Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Podsumowanie

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Streszczenie

W naturze bakterie rzadko występują w izolacji; zamiast tego są otoczone przez różnorodny wachlarz innych mikroorganizmów, które zmieniają lokalne środowisko poprzez wydzielanie metabolitów. Metabolity te mają potencjał do modulowania fizjologii i różnicowania swoich mikrobiologicznych sąsiadów i są prawdopodobnie ważnymi czynnikami w tworzeniu i utrzymywaniu złożonych społeczności drobnoustrojów. Opracowaliśmy badanie przesiewowe kokultury oparte na fluorescencji, aby zidentyfikować takie chemiczne interakcje mikrobiologiczne. Badanie przesiewowe polega na połączeniu fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego z mikroorganizmami środowiskowymi na pożywkach stałych i umożliwieniu koloniom wzrostu w kokulturze. Fluorescencyjny reporter transkrypcyjny jest zaprojektowany w taki sposób, aby wybrany szczep bakteryjny fluoryzował, gdy wyraża określony fenotyp zainteresowania (tj. tworzenie biofilmu, zarodnikowanie, produkcja czynnika wirulencji itp.) Badania przesiewowe przeprowadza się w warunkach wzrostu, w których ten fenotyp nie ulega ekspresji (a zatem szczep reporterowy jest zazwyczaj niefluorescencyjny). Kiedy mikrob środowiskowy wydziela metabolit, który aktywuje ten fenotyp, dyfunduje on przez agar i aktywuje fluorescencyjny konstrukt reporterowy. Pozwala to na wykrycie drobnoustrojów wytwarzających metabolity indukujące: są to kolonie niefluorescencyjne najbardziej proksymalne do kolonii fluorescencyjnych. W ten sposób ekran ten umożliwia identyfikację drobnoustrojów środowiskowych, które wytwarzają dyfuzyjne metabolity, które aktywują określoną odpowiedź fizjologiczną w szczepie reporterowym. W niniejszej publikacji omówiono, jak: a) wybrać odpowiednie warunki przesiewowe kokultury, b) przygotować drobnoustroje reporterowe i środowiskowe do badań przesiewowych, c) przeprowadzić badanie przesiewowe kokultury, d) wyizolować przypuszczalne organizmy indukujące oraz e) potwierdzić ich aktywność w badaniu przesiewowym wtórnym. Opracowaliśmy tę metodę do badań przesiewowych w poszukiwaniu organizmów glebowych, które aktywują wytwarzanie matrycy biofilmu u Bacillus subtilis; Omawiamy jednak również kwestie związane z zastosowaniem tego podejścia do innych genetycznie podatnych bakterii.

Wprowadzenie

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, jak metabolity wydzielane przez bakterie wpływają na fizjologię i rozwój sąsiednich mikrobów. Wiele metabolitów zostało scharakteryzowanych ze względu na ich bioaktywne działanie na inne drobnoustroje. Dwa dobrze opisane przykłady obejmują antybiotyki, które hamują rozwój innych drobnoustrojów, oraz cząsteczki quorum sensing, które zmieniają globalną ekspresję genów innych drobnoustrojów. Jednak bakterie wytwarzają wiele innych małocząsteczkowych produktów naturalnych, które nie mają znanej bioaktywności¹. Stawiamy hipotezę, że bakterie wyewoluowały i zachowały zdolność do wytwarzania niektórych z tych metabolitów, ponieważ pozwalają im one modulować fizjologię komórkową swoich mikrobiologicznych sąsiadów w złożonych społecznościach drobnoustrojów, w których występuje większość bakterii.

Typy komórek Bacillus subtilis

Skupiliśmy nasze badania na chemicznie zapośredniczonych interakcjach mikrobiologicznych z udziałem Bacillus subtilis. Dzieje się tak nie tylko ze względu na jej status jako bakterii modelowej Gram-dodatniej i wynikające z tego narzędzia genetyczne dostępne do jej manipulacji, ale także ze względu na jej zdolność do różnicowania się w scharakteryzowane typy komórek. Przykłady obejmują komórki, które są: pływanie; wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest niezbędna do tworzenia silnego biofilmu; zdolne do pobierania DNA ze środowiska; i zarodnikowanie m.in.². Każdy z tych typów komórek wyraża charakterystyczny regulon transkrypcyjny, który sprawia, że różnią się fizjologicznie i/lub fizycznie od swojego genetycznie identycznego rodzeństwa. W wielu warunkach wzrostu wiele typów komórek współistnieje jako różne subpopulacje w obrębie jednej kolonii komórek B. subtilis ³. Chociaż wiele gatunków bakterii może wykazywać analogiczną niejednorodność typów komórek, zjawisko to zostało szczególnie dobrze zbadane w przypadku B. subtilis.

W szczególności zidentyfikowano geny, które są regulowane w górę w każdym z tych specyficznych typów komórek B. subtilis. Identyfikacja takich podwyższonych genów jest niezbędna dla opisanej tutaj pracy, ponieważ wiele z tych interesujących fenotypów mikrobiologicznych jest trudnych lub niemożliwych do bezpośredniego zaobserwowania. Na przykład nie możemy wizualnie wykryć takiej cechy, jak pływanie na stałych (1,5%) płytkach agarowych, mimo że subpopulacja komórek B. subtilis wytwarza wici w tych warunkach³. Innym przykładem jest produkcja matrycy biofilmu. Produkcja macierzy może być wizualizowana przez morfologię kolonii (ponieważ skutkuje makroskopowo pomarszczonymi koloniami), ale tylko na określonej pożywce wzrostowej i tylko po wielu dniach wzrostu⁴. Jednak wiedząc, które geny są regulowane w górę podczas różnicowania, możemy skonstruować reportery transkrypcyjne, które działają jako markery różnicowania komórkowego w tych typach komórek.

