zieleni SYBR i 1 μl mieszanki startera na dołek na płytkę. Trzymaj na lodzie.
7. Odpipetować 24 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki, która będzie używana.
8. Dodaj 1 μl cDNA do każdej studzienki zgodnie z szablonem.
9. Zakryj studzienki i płytkę wirówkową przez 3 minuty przy 800 rcf.
10. Uruchomić płytkę na maszynie qRT-PCR, np. instrumencie Stratagene MX3005P.

6. Adaptacja do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin po 48 godzinach

Dodaj Brefeldin i Monensin 6 godzin przed wewnątrzkomórkowym barwieniem cytokin. Brefeldin dodaje się w stężeniu 10 μg/ml, natomiast Monenzynę dodaje się zgodnie z instrukcjami producenta. Dla wygody Brefeldin można dodać 12 godzin przed barwieniem w stężeniu 5 μg/ml.

1. Po zabarwieniu powierzchni umyj komórki PBS 1% FBS i wybarwić cytokiny wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-12, IFN-γ i TNF-α za pomocą zestawu i protokołu roztworu do utrwalania/przepuszczalności.
2. Umyć komórki, ponownie zawiesić w 250 μl PBS 1% FBS i uruchomić na wielolaserowym cytometrze przepływowym (np. BD LSR II lub Fortessa).

7. Adaptacja do sortowania komórek

1. 16 godzin po stymulacji, zabarwić pod kątem żywotności za pomocą zestawu LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit zgodnie z protokołem producenta. Utrzymuj komórki na lodzie podczas całej procedury.
2. Myć komórki PBS przez 7 minut w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C. Zawiesić ponownie w 100 μl PBS 1% FBS.
3. Dodaj przeciwciała powierzchniowe, wiruj do wymieszania i inkubuj komórki na lodzie w ciemności przez 20 minut.
4. Umyj komórki PBS 1% FBS w temperaturze 340 rcf i w temperaturze 4 °C i ponownie zawieś w 500 μl zimnego RPMI 1640 zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej uzupełnionej 50 IU penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES.
5. Przefiltruj komórki za pomocą 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem z nasadką sitkową
.
6. Przygotuj probówki do sortowania, dodając do każdej probówki 200 μl RPMI 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej uzupełnionej 50 j.m. penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1% HEPES. Podczas sortowania utrzymuj wszystkie probówki na lodzie.
7. Sortowanie na żywo interesujących nas podzbiorów komórek na urządzeniu (np. BD FACS Aria II) znajdującym się w obiekcie wyposażonym w materiały niebezpieczne biologicznie.
8. Po posortowaniu komórek umieść je z powrotem w inkubatorze na żądany czas, a następnie wykonaj pobieranie supernatantu/analizę Luminex i zbieranie osadów komórkowych/analizę PCR.

Wyniki

Podczas pomiarów cytokin z wykorzystaniem tego systemu in vitro niezbędne jest rozróżnienie odpowiedzi swoistych dla antygenu w porównaniu z kontrolą bez stymulacji. Generalnie za odpowiedzi dodatnie uznawaliśmy wszelkie wartości stymulacji antygenowej, które dawały co najmniej trzykrotny wzrost poziomu cytokin w porównaniu z kontrolą bez stymulacji i mieściły się w zakresie liniowym testu. Stosujemy wysokoczułe testy bead array, które mogą wykrywać stężenia cytokin tak niskie jak 0,16 pg/ml, co pozwala nam obse...

Dyskusja

Kolekcja Supernatant jest nieodzowną częścią tego eksperymentalnego projektu. Podczas zbierania supernatantów do testu Luminex wytwarzano podwielokrotności i utrzymywano je w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji białek w wyniku cykli zamrażania i rozmrażania. Zamrażanie i rozmrażanie może być trudnymi procesami dla białek, a minimalizując zamrażanie i rozmrażanie, sygnał zostanie zmaksymalizowany w testach. Dlatego łatwiej jest uzyskać powtarzalne i dokładniejsze dane podczas pracy z podwielokrotnościami, które z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hanks Zrównoważony roztwór soli bez Ca2+ lub Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Surowica ludzka AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicylina/Streptomycyna	Mediatech	30 001 CI
L-glutamina	Mediatech	25 005 CI
Bufor HEPES	Mediatech	25060CI
Odczynnik blokujący FcR, ludzki	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Ludzka komórka macierzysta koktajlu CD8 +		15663
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy barwników martwych komórek, do wzbudzenia UV	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II System odwrotnej transkrypcji	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacji	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ Podkład	Invitrogen		FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG