Wzbogacanie i oczyszczanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych TG30 i GCTM-2

Podsumowanie

Opisujemy użycie przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 do połączonego wykrywania antygenów powierzchniowych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do identyfikacji i wzbogacania żywych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą selekcji pozytywnej, a także użycie selekcji negatywnej do usuwania hESC z populacji komórek mieszanych.

Streszczenie

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mogą samoodnawiać się w nieskończoność in vitro, a przy odpowiednich sygnałach mogą być indukowane do różnicowania się w potencjalnie wszystkie linie komórek somatycznych. Zróżnicowane pochodne hESC mogą być potencjalnie stosowane w terapiach transplantacyjnych w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych komórek. Jednak protokoły różnicowania hESC zwykle dają mieszaninę zróżnicowanych typów komórek docelowych i niedocelowych, a także szczątkowych komórek niezróżnicowanych. Dla translacji zróżnicowanych pochodnych hESC z laboratorium do kliniki ważne jest, aby być w stanie rozróżnić komórki niezróżnicowane (pluripotencjalne) i zróżnicowane oraz opracować metody separacji tych populacji. Bezpieczne zastosowanie typów komórek somatycznych pochodzących z hESC można osiągnąć tylko w populacjach wolnych od pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ resztkowe hESC mogą po przeszczepie wywołać guzy zwane potworniakami. W tym celu opisujemy tutaj metodologię wykrywania antygenów powierzchniowych komórek związanych z pluripotencją za pomocą przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu identyfikacji pluripotencjalnych komórek TG30 Hi-GCTM-2 ^Hi hESC przy użyciu selekcji pozytywnej. Stosując selekcję negatywną z naszą metodologią TG30/GCTM-2 FACS, byliśmy w stanie wykryć i usunąć niezróżnicowane hESC w populacjach przechodzących bardzo wczesne stadium różnicowania (TG30 Neg-GCTM-2^Neg). W dalszym badaniu próbki zróżnicowane komórek Neg-GCTM-2 TG30^Neg wybrane przy użyciu naszego protokołu TG30 / GCTM-2 FACS nie tworzyły potworniaków po przeszczepieniu myszom z obniżoną odpornością, co potwierdza solidność naszego protokołu. Z drugiej strony, konsekwentne pasażowanie wzbogaconych pluripotencjalnych komórek macierzystych TG30^/ GCTM-2 Hi hESC za pośrednictwem TG30 / GCTM-2^FACS nie wpłynęło na ich zdolność do samoodnawiania się in vitro ani na ich wewnętrzną pluripotencję. W związku z tym charakterystyka naszej metodologii TG30/GCTM-2 FACS zapewnia czuły test w celu uzyskania wysoce wzbogaconych populacji hPSC jako danych wejściowych do testów różnicowania i usunięcia potencjalnie rakotwórczych (lub resztkowych) hESC z pochodnych populacji komórek.

Wprowadzenie

HPSC (hPSC) obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hIPSC). HPSC mogą samoodnawiać się w nieskończoność w odpowiednich warunkach hodowli bez utraty zdolności znanej jako "pluripotencja". Pluripotencja jest definiowana jako zdolność komórki do różnicowania się w zasadniczo dowolną linię komórek somatycznych, w tym komórki reprezentatywne dla każdej z trzech embrionalnych warstw komórek rozrodczych. Niezwykły potencjał hPSC zapewnia środki do szerokiej gamy zastosowań opartych na komórkach, w tym opcji terapeutycznych. Na przykład istnieją zaburzenia związane ze śmiercią i zwyrodnieniem komórek, w których normalna funkcjonalność komórek w ludzkim ciele jest zagrożona, jak w przypadku niewydolności serca, urazów kręgosłupa, cukrzycy, choroby Parkinsona, niektórych nowotworów i innych patologii klinicznych. Pacjenci cierpiący na te schorzenia mogą być potencjalnie leczeni poprzez przeszczepianie zdrowych i funkcjonalnych komórek somatycznych, które uzyskano z hPSC w laboratorium. Jednak obecne protokoły różnicowania hPSC nie są w 100% skuteczne i dają mieszaninę zróżnicowanych typów komórek docelowych i niedocelowych, a także resztkowe hPSC, które nie uległy różnicowaniu, zamiast tego kontynuują samoodnawianie^{się 1-3}. Obecność nawet niewielkiej liczby hPSC w próbce komórek somatycznych pochodzących z hPSC przeznaczonych do przeszczepienia pacjentom stanowi poważne ryzyko kliniczne, ponieważ komórki te, ze względu na swoją naturalną naturę tworzenia tkanek wszystkich trzech embrionalnych listków rozrodczych, mogą potencjalnie tworzyć in vivo rodzaj guza znanego jako potworniak. W związku z tym tylko docelowe populacje komórek, które zostały uznane za wolne od pluripotencjalnych komórek macierzystych, można uznać za bezpieczne do przeszczepu pacjentom. Istnieje kilka podejść, które mogą potencjalnie doprowadzić do usunięcia resztkowych hPSC po różnicowaniu (przegląd patrz Polanco i Laslett⁴). Wcześniej informowaliśmy o zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 sprzężonych z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) w celu identyfikacji pluripotencjalnych komórek macierzystych i odróżnienia ich od komórek przechodzących wczesny etap różnicowania w hodowlach linii^{hESC 5-7}.

Jedną z zalet używania przeciwciał do wykrywania antygenów na powierzchni komórki jest to, że komórki docelowe są zazwyczaj zdolne do życia po związaniu przeciwciał i/lub znakowaniu. W związku z tym komórki docelowe można pobrać po znakowaniu przeciwciałami i ponownie wyhodować w celu ekspansji i dalszych zastosowań przed przeszczepem. Jednym z zastrzeżeń dotyczących antygenów powierzchniowych komórek ulegających ekspresji w hPSC jest to, że nie występują one wyłącznie w stadium pluripotencjalnym i w wielu przypadkach ulegają reekspresji czasowej podczas rozwoju, a zatem zostaną wykryte w niektórych zróżnicowanych typach komórek. W związku z tym, jeśli celem jest wykorzystanie przeciwciał do wykrywania ludzkich komórek pluripotencjalnych i oczyszczenia ich z próbki komórek pochodzących z hPSC, wybrane przeciwciała nie powinny również reagować z antygenami na określonych zróżnicowanych typach komórek przeznaczonych do przeszczepienia. Niestety, istnieje ograniczona liczba przeciwciał, które wykrywają markery powierzchniowe komórek na żywych ^{hPSCs 4}, co ogranicza możliwości selekcji. Ponadto kilka badań wykazało, że wykrycie jednego markera na powierzchni komórki nie jest wystarczające do wyeliminowania wszystkich hPSC, co sugeruje, że każda próba wyeliminowania wszystkich subpopulacji pluripotencjalnych hPSC powinna opierać się na metodach wykorzystujących dwa lub więcej przeciwciał wykrywających różne epitopy wyrażane przez hPSC ^9-10. Jak wspomniano powyżej, tylko komórki pochodzące z hPSC, które można określić jako populacje komórek wolnych od pluripotencjalnych komórek macierzystych, są odpowiednie do przeszczepu u ludzi. Osiągnięcie tego poziomu rygorystyczności może nie zostać osiągnięte za pomocą pojedynczego przejścia przez technologię sortowania komórek za pośrednictwem przeciwciał. Ponowna hodowla wzbogaconej populacji zróżnicowanych komórek docelowych i kolejne rundy sortowania komórek mogą być wymagane w celu ostatecznego uzyskania próbek wolnych od pluripotencjalnych komórek macierzystych.

W naszym laboratorium szczegółowo scharakteryzowaliśmy dwa przeciwciała powierzchniowe hES, TG30 (CD9) i GCTM-2, do wykrywania żywych komórek pluripotencjalnych. Nasze badania wykazały, że łączne wykrycie zarówno TG30, jak i GCTM-2 silnie koreluje z ekspresją kanonicznych genów związanych z pluripotencją w liniach ^{hESC 5-7}. Immunoprofilowanie TG30/GCTM-2 FACS konsekwentnie wykazało, że hodowle hESC stanowią ilościowy ciągły gradient ekspresji TG30/GCTM-2 ^5-7. Arbitralnie ustaliliśmy cztery populacje (P) komórek w tym gradiencie TG30 / GCTM-2: P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^{Niski-GCTM-2 Niski}), P6 (TG30^{Mid-GCTM-2 Mid}) i P7 (TG30^{Hi-GCTM-2 Hi}) ^5-7. Nasza charakterystyka tych populacji komórek P4, P5, P6 i P7 wykazała, że podfrakcje P6 i P7 wyrażają dużą liczbę genów związanych z pluripotencją i efektywnie tworzą kolonie podobne do łodyg podczas rehodowli po FACS ^2-3. Z drugiej strony, komórki P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) wyrażają dużą liczbę markerów różnicowania i stanowią spontanicznie różnicowane typy komórek, które zwykle występują w rozszerzających się kulturach linii ^{hESC 5-6}. Zdecydowaliśmy się przetestować potencjał naszego TG30/GCTM-2 FACS do selektywnej eliminacji resztkowych hPSC po różnicowaniu we wczesnym stadium, a także do wzbogacania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych. Opisany poniżej protokół pokazuje, jak zbierać i rozmnażać zróżnicowane komórki P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) po FACS w celu oczyszczenia z pluripotencjalnego P7 (TG30 ^{Hi-GCTM-2 Hi}). Ponadto wyjaśniamy również pobieranie i rekulturację pluripotencjalnych komórek P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) w celu uzyskania wzbogaconej kultury komórek pluripotencjalnych, które można następnie wykorzystać jako zdefiniowaną populację wejściową w celu potencjalnego zwiększenia wydajności i spójności testów różnicowania.

Protokół

Następujący protokół został przeprowadzony przy użyciu¹¹ standardowych masowych kultur hESC-MEL1 dostarczonych przez ośrodek StemCore na Uniwersytecie Monash (Melbourne). Ta linia komórkowa jest rutynowo hodowana na warstwie mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) w pożywkach hESC/KOSR uzupełnionych bFGF⁷ i jest utrzymywana z dysocjacją enzymatyczną (kolagenaza) co 5-7 dni⁸. Kultury hESC wyhodowane do ~80% konfluencji w kolbach o średnicy 75^cm2 (T75) są używane jako populacje wejściowe dla tego protokołu. Wszystkie opisane poniżej procedury manipulacji komórkami powinny być wykonywane w warunkach aseptycznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z filtrem HEPA.

Dwa dni przed wykonaniem testu FACS TG30/GCTM-2, przygotuj płytki hodowlane T75 (opisane w sekcji 1), które mają być użyte do rekultury komórek odzyskanych po FACS (opisane w sekcji 4).

1. Wysiewanie MEF-ów i przygotowanie podłoża kondycjonowanego MEF

1.1 DZIEŃ -2: Posiewanie MEF-ów do kolb T75

1. Odpipetować 10 ml 0,1% w/v żelatyny do każdej kolby T75 i przechylić, aby równomiernie pokryć powierzchnię.
2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Odessać roztwór żelatyny.
4. Dodać 20 ml pożywki MEF do kolby i wstępnie zrównoważyć do 37 °C/5% CO₂ przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
5. Mitotycznie inaktywowane MEF-y należy rozmieścić na przygotowanej kolbie (kolbach) o następującej gęstości. Dla nasion o gęstości 1/3 MEF: 1,4 x 10,⁴ komórki/^cm2 (T75 = 1 x 10,⁶ MEF). Dla nasion MEF o pełnej gęstości 5,3 x 10⁴ komórki/^cm2 (T75 = 4 x 10⁶ MEF).

Uwaga: Rutynowo używamy MEF-ów, które zostały mitotycznie dezaktywowane przez γ-napromieniowanie. Protokół przygotowania MEF-ów napromieniowanych γ znajduje się przy ul. Michalskiej¹².

6. Inkubować napromieniowane kultury MEF w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 przez} noc. Kolby 1/3 można inkubować przez 1-4 dni bez zmiany pożywki MEF. Kolby te są używane do ponownego powlekania komórek post-FACS (jak w protokole 4). Pełne kolby MEF inkubuje się przez noc w celu wytworzenia CM, jak pokazano poniżej w kroku 1.2.

1.2 DZIEŃ -1: Przygotowanie pożywki kondycjonowanej MEF (CM)

1. Odessać pożywkę MEF z pełnych kolb MEF T75.
2. Dodać wstępnie zbalansowaną pożywkę o stężeniu 25 ml hESC/KOSR uzupełnioną 5 ng/ml ludzkiego FGF-2 na kolbę T75. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 godziny.
3. Zebrać pożywkę kondycjonowaną MEF (CM) do sterylnej probówki do hodowli tkankowej, świeżo uzupełnić CM 10 ng / ml ludzkiego FGF-2 i przefiltrować za pomocą filtra polieterosulfonowego 0,22 μm.
4. Aby wytworzyć dodatkową CM, powtarzaj kroki 1.2.2 i 1.2.3 codziennie na tej samej kulturze MEF przez jeden tydzień.

W dniu wykonywania testu TG30/GCTM-2, zamień pożywkę MEF w 1/3 kolbach MEF T75 na CM i wstępnie zrównoważ przez co najmniej 30 minut przed wysiewem jakichkolwiek komórek hESC lub pochodnych hESC odzyskanych z procedury opisanej poniżej. CM stosuje się w stanie świeżym lub przechowuje się w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. CM jest używany w tym protokole, ponieważ w naszych rękach zwiększa żywotność komórek po FACS w porównaniu z pożywkami niekondycjonowanymi (wyniki nie pokazane).

2. Przeprowadzanie testu FACS TG30/GCTM-2: dysocjacja masowych kultur hESC na pojedyncze komórki

Uwaga: Wstępnie schłodzić 20% medium FBS/DMEM-F12 w temperaturze 4 °C.

1. Odessać pożywkę hESC/KOSR z dwóch kolb T75 z linią hodowlaną hESC.
2. Przepłucz komórki w każdym T75 10 ml DPBS i odessaj w celu usunięcia.
3. Dodać 3 ml roztworu dysocjacyjnego TrypLE Express do każdej kolby T75. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 5 minut.
4. Uderzyć w bok kolb, aby uzyskać całkowite usunięcie komórek. Sprawdź pod mikroskopem. Jeżeli komórki nie ulegają łatwemu przemieszczaniu się, inkubować przez kolejne 2–3 minuty w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
5. Dodać 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (utrzymywanego w temperaturze 4 °C) do każdej kolby T75. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml delikatnie rozcierać zdysocjowane komórki kilkakrotnie o ściankę kolby, aby uzyskać zawiesinę z przewagą pojedynczych komórek.
6. Umieść sitko o pojemności 70 μm na sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml przepuścić przez sitko zawiesiny pojedynczych komórek hESC zebrane z dwóch kolb T75.
7. Odrzucić sitko do komórek, założyć pokrywkę probówki i odwirować zbiorczą zawiesinę hESC o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
8. Odrzucić supernatant i umyć komórki, delikatnie ponownie zawieszając osad w 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (wstępnie schłodzony w temperaturze 4 °C).
9. Przeprowadzić drugie odwirowanie przy 1 000 x g przez 2 minuty.
10. Odrzucić supernatant, dodać 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (schłodzonego w temperaturze 4 °C) i delikatnie rozprowadzić w celu ponownego zawieszenia komórek. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie. Ta probówka będzie używana do procedury barwienia immunologicznego Sortuj próbkę opisaną poniżej.
11. Pobrać 20 μl zawiesiny pojedynczej komórki hESC (krok 2.10) do zliczania liczby komórek za pomocą hemocytometru. Należy spodziewać się wydajności 10-15 milionów komórek na kolbę T75.

