Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Podsumowanie

Opisujemy metodę skutecznego unieruchamiania BMP-2 na powierzchniach. Nasze podejście opiera się na tworzeniu samoorganizującej się monowarstwy w celu uzyskania kowalencyjnego wiązania BMP-2 poprzez jego wolne reszty aminowe. Ta metoda jest użytecznym narzędziem do badania sygnalizacji na błonie komórkowej.

Streszczenie

Białko morfogenetyczne kości 2 (BMP-2) jest czynnikiem wzrostu osadzonym w macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki kostnej. BMP-2 działa jako wyzwalacz różnicowania komórek mezenchymalnych w osteoblasty, stymulując w ten sposób gojenie i tworzenie kości de novo. Kliniczne zastosowanie rekombinowanego ludzkiego BMP-2 (rhBMP-2) w połączeniu z rusztowaniami wzbudziło ostatnio kontrowersje, związane ze sposobem prezentacji i ilością podawaną. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób dostarczania BMP-2 do badań in vitro na komórkach. Opisujemy, jak utworzyć samoorganizującą się monowarstwę składającą się z heterobifunkcyjnego łącznika i pokazujemy kolejny etap wiązania w celu uzyskania kowalencyjnego unieruchomienia rhBMP-2. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest osiągnięcie trwałej prezentacji BMP-2 przy jednoczesnym zachowaniu aktywności biologicznej białka. W rzeczywistości powierzchniowe unieruchomienie BMP-2 pozwala na ukierunkowane badania, zapobiegając niespecyficznej adsorpcji, jednocześnie zmniejszając ilość czynnika wzrostu, a przede wszystkim utrudniając niekontrolowane uwalnianie z powierzchni. Zarówno krótko-, jak i długoterminowe zdarzenia sygnalizacyjne wyzwalane przez BMP-2 mają miejsce, gdy komórki są wystawione na działanie powierzchni prezentujących kowalencyjnie unieruchomiony rhBMP-2, co czyni to podejście odpowiednim do badań in vitro nad odpowiedziami komórek na stymulację BMP-2.

Wprowadzenie

Białko morfogenetyczne kości 2 (BMP-2) należy do rodziny transformujących czynników wzrostu (TGF-β) i działa jako induktor tworzenia kości de novo, jak również regulator kilku tkanek podczas rozwoju embrionalnego i homeostazy dorosłych^1-3. Każdy monomer biologicznie aktywnego homodimerycznego białka BMP-2 zawiera motyw "węzła cysteinowego", który jest wysoce konserwatywny we wszystkich^{BMPs 4}. Sześć z siedmiu reszt cysteiny tworzy wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe, które stabilizują każdy monomer, podczas gdy siódma cysteina bierze udział w dimeryzacji, tworząc wiązanie międzycząsteczkowe między dwoma monomerami^5,6. Ten wysoce konserwatywny węzeł cysteinowy określa trójwymiarową strukturę białka BMP-2 i decyduje o jego unikalnych właściwościach, takich jak odporność na ciepło, denaturanty i kwaśne pH^7-9. BMP-2 wiąże się z receptorami transbłonowymi kinazy serynowo-treoninowej , indukując w ten sposób transdukcję sygnału^10-12. W zależności od trybu oligomeryzacji receptora aktywowane są różne szlaki sygnałowe: kaskada sygnałowa niezależna od Smad prowadzi do indukcji fosfatazy alkalicznej poprzez sygnalizację p38, podczas gdy szlak zależny od Smad aktywowany przez fosforylację receptora powoduje translokację jądrową kompleksu Smad i aktywację transkrypcji określonych genów docelowych, takich jak inhibitor różnicowania (Id)^12-14.