Konstrukcje reporterskie

Te fluorescencyjne reportery transkrypcyjne składają się z promotorów genów specyficznych dla typu komórki, które napędzają produkcję genu reporterowego, na przykład białka fluorescencyjnego. Przykłady obejmują P_hag-yfp (dla komórek pływających), P_tapA-yfp (dla komórek wytwarzających macierz biofilmu) i P_sspB-yfp (dla komórek zarodnikujących), gdzie P_x oznacza region promotora dla genu x. Te konstrukty reporterowe są zintegrowane z neutralnym locus na chromosomie (ryc. 1 i patrz poniżej), dzięki czemu natywna regulacja fenotypu pozostaje nienaruszona. Jednak teraz, gdy komórka wyraża ten fenotyp, wyraża również białko fluorescencyjne. Zapewnia to łatwy do wizualizacji odczyt aktywacji określonego zachowania fenotypowego, co pozwala nam na badanie przesiewowe w poszukiwaniu drobnoustrojów, które aktywują tę reakcję fizjologiczną. Chociaż takie reportery są powszechnie stosowane w mikrobiologii, nie były szeroko stosowane w badaniach przesiewowych do identyfikacji interakcji metabolicznych między drobnoustrojami, zanim ta metoda została opisana⁵.

Istnieje wiele ważnych kwestii związanych z projektowaniem i budową szczepów reporterowych specyficznych dla typu komórki. Użyliśmy wyłącznie transkrypcyjnych reporterów fluorescencyjnych, chociaż inne typy konstruktów są z pewnością możliwe. Odradzamy jednak stosowanie fuzji translacyjnych jako markerów różnicowania typów komórek w naszym badaniu przesiewowym z dwóch powodów: 1) chęci pozostawienia natywnego białka specyficznego dla danego typu komórki niezakłóconego oraz 2) uznania, że rozproszona, obejmująca całą komórkę fluorescencja będzie łatwiejsza do wykrycia niż zlokalizowana puncta w komórkach (powszechne w przypadku fuzji translacyjnych).

Reporter selekcja genów

Po podjęciu decyzji o użyciu transkrypcji jako odczytu, należy wybrać gen reporterowy (np. LacZ, fluorescencja lub lucyferasa). LacZ ma tę zaletę, że wymaga najmniej specjalistycznego sprzętu do wykrywania, ale istnieje znacznie większe prawdopodobieństwo fałszywych alarmów wśród drobnoustrojów środowiskowych. W naszych rękach poziom tła organizmów Lac⁺ wśród mikroorganizmów glebowych był zaporowo wysoki (>>10% mikroorganizmów glebowych było niebieskich (Lac⁺) na płytkach X-gal; danych nie pokazano). Możliwe, że poprzez miareczkowanie stężenia X-gal w pożywce, można to zoptymalizować, aby umożliwić użycie reportera X-gal, chociaż nie próbowaliśmy tego. Lucyferazy zapewnia wysoką czułość wykrywania i jest najbardziej ortogonalnym reporterem: nie ma prawie żadnych szans na to, aby mikroorganizmy środowiskowe były z natury luminescencyjne. Okazało się jednak, że trudno jest zidentyfikować oprzyrządowanie w naszej instytucji, które umożliwiałoby wykrywanie luminescencji na całych płytkach Petriego, ponieważ większość z nich została zaprojektowana do skanowania tylko zlokalizowanych obszarów na płytkach wielodołkowych. Mogą również wystąpić komplikacje w wizualizacji kolonii luminescencyjnych w sposób, który pozwolił również na jednoczesną fizyczną izolację organizmów indukujących. Chociaż korzystanie z powierników mogło to umożliwić, zamiast tego zdecydowaliśmy się na użycie fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych, które okazały się skuteczne w przypadku B. subtilis, zapewniały odpowiednią czułość wykrywania i niskie wskaźniki wyników fałszywie dodatnich wśród organizmów glebowych oraz pozwalały na użycie łatwo dostępnych narzędzi zarówno do wizualizacji, jak i procedur izolacji.

Wybór fluoroforu

Konkretny wybrany fluorofor będzie zależał od gatunku twojego bakterium, pożywki do uprawy agaru, której używasz, oraz konkretnych zestawów filtrów fluorescencyjnych, które masz do dyspozycji. Dzięki naszemu oprzyrządowaniu odkryliśmy, że zarówno same kolonie B. subtilis, jak i agar, na którym były hodowane, wykazywały mniejszą fluorescencję tła, gdy zastosowano filtry YFP (żółte białko fluorescencyjne), co sprawia, że reporter jest lepszy niż GFP (zielone białko fluorescencyjne) w naszych rękach. Wykorzystanie kodonów w białkach fluorescencyjnych jest często optymalizowane dla eukariontów, dlatego ważne jest, aby wybrać fluorofor znany z literatury do pracy u gatunków bakterii lub przetestować go wyraźnie za pomocą konstytutywnego promotora. Obecnie dostępna jest duża liczba stale ewoluujących wariantów białek fluorescencyjnych⁶, które zostały zrecenzowane w wielu źródłach^7,8, z których niektóre wyraźnie zawierają wskazówki dotyczące wyboru odpowiedniego białka fluorescencyjnego do eksperymentu⁹.