Uwaga: FBS jest używany w tej części protokołu w celu zwiększenia żywotności komórek po FACS.

3. Barwienie immunofluorescencyjne antygenów powierzchniowych komórek TG30 i GCTM-2

1. Podwielokrotność 150 μl (~100 000 komórek) zawiesiny pojedynczej komórki hESC (od kroku 2.11) do każdej z sześciu probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Te sześć podwielokrotności zostanie wykorzystanych do kontroli barwienia wymaganych do kalibracji testu na maszynie FACS. Pozostała ~ 9 ml zawiesiny komórek będzie próbką sortowania, w której zdysocjowana kultura zostanie wybarwiona w celu wykrycia TG30 i GCTM-2, zgodnie z tabelami 1 i 2.
2. Przeprowadzaj reakcje wiązania przeciwciał pierwszorzędowych w 20% FBS/DMEM-F12. Końcowe objętości reakcji powinny wynosić ~9 ml dla próbki sortującej i 200 μl dla prób kontrolnych. Uwzględnij kontrole izotypu jako przeciwciała pierwszorzędowe. Umieść rurki poziomo na lodzie i delikatnie mieszaj przez 30 minut na bujanej platformie.
3. Odwirować reakcje przeciwciał pierwotnych przy 1 000 x g przez 2 min.
4. Odrzucić supernatant i przemyć komórki, ponownie zawieszając osad w 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (wstępnie schłodzonym w temperaturze 4 °C) dla próbki sortującej i 200 μl dla prób kontrolnych.
5. Wykonaj drugi wir przy 1 000 x g przez 2 minuty.
6. Przeprowadzaj reakcje wiązania przeciwciał drugorzędowych w 20% FBS/DMEM-F12. Końcowa objętość reakcji powinna wynosić 2,5 ml dla próbki sortującej i 200 μl dla prób kontrolnych. Na tym etapie należy przygotować probówkę reakcyjną PE-anti-mouse CD90.2. Umieść rurki poziomo na lodzie i delikatnie mieszaj przez 30 minut na bujanej platformie.

Uwaga: Podczas tego czasu inkubacji, wygodnie jest zebrać CM i przygotować 1/3 kolb MEF T75 z CM, jak w sekcji 1.2.

7. Odwirować wtórne reakcje przeciwciał przy 1 000 x g przez 2 min.
8. Odrzucić supernatant i umyć komórki DWUKROTNIE, ponownie zawieszając osad w 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (wstępnie schłodzony w temperaturze 4 °C) dla próbki sortującej i 200 μl dla prób kontrolnych.
9. Wiruj przy 1,000 x g przez 2 minuty po każdym myciu i umieść rurki na lodzie.
10. Odrzuć supernatanty i ponownie zawieś granulki komórkowe w 20% FBS/DMEM-F12 uzupełnionym jodkiem propydyny (PI) w stężeniu 0,3 μg/ml. Użyj 2-3 ml dla próbki sortującej i 300 μl dla kontroli.

Uwaga: NIE dodawaj PI do probówki kontrolnej z niezabarwionymi komórkami.

11. Użyj mikropipety P1000, aby przecisnąć zawiesinę każdej pojedynczej komórki przez sitko do komórek z pokrywką 35 μm, sprzężone z probówkami z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem.
12. Odwirować z prędkością 50 g/min, aby przecisnąć zawiesinę resztek komórek na pokrywkach sitka.
13. Zawiesić każdą zawiesinę z pojedynczą komórką, stukając w boki probówek, i umieścić na lodzie. Twoje komórki są teraz gotowe do FACS. Proszę przejść od razu.

