Artykuł metodologiczny

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

22K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50881

⸱

9 października 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, University of Göttingen, 2Institute of Neuropathology, University of Göttingen, 3Institute of Anatomy and Cellbiology, University of Halle

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

Streszczenie

Pacjenci z przerzutami raka do mózgu mają złe rokowania. Jednak proces w miejscu przerzutów nie został prawie zbadany, w szczególności rola komórek rezydentnych (zrębowych). Badania nad rakami pierwotnymi wykazują wpływ mikrośrodowiska na przerzuty, a nawet na rokowanie1,2. Zwłaszcza makrofagi związane z nowotworem (TAM) wspierają migrację, inwazję i proliferację3. Co ciekawe, główne miejsca docelowe przerzutów posiadają makrofagi specyficzne tkankowo, takie jak komórki Kupffera w wątrobie lub mikroglej w OUN. Co więcej, miejsca przerzutów posiadają również inne komórki specyficzne dla tkanki, takie jak astrocyty. Niedawno wykazano, że astrocyty sprzyjają proliferacji i trwałości komórek rakowych4,5. Dlatego funkcje tych specyficznych tkankowo typów komórek wydają się być bardzo ważne w procesie przerzutów do mózgu6,7.

Pomimo tych obserwacji, do tej pory nie ma odpowiedniego modelu in vivo/in vitro, który bezpośrednio obrazowałby reakcje glejowe podczas tworzenia przerzutów do mózgu, w szczególności za pomocą mikroskopii jasnego pola. Niedawne obrazowanie na żywo in vivo komórek rakowych wykazało ich zachowanie kolonizacyjnemózgu 8. Jednak ta metoda jest bardzo pracochłonna, kosztowna i skomplikowana technicznie. Ponadto tego rodzaju eksperymenty na zwierzętach są ograniczone do małych serii i wiążą się ze znacznym stresem dla zwierząt (poprzez wszczepienie szklanej płytki, wstrzyknięcie komórek nowotworowych, powtarzające się znieczulenie i długotrwałą fiksację). Co więcej, obrazowanie in vivo ogranicza się do tej pory do wizualizacji komórek rakowych, podczas gdy interakcje z komórkami rezydentnymi nie zostały jeszcze zilustrowane. Wreszcie, badania ludzkich komórek rakowych u zwierząt immunokompetentnychsą niemożliwe 8.

Z tych powodów stworzyliśmy system kokultury składający się z organotypowego wycinka mózgu myszy i komórek nabłonkowych osadzonych w matrigelu (sferze komórkowej 3D). Kule komórek raka 3D umieszczono bezpośrednio przy krawędzi wycinka mózgu w celu zbadania inwazji sąsiedniej tkanki mózgowej. Dzięki temu możemy wizualizować zmiany morfologiczne i interakcje między komórkami glejowymi a komórkami rakowymi za pomocą fluorescencji, a nawet mikroskopii w jasnym polu. Po eksperymencie kokulturowym tkanka mózgowa lub sferoidy komórek 3D mogą zostać pobrane i wykorzystane do dalszych analiz molekularnych (np. qRT-PCR, IHC lub immunoblot), a także do badań za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do monitorowania zdarzeń w żywej tkance mózgowej przez wiele dni bez szkodliwego wpływu na wycinki mózgu. Model umożliwia również selektywną supresję i zastępowanie komórek rezydentnych komórkami z tkanki dawcy w celu określenia wyraźnego wpływu danego genotypu. Wreszcie, model kokultury jest praktyczną alternatywą dla podejść in vivo podczas testowania ukierunkowanych manipulacji farmakologicznych.

Protokół

Ten nowy model jest adaptacją wcześniej opublikowanego organotypowego podejścia do wycinków mózgu hipokampa9-12. Modyfikacje i dodatki zostały wprowadzone w celu optymalizacji interakcji komórka rakowa - tkanka mózgowa i zagwarantowania odtwarzalności. Badanie zostało ocenione i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną. Zwierzęta były traktowane ostrożnie, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami na Uniwersytecie Medycznym w Getyndze. Organotypową kokulturę wycinków mózgu można podzielić na dwa etapy. Pierwszym krokiem jest przygotowanie organotypowego wycinka mózgu. Etap drugi obejmuje przygotowanie i depozycję komórek nowotworowych w modelu kokultury.