Wybór promotora

Wybór promotora będzie w dużej mierze zależał od typu komórki lub fenotypu, który Cię interesuje. W przypadku organizmów takich jak B. subtilis w literaturze ustalono pewne geny reporterowe specyficzne dla typu komórki. W przypadku innych szczepów bakteryjnych konieczne będzie zbadanie danych mikromacierzowych lub transkrypcyjnych, aby uzyskać informacje o tym, które geny są wysoce regulowane w górę w warunkach, w których przejawia się interesujący Cię typ komórki. W niedawnym badaniu skatalogowano transkrypcję B. subtilis w 104 różnych warunkach wzrostu przy użyciu mikromacierzy kafelkowych¹⁰. Artykuł ten dostarcza wyczerpujących informacji na temat tego, które geny są silnie regulowane w górę w różnych warunkach, co jest nieocenione w przypadku słabiej scharakteryzowanych fenotypów.

Zamiast mapować dokładne regiony promotora dla każdego interesującego nas genu, zazwyczaj po prostu używamy sekwencji 200-500 pz przed genem jako promotora. Dokładna długość sekwencji zależy od kontekstu genomowego: w razie potrzeby stosuje się krótsze regiony, aby uniknąć włączania regionów kodujących z sąsiednich otwartych ramek odczytu.

Neutralne loci i integracja

Jak utrzymać konstrukcję reporterową w swoim szczepie bakteryjnym, staje się ostatnim pytaniem przy projektowaniu fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego. U bakterii interesujące geny są często utrzymywane na plazmidach za pomocą selekcji antybiotyków. Jednak stosowanie antybiotyków podczas kokultury bez zabijania drobnoustrojów środowiskowych może nie być możliwe. Jeśli plazmidy są stabilnie utrzymywane w twoim gatunku bakterii, może być możliwe wyhodowanie bakterii zawierających reporter przenoszony przez plazmid w obecności antybiotyków, aby przygotować reportera do badań przesiewowych, a następnie wyeliminować antybiotyki podczas samej kokultury w nadziei, że plazmid będzie wystarczająco utrzymany, aby umożliwić fluorescencję. Jeśli jednak plazmidy łatwo tracą się w bakterii lub są tracone w warunkach stresu, nie będzie to realna opcja. W wielu przypadkach najlepszym rozwiązaniem będzie zintegrowanie konstruktu reporterowego z chromosomem bakteryjnym, co pozwala na stabilne utrzymanie reportera nawet w przypadku braku selekcji. Aby integracja nie zakłóciła normalnej ekspresji lub regulacji interesującego Cię genu, zalecamy integrację z ektopowym miejscem na chromosomie, które może działać jako "neutralne locus". U B. subtilis te miejsca integracji są genami, które - gdy są zmutowane - przenoszą fenotyp w pewnych minimalnych pożywkach (co pozwala na identyfikację integrantów bez selekcji antybiotyków), jednak nie zmieniają tempa wzrostu ani zarodnikowania w pożywkach bogatych i obejmują takie geny, jak amyE, lacA, thrC, pyrD, gltA i sacA (przekazujące zdolność do wykorzystania odpowiednio skrobi, β-galaktozydów, treoniny, uracylu, glutaminianu i sacharozy)^11-13

.

Chociaż integracja w tych genach była niezawodnie stosowana przez wiele lat u B. subtilis (szczególnie w amyE i lacA), podobna wiedza może nie być dostępna dla genów w wielu innych gatunkach bakterii. Wykorzystanie miejsc przyczepiania fagów jest doskonałą alternatywą dla neutralnych miejsc integracji chromosomów: wiele specyficznych dla gatunku^{miejsc 14-16}, a także ogólnych miejsc integracji, takich jak miejsce przyłączenia Tn7 (attTn7) zostało zidentyfikowanych i wykorzystanych do insercji genów u wielu gatunków bakterii^17,18.

Mikroorganizmy środowiskowe

Używamy gleby jako bezpośredniego źródła mikrobów środowiskowych dla naszego ekranu kokultury. Gleba zawiera dużą różnorodność drobnoustrojów, a wiele z tych organizmów jest bogatym źródłem produktów naturalnych. Stosując płynne zawiesiny gleby umieszczone bezpośrednio na płytkach z naszym fluorescencyjnym transkrypcyjnym szczepem reporterowym (bez wcześniejszej izolacji bakterii z gleby), znacznie upraszczamy podejście eksperymentalne. Gleba może być wykorzystana natychmiast po zbiorach lub zamrożona w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Natychmiastowe użycie ma tę zaletę, że potencjalnie można wyhodować większą różnorodność drobnoustrojów, w tym tych, które nie przetrwają dobrze mrozu. Ma to tę wadę, że stężenie organizmów glebowych nadających się do uprawy w tych próbkach jest nieznane, co zwiększa liczbę płyt sitowych, które należy zastosować. Opóźnione użycie ma tę zaletę, że jtk/ml dla każdego źródła gleby można określić z wyprzedzeniem, co pozwala na wyhodowanie optymalnej liczby kolonii na każdej płycie sitowej. Wymaga jednak, aby organizmy glebowe były zdolne do przetrwania zamarzania.