4. Posiewka komórek podfrakcji TG30/GCTM-2 po FACS w kolbach o średnicy 75^cm2 (T75)

1. Wcześniej informowaliśmy, jak skonfigurować maszynę FACS do immunoprofilowania TG30/GCTM-2⁷. Procedura pozwala na odzyskanie żywotnych pojedynczych hESC, wolnych od MEF i w obrębie bramek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30 ^{Low-GCTM-2 Low}), P6 (TG30^{Mid-GCTM-2 Mid}) i P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) - patrz rysunek 1E. Skonfiguruj maszynę FACS dla TG30/GCTM-2 FACS, tak jak w naszym poprzednim raporcie, aby odzyskać podfrakcje komórek, które mają być użyte w następnej kolejności.
2. Dodać 1 ml CM, przygotowany jak w kroku 1.2, do każdej z dwóch 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych przed pobraniem komórek z maszyny FACS. Ułóż na lodzie.
3. Odzyskaj 400 000 komórek każda ze zróżnicowanych podfrakcji komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) i pluripotencjalnych P7 (TG30 ^{Hi-GCTM-2 Hi}) za pomocą TG30 / GCTM-2 FACS.
4. Odwirować probówki zbiorcze o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
5. Odessać supernatanty. Dodać 1 ml wstępnie przygotowanej dawki o temperaturze 37 °C/5% CO₂ CM w celu ponownego zawieszenia każdej komórki za pomocą mikropipetora P1000. Wysiewać komórki dla każdej frakcji na wstępnie zrównoważoną kolbę 1/3 MEF T75 z CM (przygotowaną zgodnie z krokiem 1.2)
6. Hodowla w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.
7. Odsysaj CM codziennie i zastępuj świeżo przygotowanym CM (jak w kroku 1.2) przez około dwa tygodnie. Hodowle pluripotencjalnych komórek P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) wykazują ludzkie kolonie macierzyste po tygodniu i osiągają ~80% konfluencji po 9-11 dniach. Hodowle komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) rosną głównie jako trawnik komórek podobnych do fibroblastów, który osiąga zbieg po 11-13 dniach. Na tym etapie, jeśli jest to wymagane, hodowle komórkowe P4 i P7 można zastosować do sekwencyjnej rehodowli za pośrednictwem TG30 / GCTM-2 FACS podfrakcji P4 lub P7 (patrz rysunki 2 i 3).

Wyniki

pochodne hESC, które są wolne od pluripotencjalnych komórek macierzystych, mogą być otrzymywane przez kolejne pasażowanie komórek z podfrakcji P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg).

Poprzednie raporty wykazały, że w standardowych kulturach hESC współistnieje mieszanina subpopulacji, wykazująca gradient ekspresji genów związanych z pluripotencją^5,6,13. Połączone wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek, takich jak TG30 (CD9) i GCTM-2, pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów komórek na etapie pluripotencjalnym i na różnych etapach wczesnego różnicowania, na co wskazuje ich ekspresja markerów komórek macierzystych i czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii^5,6,13. Zgodnie z poprzednimi raportami, byliśmy w stanie rozróżnić komórki P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^{Low-GCTM-2 Low}), P6 (TG30^{Mid-GCTM-2 Mid}) i P7 (TG30^{Hi-GCTM-2 Hi}) w linii hESC-MEL1 użytej w tym badaniu (Figura 1). Dzięki temu wynikowi przystąpiliśmy do zbierania zróżnicowanych komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) i pluripotencjalnych komórek P7 (TG30 ^{Hi-GCTM-2 Hi}) do dalszej hodowli w badaniach opisanych poniżej.

Zbadaliśmy, czy za pomocą negatywnej selekcji możemy usunąć niezróżnicowane hESC z populacji komórek przechodzących bardzo wczesne stadium różnicowania (TG30 Neg-GCTM-2^Neg). Użyliśmy zdefiniowanej liczby komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg), które były kolejno hodowane po FACS (Figura 2A) przez około dwa tygodnie i ponownie analizowane przy użyciu TG30 / GCTM-2 FACS przed ponownym posiewem w każdym pasażu. Wyniki wykazały, że subfrakcja P4 wzbogacona o TG30 Neg-GCTM-2^Neg różnicowała typy komórek po kolejnym pasażowaniu, a niewielka obecność komórek P7 (TG30^{Hi-GCTM-2 Hi}) w początkowym pasażu (Figura 2A, Pasaż 1) ostatecznie zniknęła po dalszym pasażowaniu, stając się pluripotencjalnymi próbkami wolnymi od komórek macierzystych (Figura 2A, Przejście 3).

Wzbogacenie pluripotencjalnych komórek hESC można osiągnąć poprzez zebranie komórek TG30 Hi-GCTM-2 ^Hi.

Na podstawie wcześniejszych obserwacji przy użyciu tego testu, spodziewalibyśmy się wzbogacenia pluripotencjalnych komórek hESC poprzez zebranie komórek P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi), które powinny tworzyć kolonie hESC. Dlatego zbadaliśmy również sekwencyjne pasażowanie pluripotencjalnych komórek P7 (TG30^/ GCTM-2 Hi) za pośrednictwem TG30 / GCTM-2^FACS. W tych hodowlach P7 przeprowadzono immunoprofilowanie TG30 / GCTM-2 FACS przed ponownym posiewem komórek przy każdym pasażu i tylko komórki P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) zostały ponownie wyhodowane. W ten sposób zaobserwowaliśmy, że większość komórek znajdowała się w podfrakcjach związanych z pluripotencją (P6 i P7), co wskazuje na wzbogacenie komórek pluripotencjalnych, które również zachowały zdolność do różnicowania się i generowania niewielkiego procentu komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) (Figura 3A). Co więcej, hodowle komórek P7 wykazały dużą liczbę kolonii podobnych do hESC podczas pasażowania (Figura 3B), co również wskazuje na utrzymanie stanu pluripotencji.

