Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Podsumowanie

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób. Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Streszczenie

Zakaźny materiał prionowy (PrP^Res) jest prawdopodobnie przyczyną śmiertelnych, neurodegeneracyjnych chorób zakaźnej encefalopatii gąbczastej (TSE)¹. Zakłada się, że choroby TSE, takie jak przewlekła choroba wyniszczająca (CWD), są przenoszone ze zwierzęcia^{na zwierzę 2,3}, a także ze źródeł środowiskowych^4–6. Padlinożercy i mięsożercy mają potencjał do translokacji materiału PrP^Res poprzez konsumpcję i wydalanie padliny skażonej CWD. Ostatnie prace udokumentowały przechodzenie materiału PrP^Res przez układ pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), pospolitego padlinożercy z Ameryki Północnej⁷.

Opisujemy procedury używane do dokumentowania przejścia materiału PrP^Res przez amerykańskie wrony. Wrony zostały zgłębnięte trzęsawką przystosowaną do myszy szczepu RML, a ich kał zebrano 4 godziny po zgłębniku. Kał wrony został następnie zebrany i wstrzyknięty dootrzewnowo myszom C57BL/6. Myszy były monitorowane codziennie, dopóki nie wystąpiły u nich kliniczne objawy trzęsawki myszy, a następnie zostały poddane eutanazji. Myszy bezobjawowe były monitorowane do 365 dni po inokulacji. Przeprowadzono analizę Western blot w celu potwierdzenia statusu choroby. Wyniki wykazały, że priony pozostają zakaźne po przejściu przez układ pokarmowy wron i są obecne w kale, powodując chorobę u myszy testowych.

Wprowadzenie

Zakaźne encefalopatie gąbczaste (TSE) to śmiertelne zakaźne choroby neurodegeneracyjne, które dotykają dziką przyrodę, zwierzęta domowe i ludzi. Wydaje się, że czynnikiem zakaźnym chorób TSE są nieprawidłowo sfałdowane lub chorobotwórcze izoformy (PrP^{, Res}) białek prionowych¹. Choroby TSE u zwierząt obejmują przewlekłą chorobę wyniszczającą (CWD) u mulaków (Odocoileus hemionus), jeleni wirginijskich (Odocoileus virginianus), łosi (Cervus elaphus) i łosi (Alces alces); trzęsawka owiec i kóz; gąbczasta encefalopatia bydła (BSE) u bydła domowego; pasażacyjna encefalopatia norek u norek utrzymywanych w warunkach fermowych; gąbczasta encefalopatia kotów u kotów; egzotyczna encefalopatia gąbczasta kopytnych u przeżuwaczy z egzotycznych ogrodów zoologicznych z rodziny Bovidae; i encefalopatia gąbczasta u naczelnych innych niż ludzie⁸. Choroba TSE występująca u pojedynczego człowieka, wariant choroby Creutzfeldta-Jakoba, jest rzadka i uważa się, że nabywa się ją poprzez spożywanie żywności skażonej PrP^{Res 9}. Podobnie, BSE może zarażać ludzi, jeśli spożyta jest skażona wołowina¹⁰. Spośród wszystkich chorób TSE, trzęsawka i CWD są jedynymi dwoma, w których występują samopodtrzymujące się epidemie, a źródła zakażenia przypuszcza się, że pochodzą ze zwierzęcia^{na zwierzę 2,3,11}, a także ze źródeł środowiskowych^4-6. Badania sugerują, że większość chorób TSE wymaga znacznie wydłużonych okresów inkubacji, od naturalnej ekspozycji materiału PrP^Res do manifestacji objawów klinicznych^2-4,6,8, a pozorne bariery gatunkowe minimalizują, ale nie eliminują możliwości transmisji międzygatunkowej^12-14.

Identyfikacja mechanizmów rozprzestrzeniania się zakaźnego materiału prionowego (PrP^Res) jest niezwykle ważna dla odpowiedzi na pytania o to, jak choroby TSE przemieszczają się po krajobrazie. Badania eksperymentalne sugerują, że owady^15,16, drób i świnie17 oraz wrony amerykańskie (Corvus brachyrhynchos)^7,18 są biernymi nośnikami lub dyspergatorami materiału PrP^Res. Niedawno udokumentowano przechodzenie materiału PrP^Res przez układ pokarmowy wron, co wskazuje na rolę, jaką mogą one odgrywać w rozprzestrzenianiu się chorób TSE⁷. Wyniki te uprawdopodabniają wrony, padlinożerców, mogą napotkać, spożywać i transportować materiał zakaźny poprzez odkładanie kału na obszary wolne od choroby.