Zauważ, że zróżnicowanie badanej puli induktorów (tj. źródeł glebowych) wydaje się być bardziej skuteczne w identyfikowaniu nowych interakcji międzygatunkowych niż dogłębne badania przesiewowe na tej samej glebie: większą różnorodność filogenetyczną zaobserwowano w trafieniach zidentyfikowanych na naszym ekranie indukcji matrycy, ponieważ dodatkowe źródła gleby były badane, zamiast dokładniej badać te same źródła gleby (E.A. Shank i R. Kolter, Harvard Medical School, wyniki niepublikowane).

Przegląd

Podejście, które tutaj opisujemy, jest proste pod względem wymagań technicznych. Polega ona na: 1) skonstruowaniu fluorescencyjnego reportera transkrypcyjnego u B. subtilis lub innego gatunku bakterii będącego przedmiotem zainteresowania, 2) zidentyfikowaniu warunków, w których ten reporter nie jest aktywowany, 3) przygotowaniu porcji tego szczepu reporterowego i organizmów do badań przesiewowych (w naszym przypadku gleby, ale zamiast tego można wykorzystać inne źródła), 4) zmieszaniu tych dwóch zestawów drobnoustrojów na podłożach stałych, 5) identyfikacja i wyizolowanie przypuszczalnych organizmów indukujących oraz 6) potwierdzenie, że organizmy te rzeczywiście aktywują ten fenotyp w wtórnym badaniu przesiewowym. Po zidentyfikowaniu, organizmy te i ich metabolity dostarczają nam narzędzi chemicznych do modulowania zachowania bakterii, badania fizjologii bakterii i interakcji mikrobiologicznych oraz potencjalnego działania jako nowe rusztowania dla przyszłych związków terapeutycznych.

Protokół

1. Wybierz gen reporterowy i skonstruuj fluorescencyjny reporter transkrypcyjny

Dla B. subtilis:

1. Zobacz artykuł JoVE w odnośniku ¹⁹, aby zapoznać się z protokołem opisującym budowę fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych w Bacillus subtilis.

Dla innych gatunków bakterii:

1. Zidentyfikuj gen, który jest regulowany w górę podczas interesującej nas reakcji fizjologicznej. Może to być oparte na istniejącej literaturze lub analizie transkrypcyjnej drobnoustroju w określonych warunkach.
2. Skonstruuj fluorescencyjny reporter transkrypcyjny dla tego genu, aby działał jako proxy dla zmiany fenotypu. Konstrukt ten powinien obejmować promotor tego podwyższonego genu napędzającego produkcję odpowiedniego białka fluorescencyjnego (patrz ryc. 1).
3. Zintegruj ten konstrukt z neutralnym locus na chromosomie. Gwarantuje to, że natywna regulacja genu będącego przedmiotem zainteresowania nie zostanie zakłócona i pozwoli uniknąć konieczności stosowania mechanizmów selekcji plazmidów (np. antybiotyków), które mogłyby zakłócać wzrost drobnoustrojów środowiskowych.

2. Określ warunki kokultury

Dla B. subtilis P_tapA-yfp reporter:

1. Użyj 0,1 x LB, Lennox (1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl na litr) do tego reportera, ponieważ produkcja B. subtilis matrix jest minimalna na Luria Broth²⁰. To podłoże pozwala koloniom B. subtilis rosnąć do submilimetrowych, ale obserwowalnych rozmiarów, jednocześnie umożliwiając wzrost różnych taksonów z gleby⁵.
2. Dołącz bufor MOPS 100 mM, aby zminimalizować potencjalne zmiany pH.

Dla innych gatunków bakterii:

1. Wykorzystaj opublikowane dane transkrypcyjne lub przetestuj empirycznie różne warunki hodowli, aby zidentyfikować jeden, w którym mikrob rośnie, ale aktywacja fluorescencyjnego reportera jest znikoma (aby umożliwić wykrycie jego aktywacji, gdy szczep reporterowy jest hodowany w kokulturze z drobnoustrojami indukującymi).
2. Do badania przesiewowego drobnoustrojów środowiskowych ze środowisk oligotroficznych (takich jak gleba) należy stosować pożywkę o niskiej zawartości składników odżywczych (w porównaniu z tradycyjnie bogatymi pożywkami mikrobiologicznymi)²¹. Pożywka o niskiej zawartości składników odżywczych zmniejsza również rozmiar kolonii, zwiększając przepustowość sita.
3. Wybierz medium o niskiej fluorescencji tła i dobrej przejrzystości optycznej.
4. Zoptymalizuj temperaturę wzrostu, aby umożliwić jednoczesny wzrost zarówno szczepu reporterowego, jak i mikroorganizmów środowiskowych.
5. Rozważ dodanie środka buforującego. Zastosowanie buforu w płytkach zmniejszy możliwość wykrycia zmian w fizjologii za pośrednictwem pH²², chyba że takie interakcje są przedmiotem zainteresowania.