Rysunek 1. Reprezentatywna strategia sortowania w celu uzyskania podfrakcji TG30/GCTM-2 FACS. (A): Zdysocjowane zawiesiny komórek hES są sortowane jako pojedyncze komórki, a potencjalne grudki lub dublety są bramkowane za pomocą rozproszenia do przodu dla wysokości i powierzchni (FSC-H i FSC-A). oraz Potencjalne zanieczyszczenia są usuwane za pomocą FSC-A i SSC-A, a tylko nienaruszone komórki są dalej sortowane. c): Komórki niezdolne do życia są wykluczane na podstawie fluorescencji jodku propidyny (PI) (FSC-A i FL3-A). D): Komórki zasilające MEF bramkowano przez selekcję negatywną na podstawie ekspresji mysiego CD90.2-PE (FL2-A i SSC-A). E): Wyizolowana żywotna frakcja hESC, wolna od nośników MEF, jest ostatecznie frakcjonowana na subpopulacje P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^{Low-GCTM-2 Low}), P6 (TG30^{Mid-GCTM-2 Mid}) i P7 (TG30^{Hi-GCTM-2 Hi}). Bramka ujemna (TG30 Neg-GCTM-2^Neg, nazwana P4) została ustawiona zgodnie z autofluorescencją tła dla niebarwionych komórek, a także dla kontroli izotypu. F): Procenty różnych bramkowanych subpopulacji typowych dla analizy cytometrii przepływowej TG30/GCTM-2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Reprezentatywne kolejne hodowle spontanicznie różnicujących się komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) z linii hESC-MEL1. (A): Reprezentatywne wykresy FACS TG30 / GCTM-2 przedstawiające bramkowane podzbiory komórek (P4, P5, P6 i P7) rozróżniane przez poziom wykrytej ekspresji markerów powierzchniowych komórek TG30 i GCTM-2. Początkową populację 400 000 pochodnych hESC wykazujących immunoprofilowanie P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) pobiera się z masowych kultur linii hESC-MEL1. Te komórki P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) są kolejno pasażowane po FACS w warunkach sprzyjających odnowie hESC w kolbach T75, aż do osiągnięcia konfluencji (11-13 dni). Przed każdym pasażem wykonuje się TG30 / GCTM-2 FACS w celu zebrania i rehodowli tylko zróżnicowanych typów komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg). oraz Typowa morfologia trawnika zróżnicowanych komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) po 14 dniach. c): Sporadyczne kolonie podobne do hESC obserwowane po 14 dniach zmieszane z trawnikiem komórek P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg) tylko w pasażu 1, są najprawdopodobniej generowane przez zanieczyszczenie komórek P7 (TG30 ^{Hi-GCTM-2 Hi}). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby powiększyć rysunek.

Rysunek 3. Komórki P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) pochodzące z linii hESC mogą być kolejno pasażowane po FACS bez utraty swoich wewnętrznych właściwości pluripotencjalnych. Reprezentatywne immunoprofilowanie TG30 / GCTM-2 FACS różnych kolejnych pasaży, pokazujące dyskryminowane podzbiory komórek (P4, P5, P6 i P7) w zależności od poziomu ekspresji TG30 i GCTM-2. ZA: Wyjściowa populacja 400 000 komórek wykazujących cechy P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) jest pobierana z masowych kultur linii hESC-MEL1. Pluripotencjalne komórki P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) są kolejno pasażowane po FACS w warunkach sprzyjających odnowie hESC w kolbach T75, aż do osiągnięcia ~80% konfluencji (9-11 dni). Immunoprofilowanie TG30/GCTM-2 FACS przeprowadza się przed ponownym posiewem komórek przy każdym pasażu i rehodowli poddawane są tylko komórki P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi). Wyniki pokazują, że komórki P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) zachowują swoje cechy pluripotencjalne z późniejszym pasażowaniem, w tym zachowaniem ekspresji (TG30^{Hi-GCTM-2 Hi}), tworząc kolonie podobne do hESC (pokazane w B) i utrzymując zdolność do różnicowania, co można wywnioskować z rekapitulacji niewielkiej frakcji zróżnicowanego P4 (TG30^{Neg-GCTM-2 Neg}) w każdym z gradientów FACS. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Próbka (objętości reakcyjne) Przeciwciało pierwszorzędowe Przeciwciało drugorzędowe PE Szczur Anty-Myszy CD90.2 ^b Jodek propidyny ^c Sortowanie próbki (~9 ml dla pierwotnych ABs, 2,5 ml dla wtórnych ABs) (TG30 + GCTM-2)^a AF 488 koza anty-mysia IgG2a + AF 647 koza anty-mysia IgM + + Kontrola-1: TG30 (200 μl) TG30 powiedział: AF 488 koza anty-mysia IgG2a - + Kontrola-2: GCTM-2 (200 μl) GCTM-2 powiedział: AF 647 kozia anty-mysia IgM - + Control-3: Anty-mysz CD90.2 (200 μl) - - + + Kontrola-4: Fikoerytryna (PE) (200 μl) Izotyp IgG2a myszy R-fikoerytryna kozła anty-mysia IgG2a - + Kontrola-5: Izotyp immunoglobuliny myszy (200 μl) Izotyp IgG2a myszy + izotyp IgM AF 488 koza anty-mysia IgG2a + AF 647 koza anty-mysia IgM - + Kontrola-6: Niebarwione komórki (200 μl) - - - -