Procedury, które tutaj demonstrujemy, zostały wykorzystane do udokumentowania przejścia materiału PrP^Res przez system trawienny wron i znacznie ułatwią zastosowanie tych metod do innych modeli specyficznych dla gatunków padlinożerców i mięsożerców w powiązanych przyszłych badaniach. W niniejszej pracy wykorzystano konwencjonalne metody do zbadania niekonwencjonalnych sposobów transportu materiałów PrP^Res, które mogą przyczyniać się do rozprzestrzeniania się i ogólnego obciążenia materiałem^{PrP Res}.

Protokół

Nasz protokół jest zaadaptowany z tego, który wcześniej opublikowaliśmy⁷. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), Inspekcji Zdrowia Zwierząt i Roślin (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).

1. Karawik

1. Oszacuj czas przejścia "pseudo materiału mózgowego" przez przewód pokarmowy wron amerykańskich.
   1. Wymieszaj 5 ml ugotowanego i jajecznicy z niebieskim barwnikiem i zgłębnik 1 kruka za pomocą igły 2-calowej (ryc. 1).
   2. Sprawdzaj wrony co 30 minut, aż kał zabarwiony na niebiesko/zielono przestanie być wydalany.
2. Uzyskaj niezakażone i nieuleczalnie chore mózgi myszy C57BL/6 zakażone RML (szczep Chandlera).
3. Wygeneruj normalny i zakażony homogenat mózgu myszy o stężeniu 20% wag. / obj. w homogenizatorze mieszalnika kulowego z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i szklanymi kulkami, a następnie odwiruj przy 3,000 x g przez 1 minutę, aby usunąć większe cząstki stałe. Usunąć supernatant i rozcieńczyć równą objętością 1x PBS, aby uzyskać 10% wag./obj. w sterylnym PBS. Zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
4. 17 godzin przed zgłębkiem usuń jedzenie z kojców dla kruków, ale nie wodę.
5. Losowo przydziel wrony do grup leczonych i doustnie zgłębnik każdej wrony podaj 5 ml normalnego lub zakażonego homogenatu mózgu myszy za pomocą igły do zgłębnika o średnicy 2 cali.
6. Przenieś wrony do indywidualnych klatek i zbierz i zgromadź wszystkie odchody w każdej klatce przez 4 godziny po zgłębniku (ryc. 2).
7. Homogenizuj kałużę dla każdej wrony w homogenizatorze bullet blender ze szklanymi kulkami, aż do uzyskania jednolitej tekstury. *Kał wrony jest w większości płynny i można go łatwo mieszać.
8. Dla każdej wrony rozcieńczyć 500 μl homogenatu kału w 9,5 ml 1x PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml.
9. Odwirować homogenat kału przez 15 minut przy 1 400 x g i wyekstrahować supernatant.
10. Aby zminimalizować zagrożenie wtórną infekcją bakteryjną, należy potraktować supernatant 1 μl 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, NY) na 100 μl homogenatu, a następnie umieścić w świetle UV w temperaturze pokojowej na 20 minut, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia wirusowego i bakteryjnego. Po ekspozycji na promieniowanie UV, sonikować próbki w sonikatorze 3000 Mp przy ustawieniu 70 przez 30 sekund, aby przerwać błonę pozostałych drobnoustrojów.

2. Szczepienie myszy

1. Losowo przydziel myszy do następujących grup leczenia (Tabela 1):
   1. Grupa 1 - Myszy z pozytywnym wynikiem leczenia zaszczepione dootrzewnowo (IP) 1 ml homogenatu kału od wron doustnie pobranych 5 ml zakażonych mózgów myszy.
   2. Grupa 2 - Myszy z negatywnym leczeniem zaszczepione IP 1 ml homogenatu kału od wron doustnie poddanych 5 ml normalnych mózgów myszy.
   3. Rozcieńczyć zakażony i normalny homogenat mózgu myszy dla grup 3 i 4 do 1:100 w/v w 1x PBS.
   4. Grupa 3 - Myszy z kontrolą pozytywną zaszczepione IP 1 ml zakażonego homogenatu mysiego mózgu.
   5. Grupa 4 - Myszy z kontrolą ujemną zaszczepione IP 1 ml normalnego homogenatu mysiego i mózgu.