3. Przygotuj porcje Reportera

Dla B. subtilis P_tapA-yfp reporter:

1. Smugi reportera przecedzić z zamrożonego bulionu w temperaturze -80 °C na świeżą płytkę LB za pomocą sterylnej wykałaczki lub aplikatora w sztyfcie.
2. Rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
3. Wykonać seryjne rozcieńczenia w ciekłej kulturze, aby zminimalizować fluorescencję tła powstającą w wyniku wzrostu na stałym podłożu:
   1. Zaszczepić 5 ml płynnej kultury LB i rosnąć przez wytrząsanie w temperaturze 37 °C.
   2. Gdy kultura osiągnie OD₆₀₀ ~ 0,6, rozcieńczyć do 5 ml świeżego LB do OD₆₀₀ 0,02.
   3. Ponownie rosnąć w temperaturze 37 °C z potrząsaniem, aż kultury osiągną OD₆₀₀ ~ 0,6.
   4. Powtórz seryjne rozcieńczenia wzrostu w sumie 3x.
   5. Niech końcowa kultura rozcieńczania szeregowego wzrośnie do OD₆₀₀ ~ 0,4.
4. Dodaj glicerol do 15-20%.
5. Porcję 50-200 μl rozlać do probówek do mikrofuge o pojemności 0,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.
6. Wykonać równoważne podwielokrotności dla niefluorescencyjnego szczepu macierzystego osoby zgłaszającej (będą one wymagane podczas wtórnego badania przesiewowego).

Dla innych gatunków bakterii:

1. Należy używać komórek, które mają niską fluorescencję tła (tj. są hodowane w warunkach, w których występuje niewielka ekspresja z promotora użytego w reporterze).
2. Sporządzić i zamrozić podwielokrotności zawierające znane jtk/ml (jednostki tworzące kolonie na ml) szczepu reporterowego, tak aby można było wyhodować odpowiednią liczbę kolonii na każdej płycie sitowej kokultury (szczegóły w sekcji powyżej).
3. Wykonać równoważne podwielokrotności dla niefluorescencyjnego szczepu rodzicielskiego (będą one wymagane podczas wtórnego badania przesiewowego).

4. Pobieranie próbek gleby

1. Zbierz ziemię do sterylnych stożkowych probówek lub sterylnych worków za pomocą szpatułki, odrzucając górne 0,5 cm odsłoniętej powierzchni gleby.
2. Dodać sterylną sól fizjologiczną (0,85% NaCl) w proporcji 10 ml na 1 g gleby, aby uzyskać zawiesinę glebową.
3. Należy wybrać metodę usuwania bakterii z cząstek gleby: a) natychmiastowe użycie świeżej próbki lub b) opóźnione użycie po zamrożeniu próbki.
   1. Do natychmiastowego użycia wirować gnojowicę przez 1 minutę.
   2. W przypadku opóźnionego użycia zmiksuj gnojowicę glebową w blenderze przez trzy 1-minutowe cykle, umieszczając słoik blendera na lodzie na 1-minutowe przerwy między cyklami miksowania.
4. Pozwól, aby gnojowica glebowa osiadła przez ~1 min.
5. Przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki.
6. Dodaj glicerol do końcowego stężenia 15-20%.
7. Porcję 50-200 μl rozlać do probówek do mikrofuge o pojemności 0,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.

5. Określ cfu/ml zamrożonych porcji reportera i gleby

1. Rozmrozić zamarzniętą glebę i podwielokrotność reportera. Mikroorganizmy glebowe można rozmrażać na lodzie. Ponieważ B. subtilis ulega lizie w temperaturze 4 °C, te podwielokrotności powinny być szybko rozmrożone w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować czas spędzony w niskiej temperaturze.
2. Wykonać dwa powtórzone seryjne rozcieńczenia (do ^10-8) w 0,1x LB lub innym buforze izotonicznym.
3. Umieścić 5 μl plamek z każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkach agarowych z tego samego podłoża, które będzie używane do badania przesiewowego w kokulturze.
4. Uprawiaj w temperaturze pokojowej (lub temperaturze, która będzie używana do badań przesiewowych).
5. Następnego dnia policz liczbę kolonii w każdym miejscu i oblicz jtk/ml każdej z zamrożonych podwielokrotności.

6. Potwierdź stężenia podwielokrotności dla płyt sitowych

1. Rozmrozić zamrożoną podwielokrotność jak w kroku 5.1.
2. Rozcieńczyć do 1 x 10⁵, 2,5 x 10⁵, 5 x 10⁵, 1 x 10⁶ i 2,5 x 10⁷ jtk/ml.
3. Dodać 50 μl plamki z każdego rozcieńczenia do środka poszczególnych płytek. Powinny one dać płytki o obliczonym optimum 25 000 kolonii na płytkę, a także 2- i 5-krotnie więcej i mniej, co pozwoli na określenie najlepszego rzeczywistego rozcieńczenia.
4. Dodaj około 20 sterylnych szklanych (3 mm) kulek, delikatnie stukając nimi w płytkę. Koraliki zapewniają bardziej równomierne rozprowadzenie kolonii na płycie niż robi to rozsiewacz do giętego szkła.
5. Rozłóż komórki, trzymając talerze na blacie i potrząsając nimi w przód iw tył, obracając je podczas pracy, aż płyn zostanie wchłonięty. Nie kontynuuj potrząsania koralikami po wyschnięciu płytki; W przeciwnym razie zacznie zabijać bakterie.
6. Odwróć talerze i wyrzuć koraliki do zlewki na odpady zawierającej etanol.
7. Pozwól płytkom rosnąć na czas testu (np. 24 godziny) w temperaturze odpowiedniej dla testu (np. 24 °C/RT).
8. Za pomocą stereoskopu preparacyjnego policz liczbę kolonii w dwóch lub więcej polach widzenia.
9. Oblicz liczbę kolonii na obszarze i określ, ile kolonii znajduje się na każdej płycie.
10. W razie potrzeby dostosuj przyszłe rozcieńczenia. Rzeczywista liczba kolonii nie jest tak ważna, jak posiadanie tej samej liczby na każdej porównywalnej płycie sitowej.