Tabela 1. Sortowanie próbki i kontrolek do sortowania FACS. ^ZAPróbka sortowania jest barwiona immunologicznie jednocześnie przeciwciałami TG30 i GCTM-2. ^bPE-anti-mouse CD90.2 służy do rozpoznawania komórek myszy i usuwania MEF z hESC podczas FACS¹⁴. ^cKomórki niezdolne do życia są wykluczane za pomocą jodku propidyny w końcowym stężeniu 0,3 μg/ml. Odczynnik dodany (+), nie dodany (-) do probówki reakcyjnej.

przeciwciało gospodarz Izotypu Rozcieńczenie robocze TG30 (1,4 mg/ml) mysz IgG2a 1:1,000 GCTM-2 (supernatant hybrydoma) mysz Igm 1:5 ~ 1:10 ^A AF 488 koza anty-mysia IgG2a koza Poliklonalny 1:500 AF 647 kozia anty-mysia IgM koza Poliklonalny 1:500 R-fikoerytryna (PE) koza anty-mysia IgG2a koza Poliklonalny 1:1,000 Anty-mysz CD90.2 szczur IgG2b 1:100 Oczyszczona mysia IgG2a, kontrola izotypu κ mysz IgG2a 1:200 jedn. Oczyszczona mysia IgM, kontrola izotypu κ mysz Igm 1:200 jedn.

Tabela 2. Szczegóły przeciwciał i rozcieńczenia do sortowania FACS. ^a Ze względu na niezwykle wysoką ekspresję GCTM-2 na powierzchni komórek hESC nie jest możliwe osiągnięcie nasycenia tym przeciwciałem. Każda partia supernatantu hybrydomy GCTM-2 musi być miareczkowana względem wzorcowej kontroli lub poprzedniej partii, aby uzyskać podobne wyniki z hESC w skali i aby uniknąć nadmiernego barwienia.

Nazwa medium kompozycja Pożywka hESC/KOSR Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco: Mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) uzupełniona o 20% zamiennik surowicy nokautującej (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% aminokwasów nieistotnych MEM, 0,1 mM 2-merkaptoetanolu, 10 ng / ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2) i Pen / Strep w dawce 1x. Średni MEF Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoki poziom glukozy (DMEM) uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM GlutaMAX i Pen/Strep w 1x.

Tabela 3. Skład pożywek hodowlanych.

Dyskusja

W kontekście klinicznym zróżnicowane typy komórek somatycznych są końcowym pożądanym produktem do przeszczepów i zastosowań terapeutycznych, a hPSC są samoodnawiającym się i skalowalnym źródłem do wytwarzania tych komórek somatycznych lub ich komórek progenitorowych w laboratorium. Obecność resztkowych niezróżnicowanych komórek macierzystych hESC z nieodłącznym potencjałem do tworzenia potworniaków stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa przy rozważaniu przeszczepu komórek somatycznych pochodzących z hESC u pacjentów. Aby zapoznać się z przeglądem tego i innych zagrożeń związanych z terapią komórkową, zobacz Sharpe i wsp.¹⁶ W związku z tym, aby zrealizować takie zastosowania, konieczne jest, aby naukowcy dążyli do wygenerowania docelowych populacji komórek, które są również wolne od pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym celu pokazujemy tutaj, że przy użyciu naszej metodologii FACS TG30/GCTM-2 możliwe jest monitorowanie obecności komórek pluripotencjalnych (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) w różnicującej się populacji komórek i uzyskanie żywotnych pochodnych różnicowanych pod kątem hESC, które można wzbogacić i ponownie wyhodować po FACS. Chociaż nie jest możliwe uzyskanie w 100% pluripotencjalnych próbek wolnych od komórek macierzystych za pomocą jednego przejścia naszego protokołu, wzbogacone pochodne hESC mogą być rehodowane i po kolejnym pasażowaniu osiąga się 100% czystość komórek somatycznych. Wykazana zdolność komórek somatycznych do ekspansji po FACS potencjalnie pozwala również na wytworzenie odpowiedniej liczby komórek odpowiednich do potencjalnych terapii transplantacyjnych.

Zachęcające wyniki tego badania pilotażowego skłoniły nas do przeprowadzenia bardziej kompleksowego badania przy użyciu naszego protokołu TG30 / GCTM-2 w badaniu porównawczym z kilkoma liniami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)¹⁵. W tym badaniu stwierdziliśmy, że próbki wolne od pluripotencjalnych komórek macierzystych uzyskane przy użyciu naszego protokołu TG30 / GCTM-2 FACS nie generowały potworniaków po przeszczepieniu myszom pozbawionym odporności. Dlatego możemy śmiało stwierdzić, że przy zastosowaniu tego protokołu in vitro hodowle komórkowe różnicowania we wczesnym stadium, które zostały uznane za wolne od pluripotencjalnych komórek TG30 Hi-GCTM-2^Hi, nie rozwijają potworniaków in vivo. To zdecydowanie potwierdza solidność naszego testu, zapewniając potencjalne podejście do wyeliminowania ryzyka powstania potworniaka przed użyciem komórek pochodzących z hPSC w zastosowaniach klinicznych.