W kości, BMP-2 indukuje różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w osteoblasty, stymulując w ten sposób gojenie i tworzenie się de novo kości. Obecnie BMP-2 o ekspresji rekombinowanej jest stosowany klinicznie w celu przyspieszenia gojenia się złamanych miejsc. Powszechną strategią w inżynierii tkanki kostnej jest stosowanie iniekcyjnych czynników wzrostu, które są mniej inwazyjne w porównaniu z miejscowymi systemami dostarczania. Jednak badania in vivo i zastosowania kliniczne wykazały, że krótki biologiczny okres półtrwania, niespecyficzna lokalizacja i szybki miejscowy klirens BMP-2 mogą prowadzić do kilku problemów miejscowych, ektopowych i ogólnoustrojowych¹⁵. W związku z tym, aby uzyskać skuteczną prezentację, konieczne jest uwięzienie lub unieruchomienie BMP-2 w materiałach lub na materiałach w celu jego lokalnego i trwałego dostarczenia do miejsca docelowego. Trwałe dostarczanie można osiągnąć za pomocą podejść do retencji niekowalencyjnej, takich jak uwięzienie fizyczne, adsorpcja lub kompleksowanie jonów¹⁶. Wiadomo jednak, że niespecyficzna adsorpcja białek do powierzchni może prowadzić do denaturacji cząsteczek¹⁷. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne rodzaje podpór do kowalencyjnego wiązania czynników wzrostu. Zastosowanie dwufunkcyjnych cząsteczek łączących, które są ukierunkowane na przykład na grupy aminowe lub karboksylowe białka, jest jednym z rodzajów podejścia, które niekoniecznie wymaga modyfikacji białka w celu osiągnięcia jego unieruchomienia. W rzeczywistości, podczas gdy modyfikacja białek ma tę zaletę, że kontroluje orientację białka, wprowadzenie sztucznych domen, znaczników peptydowych i łańcuchów specyficznych dla miejsca może zmienić aktywność biologiczną czynników wzrostu¹⁷. Tak więc, aby obejść denaturację spowodowaną interakcją z materiałem nośnym, powierzchnie można wcześniej funkcjonalizować, na przykład za pomocą samoorganizującej się monowarstwy (SAM) cząsteczki łączącej, a następnie sprzężenia pożądanego czynnika¹⁸. Zastosowaliśmy podejście oparte na SAM do kowalencyjnego unieruchomienia BMP-2 na powierzchni poprzez celowanie w jego wolne reszty aminowe i wykazaliśmy, że unieruchomione białko zachowuje zarówno krótko-, jak i długoterminową aktywność biologiczną¹⁹. Protokół ten zapewnia prosty i skuteczny sposób dostarczania BMP-2 do komórek w celu przeprowadzenia badań in vitro nad mechanizmami zachodzącymi na błonie komórkowej i regulującymi sygnalizację wewnątrzkomórkową odpowiedzialną za sygnalizację osteogenną.

Protokół

1. Synteza estru 11-merkaptoundekanoilo-N-hydroksysukcynimidu (MU-NHS)

1. Dodawać kroplami roztwór 500 mg N-hydroksysukcynimidu i 30 mg 4-(dimetyloamino)pirydyny w 10 ml acetonu (rocznie) do 1 g kwasu 11-merkaptoundekanowego w 40 ml dichlorometanu (raz na dobę) w temperaturze pokojowej (RT).
2. Schłodzić reakcję do temperatury 0 °C i dodać kroplami 1,1 g N,N'-dicykloheksylokarbodiamidu w 10 ml dichlorometanu (w atmosferze azotu). Utrzymuj reakcję w niskiej temperaturze przez 1 godzinę, a następnie mieszaj w temperaturze pokojowej przez noc.
3. Przefiltrować osad i wysuszyć go pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyścić produkt metodą chromatografii błyskawicznej z użyciem benzenu naftowego i octanu etylu (p.a.) w stosunku 1:1.

2. Przygotowanie jednorodnych warstw złota

1. Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe precyzyjnymi chusteczkami i poddaj je sonikacji przez 5 minut w roztworze zawierającym mieszaninę octanu etylu (p.a.) i metanolu (p.a.) w stosunku 1:1. Podłoża spłukać metanolem i wysuszyć pod strumieniem azotu.
2. Umieść czyste podłoża w urządzeniu do powlekania napylającego. Ewakuuj komorę. Usuń najwyższą warstwę tlenku chromu z docelowego chromu, napylając przez 60 sekund. Umieść próbki pod metalową belką i pokryj je warstwą chromu o długości 10 nm, a następnie pokryj warstwą złota o długości 40 nm.

3. Unieruchomienie powierzchniowe BMP-2

1. Rozpuścić MU-NHS w N,N-dimethlyformamide (DMF) do końcowego stężenia około 1 mM i inkubować złote substraty w roztworze MU-NHS w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w atmosferze azotu.
2. Sonikować powierzchnie w DMF przez 2 minuty, spłukać DMF i MeOH i wysuszyć pod strumieniem azotu.
3. Przygotować roztwór podstawowy rhBMP-2 w sterylnym 4 mM HCl o stężeniu 100 μg/ml (przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C). W przypadku rozcieńczeń roboczych (3,5 μg/ml) rozcieńczyć roztwór podstawowy w PBS/NaCl (PBS zawierający 1 M NaCl) i bezpośrednio przed użyciem dostosować do pH 8,5.
4. Inkubować powierzchnie funkcjonalizowane MU-NHS w roztworze roboczym rhBMP-2 w temperaturze 4 °C przez noc. Usunąć supernatant z inkubacji. Sonikować powierzchnie w PBS/NaCl przez 2 minuty i myć 3x sterylnym PBS/NaCl.