7. Przygotuj talerze kokultury

1. Rozmrozić podwielokrotność reporterową (i podwielokrotność gleby, jeśli jest zamrożona), jak w kroku 5.1.
2. Rozcieńczyć reporter (do stężeń zoptymalizowanych w sekcji 6) w 0,1x LB lub innym roztworze izotonicznym o niskiej zawartości składników odżywczych.
   1. W przypadku zamarzniętej gleby: Rozcieńczyć do stężenia zoptymalizowanego w sekcji 6 w 0,1x LB lub innym ubogim w składniki odżywcze, roztworze izotonicznym
   .
   2. W przypadku świeżej gleby: Rozcieńczyć świeżą gnojowicę glebową, opierając się na przewidywaniu, że jtk/ml gnojowicy glebowej może wynosić od ^10-4 do ^10-9 jtk/ml.
3. Umieścić 50 μl rozcieńczeń gleby i reportera na środku płyty sitowej kokultury. Również sama gleba płytkowa i sam reporter jako kontrole.
4. Rozprowadź za pomocą szklanych kulek, jak opisano w kroku 6.4-6.6.
5. Jeśli znane są warunki wzrostu, które aktywują reporter fluorescencyjny, należy go w tych warunkach pokryć smugą lub płytką i wyhodować, aby wykorzystać go jako kontrolę pozytywną podczas badań przesiewowych.
6. Inkubować w temperaturze 24 °C przez 24 - 28 godzin (lub w zależności od potrzebnego do reportera/testu)

8. Płytki do fluorescencji na ekranie

1. Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, ustaw ostroskop tak, aby kolonie były ostre.
2. Spójrz na płytki zawierające tylko glebę, aby określić, czy próbka gleby zawiera kolonie autofluorescencyjne. Jeśli tak, gleba ta może skutkować wysokim odsetkiem wyników fałszywie dodatnich (przy jednoczesnym wzroście wtórnych badań przesiewowych).
   1. Użyj wysokiego stosunku reporter:gleba w płytkach kokultury, aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że induktor zostanie otoczony przez wiele kolonii reporterowych, zmniejszając prawdopodobieństwo, że zostaną one wykryte jako fałszywie dodatnie (ryc. 2).
   2. Użyj innego białka fluorescencyjnego (takiego, które emituje w innym kanale).
3. Określ czas testu. Dla większości nowych reporterów czas potencjalnej indukcji jest nieznany, a zatem musi być określony empirycznie.
   1. Rozpocznij badania przesiewowe pod kątem fluorescencji, gdy tylko kolonie staną się wyraźnie widoczne za pomocą stereoskopu preparacyjnego (powiększenie ~30X) i kontynuuj okresowe badanie płytek, aż wzrost ustanie i/lub fluorescencja tła stanie się zbyt wysoka.
   2. Po ustaleniu okna czasowego potencjalnej indukcji dla konkretnego reportera, powinno ono być podobne dla wszystkich płytek kokultury zawierających ten reporter, co upraszcza monitorowanie płytek sitowych. W przypadku reportera B. subtilis P_tapA-yfp odpowiedni czas na zbadanie płytek wynosi od 24 do 28 godzin po posianiu komórek; dla reportera B. subtilis P_sspB-yfp jest to od 26 do 32 godzin wzrostu.
4. Zmaksymalizuj swoją czułość fluorescencyjną:
   1. Upewnij się, że luneta prosektoryjna fluorescencyjna znajduje się w ciemnym pomieszczeniu lub jest otoczona zasłonami zaciemniającymi. Indukcja będzie prawdopodobnie mniej intensywna niż konstytutywnie wytwarzany FP i wymaga większej czułości do wykrycia.
   2. Poczekaj, aż lampa fluorescencyjna się ustabilizuje, a oczy przyzwyczają się do ciemności, zanim spróbujesz wykryć fluorescencję na płytkach kokultury (co najmniej 1-2 minuty).
5. Korzystając z kontroli pozytywnej (jeśli ją posiadasz), upewnij się, że powiększenie, którego używasz, pozwala na wykrycie fluorescencji. Powiększenie jest zazwyczaj najlepsze, jeśli pole widzenia jest około 30-50 razy większe niż typowa średnica kolonii (200-400 razy).
6. Wyłącz jasne światło i otwórz migawkę dla swojej fluorescencji.
7. Po tym, jak twoje oczy przyzwyczają się do ciemności, powoli przesuwaj płytkę w przód iw tył po polu widzenia, szukając jasnych punktów.
   1. Zacznij od góry płyty i użyj zygzakowatego wzoru, aby przesuwać płytkę na boki, przesuwając się w kierunku dołu płyty.
   2. Ćwicz przesuwanie płytki w jasnym polu, aby zorientować się, jak wolno należy poruszać się do płyty i upewnić się, że pokrywasz całą powierzchnię.
   3. Przesuwaj płytkę na tyle wolno, aby kolonie nie stały się rozmyte. Lepiej jest nadpróbkować powierzchnię, niż pominąć obszary.
   4. Po jednym pełnym przeciągnięciu obróć płytkę o 90° i powtórz czynność. Ludzkie oczy są niezwykle dobre w wykrywaniu nawet słabej fluorescencji za pomocą tej metody.
8. Jeśli wykryjesz fluorescencję, przestań przesuwać płytkę i wróć i znajdź obszar fluorescencyjny.
9. Powoli włączając jasne pole, określ, czy fluorescencja jest związana z kolonią bakterii (a nie z autofluorescencyjnymi resztkami gleby lub składnikami pożywki). Jeśli tak, to niefluorescencyjne kolonie proksymalne do kolonii fluorescencyjnej są przypuszczalnymi organizmami indukującymi.