I odwrotnie, pokazujemy również, że test TG30 / GCTM-2 FACS może być używany do pobierania populacji komórek pluripotencjalnych o wysokim poziomie ekspresji tych dwóch antygenów powierzchniowych (TG30 Hi-GCTM-2^Hi). Wcześniejsze badania wykazały, że komórki ^Hi TG30^Hi-GCTM-2 wykazują najwyższą korelację z ekspresją^{OCT4 hi} i tworzą największą liczbę kolonii podobnych do hESC^5,6,13,15. Dlatego uważamy, że sieć pluripotencji jest aktywowana na maksymalnych poziomach w komórkach wykazujących ekspresję TG30 Hi-GCTM-2^Hi. Uważamy, że użycie naszego protokołu TG30/GCTM-2 FACS i pobranie komórek P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi) może pozwolić na oczyszczanie na dużą skalę wzbogaconych żywych kultur hESC, jako danych wejściowych do testów różnicowania.

Podsumowując, wykazujemy tutaj potencjał naszych testów FACS opartych na połączonej ekspresji antygenów powierzchniowych TG30 i GCTM-2 zarówno do oczyszczania, jak i wzbogacania hESC. Przyszłe badania z protokołami ukierunkowanego różnicowania hPSC prawdopodobnie również dostarczą informacji na temat tego potencjału. Zdajemy sobie sprawę, że w niektórych testach, w których zróżnicowane pochodne hESC wykazują czasową ekspresję TG30 (CD9) lub GCTM-2, te dwa przeciwciała mogą nie być odpowiednie lub wystarczające do usunięcia komórek pluripotencjalnych ze zróżnicowanej populacji w określonym punkcie czasowym testu⁶. W związku z tym istnieje ciągła potrzeba znalezienia nowych przeciwciał, które specyficznie rozpoznają żywe hESC, aby przezwyciężyć możliwe ograniczenie reakcji krzyżowej z niektórymi zróżnicowanymi typami komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Długa nazwa: Zmodyfikowany orzeł Dulbecco Pożywka: Mieszanka składników odżywczych F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Długa nazwa: Zamiennik serum do nokautu
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Długa nazwa: Suplement GlutaMAX
Aminokwasy endogenne	Technologies	11140050	Długa nazwa: Roztwór aminokwasów endogennych MEM
Merkaptoetanol	Life Technologies	21985023	Długa nazwa: 2-merkaptoetanol
DPBS	Life Technologies	14190250	Długa nazwa: Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Długa nazwa: TrypLE Express (1x), bez czerwieni fenolowej
AF-488	Life Technologies	A21131	Długa nazwa: Alexa Fluor 488 koza anty-mysz IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Długa nazwa: Alexa Fluor 647 koza anty-mysia IgM
PE-anty IgG2a	Life Technologies	P21139	Długa nazwa: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ 2a) Sprzężony
DMEM	Life Technologies	11965-092	Długa nazwa: Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoki poziom glukozy
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Długa nazwa: Penicylina-Streptomycyna, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Długa nazwa: sterylna woda destylowana
PI	SIGMA	P4864	Długa nazwa: Roztwór jodku propidyny
FBS	SIGMA	12203C	Długa nazwa: Żelatyna w surowicy bydlęcej płodu
	SIGMA	G-1890	Długa nazwa: Żelatyna ze skóry świni
Ludzki FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Długa nazwa: Czynnik wzrostu fibroblastów podstawowy, rekombinowany przez człowieka, wolny od zwierząt
Filtr 0,22 i mu; m	Millipore	SCGPU02RE	Długa nazwa: Stericup-GP, 0.22 μ M, polieterosulfon, 250 ml, sterylizowany radioaktywnie
70 μ m Sitko komórkowe	Becton Dickinson	352350	Długa nazwa: Sitko komórkowe z 70 μ m Siatka nylonowa
35 μ m Sitko do komórek z pokrywką, tubka 5 ml	Becton Dickinson	352235	Długa nazwa: 5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem, z nasadką sitka do komórek (35 μ m)
5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem	Becton Dickinson	352054	Długa nazwa: 5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem, sterylna
kontrola izotypu IgG2a	Becton Dickinson	554126	Długa nazwa: Oczyszczona mysz IgG2a, κ Kontrola izotypu
IgM Kontrola izotypu	Becton Dickinson	553472	Długa nazwa: Oczyszczona mysz IgM, κ Kontrola izotypu
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Długa nazwa: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-pikowa kalibracja	Becton Dickinson	559123	Długa nazwa: Tęczowe cząstki kalibracyjne (8 pików)
50 ml sterylna probówka polipropylenowa	Greiner Bio-One	227261	Długa nazwa: 50 ml Probówka polipropylenowa ze stożkowym dnem, sterylna
kolba T75	Greiner Bio-One	658175	Długa nazwa: Hodowla komórkowa nasadki filtracyjnej< 75 cmsup>2 Kolby
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Długa nazwa: Przeciwciało TG30, klon TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Długa nazwa: GCTM-2 nie jest dostępny na rynku, ale TG343 i równoważne przeciwciało monoklonalne to
Tabela 4. Lista materiałów i odczynnika
Maszyna FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE z opcją FACSDiva
Mikroskop odwrócony	Olympus		IX71
Tabela 5. Lista wyposażenia.