4. Charakterystyka powierzchni

1. Aby zablokować nieswoistą adsorpcję przeciwciała, inkubować powierzchnie z 5% BSA (w/v) w roztworze PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-BMP-2 (1:100 w 1% (w/v) roztworze BSA/PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć powierzchnie dwukrotnie PBS i poddać sonikacji przez 30 sekund.
2. Inkubować substraty z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (1:1,000 w 1% (w/v) roztworze BSA/PBS) przez 30 minut w temperaturze RT, a następnie dwukrotnie przemyć PBS.
3. Użyj testu Ampliflu Red do pomiaru aktywności enzymatycznej HRP przy 570 nm za pomocą czytnika płytek.

5. Analiza aktywności biologicznej

1. Wysiewaj 1 x 10⁵ mysich mioblastów C2C12 na studzienkę na płytkach 6-dołkowych w pożywce wzrostowej, składającej się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej pirogronian uzupełniony 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 .}
2. Zagłodź komórki w DMEM bez surowicy przez 3-5 godzin przed wysiewem na powierzchnie ozdobione unieruchomionym BMP-2.
3. W celu zbadania krótkotrwałej indukcji sygnalizacji należy zastąpić pożywkę 200 μl świeżego DMEM bez surowicy i umieścić unieruchomione powierzchnie BMP-2 nad komórkami. Z powierzchnią należy obchodzić się pęsetą z cienką końcówką, aby uniknąć zarysowań.
4. Delikatnie usunąć powierzchnie i odessać pożywkę pipetą, dwukrotnie umyć komórki PBS. Przejdź do analizy odpowiedzi komórek.
5. W celu analizy długoterminowej aktywności biologicznej należy umieścić komórki na powierzchni i hodować je w temperaturze 37 °C/5% CO₂ w warunkach niskiej surowicy (2% FBS) przez sześć dni.

Wyniki

W naszym układzie, złoto zostało wybrane jako substancja pomocnicza, ponieważ dostarcza biologicznie niespecyficznego, ale chemicznie przestrajalnego systemu. Co więcej, zastosowanie samoorganizujących się monowarstw niesie ze sobą wiele korzyści: SAM spontanicznie adsorbują się poprzez swoje "grupy główne" na metalach i tworzą monowarstwy z niewielką liczbą defektów, podczas gdy ich funkcjonalne grupy końcowe mogą być dalej modyfikowane. W ten sposób zapewniają platformę do dostosowywania właściwości interfejsu w kontro...

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie powierzchni funkcjonalizowanych bioaktywnym rhBMP-2. Podejście to składa się z dwóch etapów: 1) wstępnego uformowania samoorganizującej się monowarstwy (SAM) dwufunkcyjnego łącznika na powierzchni złota; 2) kowalencyjna immobilizacja białka rhBMP-2. W poprzednich pracach zwalidowaliśmy skuteczne wiązanie dwufunkcyjnego łącznika i czynnika wzrostu oraz wykazaliśmy, że unieruchomiony powierzchniowo rhBMP-2 utrzymuje swoją aktywność biologiczną¹⁹. Bioaktywność czynni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
N-hydroksysukcynimid	Sigma-Aldrich	130672
4-(dimetyloamino)pirydyna	Sigma-Aldrich	522805
Aceton	AppliChem	A2282
Kwas 11-merkaptoundekanowy	Sigma-Aldrich	674427
Dichlormetan	Merck	106050
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D80002
Ropa naftowa benzen	Merck
Szkiełka nakrywkowe szklane	Carl Roth	M 875
Zastosowanie	octanu etylu	A3550
Metanol	Carl Roth	4627
N,N-dimetyloformamid	Carl Roth	T921
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	Bez nośnika; wyrażony w E.coli
PBS	PAA	H15-002
NaCl	Carl Roth	HN00.2
Poli(dimetylosiloksan) (PDMS)Dow	Corning
Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184	Dow Corning
Anty-rhBMP-2	Sigma	B9553
Kozia anty-mysia IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005	Przeciwciało drugorzędowe
Test Ampliflu Red	Sigma	90101
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), płyn	Gibco	41966
Płodowa surowica bydlęca o wysokim poziomie glukozy (FBS)	Sigma	F7524	Sterylnie filtrowana, testowana na hodowlach komórkowych
Długopis/Paciorkowiec	Gibco	15140
Trypsyna 0,05% (1x) z EDTA 4Na	Gibco	25300
Glicyna (0,1 M)	Riedel-de Haë nr	33226
IGEPAL CA-630 (1%)	Sigma	I8896	Bufor do lizy (test ALP)19
Chlorek magnezu (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2
Chlorek (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1
p-nitrofenylofosforan (pNPP)	Sigma	S0942	Substrat fosfatazy
Łańcuch ciężki anty-myzyny (MHC)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank, University of Iowa	MF20	Przeciwciało monoklonalne
Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie IgG	Invitrogen	A11001
DAPI	Sigma	D9542
Equipment
Kąpiel Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Częstotliwość 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG
MED 020 System napylania	BAL-TEC AG		Warunki powlekania Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sek Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sek
Tecan Infinite M200 Czytnik płytek	Tecan