1. Organotypowy wycinek mózgu

  1. Przygotować pożywkę preparacyjną składającą się z minimalnej ilości pożywki niezbędnej (MEM), uzupełnionej 0,2 mM glutaminy, 100 m/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 4,5 mg/ml glukozy.
  2. Odetnij głowy myszy z dowolnego szczepu myszy między szóstym a ósmym dniem po urodzeniu (P6-8).
  3. Szybko usuń mózg z czaszki w warunkach aseptycznych i przenieś go do lodowatego podłoża preparacyjnego.
  4. Usuń biegun czołowy i móżdżek z całej części mózgu.
  5. Napraw i ustabilizuj mózg na scenie za pomocą kleju kriogenicznego i 5% agarozy.
  6. Pokrój sekcje mózgu poziomo do grubości 350 μm za pomocą wibratomu.
  7. Zbierz od czterech do sześciu całych wycinków mózgu z jednego mózgu myszy, w zależności od gatunku i wieku.
  8. Przygotuj pożywkę hodowlaną składającą się z 50% MEM, 25% zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), 25% normalnej surowicy końskiej (NHS), 0,2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny (Sigma, Monachium, Niemcy) i 4,5 mg/ml glukozy.
  9. Umieść każdy organotypowy wycinek mózgu na wkładce z membrany transwell z poliwęglanu o grubości 0,4 μm na płytce sześciodołkowej z 1 ml podłoża hodowlanego w dolnej studzience.
  10. Hoduj organotypowe plastry mózgu przez noc w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

2. Model kokultury Slice

  1. Osadź 105 komórek guza transfekowanego GFP lub innych komórek (np. komórek MCF-7-GFP) w 20 μl matrycy żelowej, składającej się z 15% pożywki RPMI i 85% żelu ECM.
  2. Umieść mieszaninę matrycy żelowej MCF-7 w sterylnej metalowej przekładce (o średnicy 3,8 mm) bezpośrednio przylegającej do obszaru korowego organotypowego wycinka mózgu i inkubuj przez 2 godziny.
  3. Usuń przekładkę i pozwól sferoidzie guza 3D na kokulturację z plastrem organotypowym przez 24-96 godzin.
  4. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień.

3. Barwienie immunofluorescencyjne astrocytów i mikrogleju w organotypowej kokulturze wycinków mózgu

  1. Utrwalić organotypową kokulturę plastrów mózgu z 4% paraformaldehydem przez 8 godzin w temperaturze 4 °C.
  2. Płukać plastry plastrem za pomocą PBST (PBS z 0,5% Triton X-100) przez 5 minut.
  3. Blokować próbki normalną surowicą kozią w PBST (1:20) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Wybarwić astrocyty, inkubując kokulturę wycinków mózgu z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku fibrylarnemu (GFAP, 1:200 w PBST) przez 36 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie barwienie kozim anty-mysim TRITC (1:100 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć próbki trzykrotnym roztworem PBST przez 5 minut.
  6. Wybarwić komórki mikrogleju za pomocą ILB4-Alexa Fluor 647 (1:100 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przeciwbarwić kokulturę wycinków mózgu za pomocą DAPI (1:1,000) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Zamontuj i nakryj szkiełko nakrywkowe kokulturę plastrów mózgu za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego DAKO.
  9. Oceń stopień inwazji guza w oparciu o następujący system punktacji: 0 = żadna z komórek; + < 1/3; ++ = 1/3 - 2/3; +++ ≥ 2/3 zaatakowanych komórek (najpierw zmierz długość odcinka kontaktowego między czopem nowotworowym a plasterkiem, a następnie zmierz frakcję kontaktu wykrywalną przez atakujące komórki).

4. Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami glejowymi i nowotworowymi

  1. Wykonaj eksperyment pod odwróconym mikroskopem Leica DMI 6000B z 10-krotnym powiększeniem i kamerą Leica DFC 350 FX CCD.