Grupa zabiegowa Liczba zwierząt Grupa 1 Trzęsawka + Kał Wrony 100 szt. Grupa 2 Trzęsawka - Kał wrony 25 Grupa 3 Trzęsawka + Mózg myszy 10 Grupa 4 Trzęsawka - Mózg myszy 5

Tabela 1. Status szczepionki w zakresie trzęsawki owiec (dodatni +, ujemny -) i liczba wykorzystanych zwierząt⁷.

2. Inokulacja dootrzewnowa myszy:
   1. Mysz kark za futro na grzbietowej szyi z kciukiem i palcem wskazującym i delikatnie obróć, aby odsłonić stronę brzuszną.
   2. Podnieś tylny koniec myszy tak, aby głowa znajdowała się nieco niżej.
   3. Wprowadzić igłę 25 G 1 cm przez skórę, 1 cm po boku linii środkowej i 1-2 cm przed stawem krzyżowo-biodrowym za pomocą strzykawki z blokadą igły.
   4. Wstrzyknąć powoli 1 ml inokulacji do jamy ciała myszy.

3. Monitorowanie myszy

1. Monitoruj myszy codziennie, dopóki nie wyrażą klinicznych objawów trzęsawki myszy. Objawy kliniczne mogą obejmować: kifozę, ataksję, sztywność ogona, brak pielęgnacji, wychudzenie i letarg.
2. Oceń myszy za każdy z 6 objawów klinicznych, gdy widoczne oznaki są widoczne, gdzie 0 = brak widocznych, 1 = umiarkowany, a 2 = ciężki.
3. Eutanazję myszy, gdy całkowite dzienne wyniki dla każdego znaku osiągną ≥8 przez 1 dzień, ≥ 6 nieprzerwanie przez 3 dni lub po 365 dniach od zaszczepienia (dpi).
4. Mózg należy pobrać bezpośrednio po eutanazji i przechowywać w temperaturze -70 °C.
5. Aby potwierdzić diagnozę trzęsawki, należy strawić próbki mózgu za pomocą 3 μl 50 μg/ml roztworu proteinazy K (PK) rozcieńczonego w następujący sposób: 3,1. μl PK, 12,5 μl 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 μl 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 45 °C, a następnie dezaktywować PK, dodając 8 μl buforu ładującego i inkubując próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Załadować próbki na 12% żel SDS-PAGE, elektroforezę i transfer do membrany Immobilon PVDF i blok z 5% mlekiem beztłuszczowym w 0,2% Tween 20 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie sondować przeciwciałem monoklonalnym Bar224 anty-PrP sprzężonym z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonym w Superbloku, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać membranę przez 1 godzinę za pomocą PBS-0,2% Tween 20. Aby to zobrazować, inkubuj Western blot przez 5 minut z podłożem chemiluminescencyjnym i obrazem w systemie dokumentacji żelu G-box.

Wyniki

Stosowane procedury pokazują, że układ trawienny wron nie eliminuje zakaźności PrP^Res 4 godziny po doustnym zgłębniku mózgu trzęsawki⁷. Wszystkie dwadzieścia wron, które zostały pokryte materiałem PrP^Res, następnie przekazało materiał PrP^Res z kałem myszom. Chore myszy zidentyfikowano na podstawie objawów klinicznych trzęsawki myszy, a potwierdzenie choroby zakończono analizą Western blot.

Badanie czasu zatrzymywania materiału spożywanego przez wrony...

Dyskusja

Przedstawiono procedurę dokumentowania przejścia materiału PrP^Res przez układ pokarmowy wron. Użyliśmy konwencjonalnych metod, aby określić, czy wrony mają zdolność do przemieszczania materiału PrP^Res na obszary geograficzne wolne od choroby. Inni ocenili oporność PrP^Res na płyny trawienne przeżuwaczy^19-21 i gryzoni^22,23 , z których oba nie były w stanie go wyeliminować. Techniki te powinny być w przyszłości stosowane w odniesieniu do innych drapieżników^{24 ,}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RML szczep Chandler trzęsawka przystosowana do myszy	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 myszy	Hilltop Lab Animals
Wrony amerykańskie	dziko schwytane
Pióro/paciorkowiec	Invitrogen	15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Invitrogen	70011-044
Sonikator	Misonix
Proteinase-K roztwór	Roche	3115887001
Bufor ładujący	Invitrogen	NP0007 i 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% żel	Invitrogen	NP0342
Membrana Immobilon PVDF	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet homogenizator blendera	Braintree Scientific	BBX24B
2,3 mm Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe	Produkty BioSpec	11079125Z
Bar224 przeciwciało monoklonalne anty-PrP	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescencyjne	Millipore	WBKLS0500
G-box system dokumentacji żeli	Syngene