9. Izoluj domniemane organizmy indukujące

1. Po zidentyfikowaniu indukowanych (fluorescencyjnych) kolonii, należy wyizolować te kolonie, które wydzielają związki indukujące.
   1. Jeśli na płytce rośnie wystarczająco wysoka koncentracja kolonii reporterowych (>0,5:1 reporter:gleba cfu), domniemane kolonie indukujące będą otoczone wieloma koloniami fluorescencyjnymi (ponownie, patrz Rysunek 2).
   2. W przypadkach, gdy złożoność wzrostu kokultury sprawia, że nie jest jasne, która kolonia jest induktorem, należy wyizolować wiele potencjalnych kolonii indukujących do późniejszych testów w wtórnym badaniu przesiewowym.
2. Zlokalizuj kolonie, które chcesz wybrać, na środku pola widzenia.
   1. Jeśli znajdują się one blisko krawędzi płytki, obróć ją tak, aby krawędź płytki znajdowała się z dala od twojej dominującej ręki (tj. jeśli jesteś praworęczny, umieść krawędź płytki po lewej stronie). Pozwala to podejść do kolonii pod niskim kątem, co poprawia dokładność zbierania.
3. Umieść świeże talerze, aby rozprowadzić domniemane organizmy indukujące na pobliskich powierzchniach, a także zlewkę na odpady, do której wyrzuć zużyte końcówki.
4. Pozostawiając włączoną lampę fluorescencyjną, powoli włączaj jasne światło, aby móc zidentyfikować (na podstawie kształtu i położenia) kolonię fluorescencyjną i otaczające ją domniemane organizmy indukujące. Być może będziesz musiał kilka razy przejść tam iz powrotem ze światłem, aby móc zidentyfikować kolonie, które chcesz wybrać, gdy nie ma fluorescencji, a tylko jasne światło.
5. Za pomocą szklanego pręta (200 mm długości x 5 mm średnicy) podnieś sterylną, okrągłą końcówkę o pojemności 200 μl i przytrzymaj ją jak ołówek. Jest to narzędzie do zbierania, którego użyjesz do izolowania poszczególnych kolonii.
6. Oprzyj zewnętrzną dłoń o scenę, aby ustabilizować ją na powierzchni roboczej. Połóż drugą rękę na wewnętrznej stronie kciuka dłoni, aby ustabilizować narzędzie do zbierania.
7. W razie potrzeby ponownie przełącz się między widokami fluorescencji i jasnego pola, aby zidentyfikować kolonie, które chcesz wybrać.
8. Trzymając końcówkę pipety nad powierzchnią płytki, przesuń ją w swoje pole widzenia i wyśrodkuj nad kolonią, którą chcesz pobrać. Końcówka będzie nieostra.
9. Używając zewnętrznej krawędzi dłoni (która spoczywa na stoliku mikroskopu lub powierzchni roboczej), powoli obróć końcówkę pipety w dół do kolonii, która ma zostać pobrana. Dotykaj go bardzo delikatnie, starając się zminimalizować liczbę innych kolonii, z którymi styka się końcówka.
10. Nie obracając narzędzia do zbierania, nałóż smugę na fragment świeżego talerza. Rozprowadź miękkim dotykiem, aby uniknąć żłobienia agaru. Ponieważ liczba komórek przenoszonych tą metodą jest dość mała (kolonie są znacznie mniejsze niż zwykle manipulowane), pojedyncza ciągła smuga spowoduje powstanie izolowanych kolonii.
11. Powtórz ten proces z innymi przypuszczalnymi organizmami indukującymi.
12. Inkubować płytki w temperaturze 24 °C (lub w temperaturze testu).

10. Smugi przypuszczalnie indukują organizmy w celu uzyskania izolowanych pojedynczych kolonii

1. Za pomocą stereoskopu określ - na podstawie struktury lub morfologii kolonii - czy w każdym z przypuszczalnie wybranych organizmów indukujących znajdują się różne typy kolonii.
   1. Przyjrzyj się koloniom za pomocą sceny, na której możesz oświetlić kolonie zarówno od góry, jak i od dołu, aby wykryć potencjalne różnice między koloniami.
2. Przenieś każdy morfotyp na świeżą płytkę i inkubuj, aż wyrośnie.
3. Powtórz smugę jeszcze raz i pozwól rosnąć. Jeśli utrzymują się różne morfotypy, kontynuuj powrót do czystości.