Wyniki

W pierwszej kolejności wszystkie użyte komórki raka (ludzkie: MCF-7 oraz mysie: 410.4) zinwadowały organotypowy skrawek mózgu myszy. Inwazja ta była zatem niezależna od gatunku (Ryc. 1A), co wskazuje na szeroki zakres zastosowań w sposób niezależny od gatunku. Dodatkowo, w miejscu styku nagromadziły się mikroglej oraz astrocyty, co zostało wcześniej opisane in vivo oraz w próbkach pacjentów13. Obrazowanie poklatkowe w dłuższym okresie czasu nie tylko potwierdziło żywotność skrawka, ale również zapewniło dobrą platformę do obserwacji interakcji komórkowych. W eksperymentach poklatkowych zarejestrowano wniknięcie komórek mikrogleju do trójwymiarowej sfery komórkowej, podczas gdy z kolei komórki nowotworowe również zinwadowały skrawek mózgu (Ryc. 1B1-B2). Ponadto wykazaliśmy wcześniej zdolność mikrogleju do transportowania komórek raka za pomocą wciąż zagadkowego mechanizmu, co wspomaga inwazję raka. Wykorzystując techniki znakowania immunofluorescencyjnego, opisaliśmy ko-lokalizację komórek nowotworowych i komórek zrębu (np. mikrogleju i astrocytów), zarówno w tkance mózgowej, jak i w czopie komórek nowotworowych (Ryc. 1C-D), co sugeruje ścisłą interakcję między tymi komórkami podczas procesu inwazji. Porównywalne wyniki uzyskano, gdy skrawki mózgu myszy współhodowano z ludzkimi (Ryc. 1C1-C3) lub mysimi (Ryc. 1D1-D3) komórkami raka - co wykazuje szeroki zakres zastosowań w badaniu komórek z różnych gatunków, genotypów i szczepów.

Analiza inwazji komórek; wykres słupkowy i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; inwazja komórek nowotworowych w skrawku mózgu.
Rycina 1. Model kokultury skrawka mózgu z 3D sferoidem mysich i ludzkich komórek raka. A) Ilościowe określenie inwazji komórek rakowych w organotypowych kokulturach całego skrawka mózgu z mysią linią komórkową raka piersi 410.4 lub ludzką linią komórkową raka piersi MCF-7. Dane przedstawiają procentowy stopień inwazji komórek do skrawka mózgu w każdej grupie przy n ≥ 38. Nie stwierdzono istotnej różnicy między tymi dwiema grupami (test Kruskala-Wallisa). B) Przedstawiono obrazy time-lapse z organotypowych kokultur całego skrawka mózgu z komórkami MCF-7-GFP oraz reprezentatywne obrazy z dnia 2 (B1) i dnia 5 (B2). C-D) Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują grupy raków, astrocytów i mikrogleju. Podwójne barwienie astrocytów (anty-GFAP-TRITC, czerwony) i mikrogleju (ILB4-Alexa Fluor 647, fioletowy) całej kokultury z organotypowym skrawkiem mózgu o grubości 350 μm i wtyczką z komórek nowotworowych przetransfekowanych GFP (zielony): 3D-MCF-7-GFP (C1-C3) oraz 3D-410.4-GFP (D1-D3). Białe kreski wskazują krawędź skrawka mózgu i front inwazji nowotworu. Paski skali reprezentują 50 μm. Kolokalizacje mikrogleju, astrocytów i nowotworów (C1 i D1), kolokalizacje astrocytów i nowotworów (C2 i D2) oraz kolokalizacje mikrogleju i nowotworu (C3 i D3) w kokulturze skrawka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz

Dyskusja

Wcześniejsze badania histologiczne przerzutów do mózgu wykazały szybkie i drastyczne zmiany w rezydentnych komórkach glejowych, zwłaszcza astrocytów i mikrogleju13. Do badania tych zmian i interakcji z komórkami rakowymi dobrze nadaje się ten nowatorski system kokultury. Inne dziedziny badań mają już wieloletnie doświadczenie z organotypowymi wycinkami mózgu w hipokampie. Jedną z zalet jest to, że organotypowe kultury wycinków mózgu w hipokampie są żywotne i skutecznie przechowywane przez kilka dni lub tygodni, dzięki czemu nadają się do długoterminowych eksperymentów. Od czasu wprowadzenia przez Stoppiniego w 1991 r. organotypowego systemu plastrów hipokampa, jest on szeroko stosowany, na przykład w badaniach nad chorobami zwyrodnieniowymi. W związku z tym ten innowacyjny system kokultury stanowi modyfikację dobrze ugruntowanego podejścia z szeregiem zastosowań w biologii nowotworów9,11. Modyfikacja dała nam powtarzalny model do oceny stopnia inwazji guza po jej zakończeniu, a kultury wyhodowane metodą interfejsu idealnie nadają się do eksperymentów wymagających trójwymiarowej struktury. Zastosowano kilka technik do kohodowli organotypowych wycinków hipokampa z innymi komórkami. Obejmują one pośredni system między komórkami makrofagów a organotypowym wycinkiem mózgu14 oraz bezpośrednią kokulturę dwóch różnych wycinków z regionu hipokampa15. Agregaty glejaka były również hodowane wspólnie z wycinkami mózgu16. Modele te mogą być używane do analizy zdarzeń komórkowych i molekularnych w wycinkach mózgu, ale nie pozwalają na bezpośredni, fizjologiczny kontakt między komórkami nowotworowymi, mikroglejem i miąższem mózgu. Ponadto metoda ta pozwala na obserwację mikrogleju bez zanieczyszczenia obwodowych monocytów/makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Zastosowanie transgenicznego modelu myszy CCR2 i CX3CR1 jest krytycznym ulepszeniem ze względu na fakt, że trudno jest odróżnić rezydujący mikroglej od inwazyjnych monocytów na podstawie ich podobnych właściwości17,18,19. Chociaż domózgowe wstrzyknięcie komórek rakowych pozwala na zbadanie progresji guza, nie może wiele powiedzieć, czy otoczone komórki podobne do makrofagów pochodzą z populacji mikrogleju rezydującego w mózgu, czy z obwodowych monocytów/makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego17. Zespół Kettenmanna wprowadził organotypowy model wycinka mózgu, który polegał na zaszczepieniu komórek glejaka w wycinkach mózgu za pomocą mikromanipulatora 20. Jednak pierwotne glejaki złośliwe różnią się pod wieloma względami od raków przerzutowych. Po pierwsze, glejaki złośliwe są pochodzenia mezenchymalnego, nie dają przerzutów poza układ nerwowy i migrują/atakują jako pojedyncze komórki bez granicy między guzem a tkanką mózgową. Natomiast wzrost naciekowy jest typową cechą patologiczną, a takie raki zwykle migrują/atakują jako kohorty. Po drugie, raki często próbują odbudować struktury nabłonkowe w mózgu, podczas gdy komórki glejowe próbują oddzielić guz od tkanki mózgowej za pomocą (pseudo) kapsułki. Biorąc pod uwagę cechy biologiczne i morfologiczne, glejak złośliwy i przerzuty raka nie są tak naprawdę porównywalne. Z tych powodów zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy system kokultury, w którym nie wstrzykujemy, ale kokulturujemy czop komórkowy raka przylegający do wycinka mózgu. Ponadto zaobserwowaliśmy akumulację mikrogleju i astrocytów na granicy czopa nowotworowego, co oznacza, że mikroglej dostaje się do czopa nowotworowego i może być łatwo wykryty za pomocą mikroskopii jasnego pola, a następnie potwierdzony przez mikroskopię konfokalną. Komórki rakowe wnikają do wycinka mózgu, co jest porównywalne z rzeczywistą sytuacją in vivo i z obserwacją dokonaną przez Baumerta i współpracowników, którzy znaleźli strefę nacieku w 63% przypadków autopsji zprzerzutami do mózgu.

Ze względu na brakującą perfuzję krwi, w tej kulturze występują tylko makrofagi/mikroglej. Co więcej, ze względu na brakujące limfocyty T, a tym samym brak alloreaktywności, ludzkie komórki rakowe mogą być wykorzystywane do kokultury nawet z wycinkami mózgu immunokompetentnych myszy lub szczurów (NMRI, B6 lub Wistar). Może to służyć jako alternatywa dla nagiego modelu myszy. Ponieważ z każdej myszy można uzyskać od czterech do pięciu plastrów, wymagana jest znacznie zmniejszona liczba zwierząt w porównaniu z istniejącymi modelami iniekcji. Ponadto zwierzęta nie cierpią przez długi czas na chorobę przerzutową i nie są poddawane powtarzalnym zabiegom operacyjnym22.

Dzięki temu systemowi kohodowli wykazaliśmy aktywację mikrogleju przez komórki rakowe i zdolność do promowania inwazji komórek rakowych. Dodatkowo, według naszej wiedzy, po raz pierwszy stwierdzono, że mikroglej aktywnie transportuje komórki rakowe23.

Pomimo tych wszystkich zalet, system kokultury ma w istocie również ograniczenia. Nadal jest to model in vitro , w którym brakuje etapów przerzutów przed kolonizacją. Ze względu na brak perfuzji nie jest możliwe badanie wynaczynienia. Tak więc alternatywnym sposobem badania wynaczynienia jest użycie modelu iniekcyjnego in vivo lub zmodyfikowanego systemu komór Boydena z macierzą zewnątrzkomórkową, HUVEC i astrocytami w celu naśladowania bariery krew-mózg22,24. Metoda kokultury wycinków mózgu jest jednak wiarygodnym i powtarzalnym modelem o wielu zaletach i potencjale dla szerokiej gamy zastosowań, takich jak analiza kolonizacji, w szczególności z naciskiem na rolę komórek rezydentnych. Połączenie z innymi uznanymi technikami (takimi jak immunohistochemia, mikroskopia konfokalna i mikroskopia poklatkowa) wspiera badanie bezpośrednich interakcji międzykomórkowych. Jest to łatwa alternatywa i uzupełnienie innych technik oraz oferuje dostęp do badania wskazówek i efektów narzuconych przez mikrośrodowisko przerzutowe.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Chalidowi Ghadbanowi za doskonałą pomoc techniczną, Andreasowi Wodarzowi i Stephanowi Heermannowi za ich techniczne porady dotyczące mikroskopii konfokalnej i poklatkowej. Dla żadnego z autorów nie ma konfliktu interesów. Prace te są finansowane przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) w ramach projektu 2 Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1) przez Dres. Bayer-Stiftung (Badenia-Wirtembergia, Niemcy) oraz w ramach programu badawczego Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Georga Augusta w Getyndze, Niemcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hanka' s zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco, Darmstadt,Niemcy24020
Minimalne niezbędne podłoże (MEM)Gibco, Darmstadt, Niemcy32360
RPMI-1640PAA Laboratories Inc., Cö lbe, NiemcyE15-840
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Pan Biotech, Aidenbach, NiemcyP04-36500
Normalna surowica konia (NHS)Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy16050-122
Surowica cielęca płodu (FCS)Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy10091148
GlukozaB. Braum, Melsungen, Niemcy
L-glutamina-penicylina-streptomycyna roztwórSigma, Steinheim, NiemcyG1146
VibratomeLeica, Wetzlar, NiemcyLeica VT1200S
MicrotomeLeica, Wetzlar, NiemcyLeica SM 2000R
Membrana poliwęglanowaBD Falcon, Heidelberg, Niemcy353090wkładka membranowa transwell (0,4 μ m wielkość porów)
Żel ECMTrevigen, R& D, Wiesbaden-Nordenstadt, Niemcy3432-005-01Ekstrakt z błony podstawnej
Metalowa przekładkaKig GmbG, Kirkel, NiemcyDIN 433
Mikroskop konfokalnyZeiss, Gö ttingen, NiemcyLSM 510
Mikroskop poklatkowy i kameraLeica, Wetzlar, NiemcyMikroskop DMI 6000B i kamera CCD DFC 350 FX
ttingen, NiemcyStemi SV11
ParaformaldehydMerck, Darmstadt, Niemcy1.04005.1000
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku kwasowemu (GFAP)Sigma, Steinheim, NiemcyG3893
Kozia anty-mysia IgG, F(ab')2- TRITCSanta Cruz, Heidelberg, NiemcySC3796
Izolektyna GS-IB4 z Griffonia simplicifolia, koniugat Alexa Fluor 647Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy132450
DAPI (4',6'-dihyfrochlorek dimidino-2-fenyloindolu)Sigma, Steinheim, NiemcyD8417
Fluorescencyjne medium montażoweDAKO, Glostrup, DaniaZobacz materiał S3023
Mikroskop anatomiczny Zeiss, Gö

Bibliografia

  1. Langley, R. R., Fidler, I. J. The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs. Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454, 436-444 (2008).
  4. Fidler, I. J. The role of the organ microenvironment in brain metastasis. Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).
  5. Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells. PloS one. 8, e54752(2013).
  6. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12, 895-904 (2006).
  7. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).
  8. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
  9. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  10. Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures. Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).
  11. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  12. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. CSH Protoc. 2007, pdb prot4848(2007).
  13. Lorger, M., Felding-Habermann, B. Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis. Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).
  14. Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage. J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).
  15. Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices. Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).
  16. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).
  17. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. , (2011).
  18. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J. Immunol. 188, 29-36 (2012).
  19. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).
  20. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).
  21. Baumert, B. G., et al. A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).
  22. Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. The biology of metastasis to a sanctuary site. Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).
  23. Pukrop, T., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58, 1477-1489 (2010).
  24. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowy sferoid rakamikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie time lapsemikroskopia konfokalnabarwienie GFAPinwazja mikroglejuocena inwazji nowotworowejzatapianie w Matrigelu
System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.