11. Ponowne testowanie przypuszczalnych organizmów indukujących na drugim ekranie

1. Ponownie przetestuj wszystkie przypuszczalne organizmy indukujące w wtórnym badaniu przesiewowym, aby określić, które aktywują fluorescencyjny reporter transkrypcyjny. Wtórne sito składa się z trawnika mikrokolonii fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego, wraz z płytkami kontrolnymi, na które domniemane organizmy indukujące są łatane lub plamione.
2. Ustaw trzy identyczne płytki: jedną zawierającą trawnik mikrokolonii fluorescencyjnego transkrypcyjnego szczepu reporterowego (w tym samym stężeniu, jakie zastosowano podczas badań przesiewowych kokultury); jedna zawierająca trawnik mikrokolonii szczepu rodzicielskiego typu dzikiego bez reportera fluorescencyjnego; i jedna zawierająca trawnik bez trawnika.
   1. Zaznacz górną część tylnej części każdej tabliczki, aby określić orientację płyty.
   2. Dodać znaczniki pozycyjne dla plam/plamek; na każdym zestawie płytek można przetestować do dziesięciu przypuszczalnych organizmów indukujących (ryc. 3).
   3. Rozmrozić podwielokrotności trawnika (reporterowy i niefluorescencyjny szczep rodzicielski), jak w kroku 5.1.
   4. Rozprowadzić 50 μl rozcieńczenia 5 x 10⁵ jtk/ml na talerzach trawnikowych (lub innych zoptymalizowanych rozcieńczeniach) za pomocą sterylnych kulek, jak w kroku 6.4.
   5. Pozostaw talerze do wyschnięcia.
3. Domniemane organizmy indukujące plamy lub plamki:
   1. Wybierz łatanie, jeśli pożądane jest łatwiejsze i szybsze podejście, a dopuszczalna jest mniej dokładna liczba zdeponowanych komórek. Aby wprowadzić poprawkę:
      1. Przyłóż sterylną wykałaczkę do kolonii, aby przetestować - nie zbieraj wszystkich komórek.
      2. Nałóż (zrób małą smugę) na pustą płytkę.
      3. Powtórzyć nałożenie plastra świeżą wykałaczką na płytkę reporterową.
      4. Powtórzyć nałożenie plastra świeżą wykałaczką na płytkę kontrolną.
   2. Wybierz wykrywanie, jeśli pożądane jest ilościowe i powtarzalne podejście. Plamienie pozwala na normalizację liczby zdeponowanych komórek (szczegółowe informacje znajdują się w odnośniku 5) i pozwala na porównanie względnej siły działania różnych organizmów indukujących. Aby zauważyć:
      1. Zawiesić przypuszczalne organizmy indukujące w 1 ml płynnego podłoża w sterylnej plastikowej kuwecie.
      2. Pobrać OD₆₀₀ z zawieszeń.
      3. Stosując wzór X = 250 ÷ (OD₆₀₀ - 0,5), dodać objętość X dla każdej resuspension do 500 μl płynnego podłoża, aby otrzymać roztwór o OD₆₀₀ 0,5. Ta metoda upraszcza wymagane etapy pipetowania podczas wykonywania wielu rozcieńczeń w celu normalizacji OD, ponieważ można użyć tej samej objętości (500 μl) dla wszystkich rozcieńczalników.
      4. Umieścić 1 μl każdej znormalizowanej zawiesiny OD na każdej z trzech płytek.
4. Pozostaw do wzrostu w temperaturze 24 °C przez 24-28 godzin (lub w zależności od potrzeb reportera/testu).
5. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować przypuszczalne organizmy indukujące, które aktywują twój fluorescencyjny szczep reporterowy, ale nie szczep kontroli rodzicielskiej. Te izolaty to Twoje pozytywne trafienia - mikroorganizmy środowiskowe, które wydzielają związki wywołujące Twój fenotyp.

Wyniki

Ten ekran został użyty do identyfikacji organizmów glebowych wydzielających związki, które zmieniają fizjologię B. subtilis. Opisane tutaj wyniki koncentrują się na typie komórek B. subtilis wytwarzających macierz, które wytwarzają białko i egzopolisacharydy, które są niezbędne do tworzenia silnego biofilmu w tej bakterii. Wybraliśmy promotor operonu tapA-sipW-tasA dla naszego fluorescencyjnego konstruktu reporterowego (P_tapA-yfp). Operon ten koduje białkowy składnik struktu...

Dyskusja

Jednym z nieodłącznych ograniczeń tego protokołu jest to, że opiera się on na zdolności do uprawy organizmów mikrobiologicznych. Jak zostało dobrze udokumentowane²⁴, większość życia mikrobiologicznego na naszej planecie nie może (jeszcze) rosnąć w warunkach hodowli zbadanych do tej pory. W związku z tym ogromna liczba interakcji między gatunkami drobnoustrojów, które występują w środowisku naturalnym, pozostanie niewykryta przy użyciu tego podejścia. Ponieważ jednak naszym pragnieniem jest nie tylko zidentyfik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr			Dowolny spektrofotomer zdolny do pomiaru wartości absorpcji OD600 absorbancja.
Rosół Luria, Lennox	VWR	80017-484	Mogą być konieczne alternatywne źródła pożywki.
Koraliki szklane, 3 mm	VWR	26396-508
Końcówki do nakładania żelu, okrągłe	VWR	29442-666
Pręty szklane	VWR	59060-069
Stereoskop fluorescencyjny	Zeiss	N/A	Autor użył stereoskopu preparacyjnego Zeiss Stemi SV6 z fluorescencyjnym źródłem światła EXFO X-cite 120, kostką filtra długoprzepustowego YFP, achromatycznym obiektywem 0,63X, okularami 10X i Aparat cyfrowy Axio HRC HR. Większość ekranowania wykonano z mocowaniem do ustawiania ostrości 2,0-3,2X. Każdy stereoskop preparacyjny z możliwością fluorescencji jest w porządku, pod warunkiem, że masz odpowiednie filtry dla używanego FP. Najlepiej, jeśli jest migawka, która pozwala łatwo przełączać się między jasnym polem a fluorescencją, a także stolik, który umożliwia oświetlenie z góry i z dołu. Jeśli chcesz robić zdjęcia, niezbędna jest również dołączona kamera.