Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Streszczenie

Pojawia się naukowe zapotrzebowanie na niezawodne narzędzia do monitorowania transportu białek błonowych. Przedstawiono metodykę prowadzącą do rekonstytucji pomp wypływowych bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa w środowisku biomimetycznym, które pozwala na dokładne zbadanie ich aktywności transportowej. Spełnione są trzy warunki wstępne: podział na przedziały w środowisku lipidowym, zastosowanie odpowiedniego wskaźnika do transportu oraz wygenerowanie gradientu protonów. Transporter białek błonowych jest odtwarzany w liposomach wraz z bakteriorodopsyną, aktywowaną światłem pompą protonową, która generuje gradient protonów, który jest solidny, a także odwracalny i przestrajalny. Aktywność białka określa się na podstawie zmian pH zachodzących w liposomie, przy użyciu piraniny, sondy fluorescencyjnej zależnej od pH. Opisujemy krok po kroku procedurę, w której omówiono oczyszczanie białek błonowych, tworzenie liposomów, rekonstytucję białek i analizę transportu. Chociaż zostały one specjalnie zaprojektowane dla transportera RND, opisane metody mogą być potencjalnie zaadaptowane do użytku z dowolnym innym transporterem białek błonowych zasilanym przez gradient protonów.

Wprowadzenie

Integralne białka błonowe reprezentują do 30% genów kodowanych w genomach eukariotycznych. Pełnią one kluczowe role, takie jak utrzymywanie bramek (receptorów), transport składników odżywczych, jonów lub szkodliwych związków (transportery) lub utrzymywanie przepuszczalności przez dwuwarstwy błonowe (kanały) między wszystkimi żywymi komórkami¹. Pompy wypływowe odgrywają kluczową rolę w oporności na antybiotykoterapię². U bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa, która jest chroniona przez błonę zewnętrzną, transportery wypływu są zorganizowane jako systemy trójdzielne, w których MexB, pompa wypływowa znajdująca się w błonie wewnętrznej, działa w połączeniu z MexA, białkiem peryplazmatycznym i OprM, zewnętrznym kanałem błonowym. Cytoplazmatyczne białko błony wewnętrznej działa jak zależna od energii pompa o szerokiej specyficzności substratowej. Białko błony zewnętrznej działa jak poryna, podczas gdy trzecie znajduje się w przestrzeni peryplazmatycznej i uważa się, że stabilizuje cały kompleks³. W dalszej części skupimy się na zaprojektowaniu testu funkcjonalnego dla zestawu MexA MexB.

Informacje strukturalne zostały zgromadzone w ciągu ostatnich 5 lat dzięki rentgenowskiemu określeniu homologicznego białka AcrB z Escherichia coli^4-7. Chociaż niewątpliwie ważne jest powiązanie takich informacji z danymi dynamicznymi i kinetycznymi, zaprojektowanie testu funkcjonalnego dla tego transportera jest prawdziwym wyzwaniem⁸. Rzeczywiście, białka błonowe muszą być utrzymywane w środowisku błoniastym, a zamknięta komora musi być utrzymywana, aby można było osiągnąć wektorowy transport substratu.

Rekonstytucja białek błonowych w proteoliposomach została szeroko przedstawiona i przejrzana (zobacz Rigaud i Levy⁹). Takie protokoły pozwalają na monitorowanie aktywności białek błonowych, na przykład poprzez śledzenie substratów w poprzek błony liposomowej. W tym przypadku ograniczenia wynikają z dostępności substratów dających się miareczkować (fluorescencyjnych, radioaktywnych itp.) oraz z faktu, że bardzo często podłoża te są hydrofobowe i mają tendencję do przenikania przez błony niezależnie od obecności transportera. Alternatywnie można śledzić spektroskopowe zmiany barwnika raportującego wrażliwego na zmiany chemiczne, które zachodzą w wyniku transportu. Jak wspomniano powyżej, protony zasilają transport przez MexB. W związku z tym istotną opcją jest monitorowanie zmian spektroskopowych barwnika raportującego wrażliwego na pH w celu śledzenia zmian pH spowodowanych transportem substratu przez protony. Wybór barwnika fluorescencyjnego pozwala uniknąć jakichkolwiek efektów sztucznych ze względu na hydrofobowy charakter podłoża.

Dodatkowym utrudnieniem jest generowanie gradientu protonów. W literaturze można znaleźć kilka protokołów. Wśród nich szeroko rozpowszechnione jest stosowanie techniki walinomycyny, ale wykazaliśmy, że wykonywanie^10-11 jest żmudne. Co więcej, nie jest ona odtwarzalna i nie jest odwracalna. Uciekliśmy się do użycia bakteriorodopsyny (BR), aktywowanej światłem pompy protonowej z Halobacter salinarium, halofilnego morskiego imperatywnego archeonu tlenowego Gram-ujemnego. Białko to jest rdzeniowo tworzone w liposomach za pomocą MexB, a po oświetleniu BR pompuje protony do wnętrza liposomów, a tym samym wytwarza ∆pH (kwaśne wnętrze) potrzebne białku do transportu substratu^12-13.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie białek

1. MexA, MexB z Pseudomonas aeruginosa
   1. Przekształć plazmidy zawierające geny MexA i MexB w szczepie produkcyjnym E. coli (np. C43 DE3). Talerz na podłożu LB Agar uzupełniony odpowiednim antybiotykiem. Wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić prekulturę O/N. Następnego ranka zaszczepić prekulturę w 1 l LB i rosnąć w temperaturze 37 °C pod mieszaniem (240 obr./min).
   2. Gdy komórki osiągną fazę wykładniczą (OD₆₀₀ = 0,6-0,8), indukuj 1 mM IPTG. Przeprowadzać indukcję przez 2-3 godziny w temperaturze 30 °C pod wpływem mieszania.
   3. Odwirować komórki (9 000 x g przez 20 min) i ponownie zawiesić w 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM.
   4. Rozbij komórki za pomocą prasy francuskiej (10 000 psi, 4 przejścia). Odrzucić nieuszkodzone komórki i inkluzje przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 20 minut.
   5. Membrany do granulek 1 godzinę przy 100 000 x g i ponownie zawiesić każdą granulkę w 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w/v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM.
   6. Oznaczyć całkowite stężenie białka błonowego za pomocą testu kolorymetrycznego BCA i rozpuścić błony O/N z 2% maltozydem dodecylu (DDM) w końcowej objętości oznaczonej tak, aby białko detergentu wynosiło 1:1,5 (w/w).
   7. Ultrawirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę, aby odrzucić nierozpuszczony i zagregowany materiał.
   8. Inkubować supernatant przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z żywicą niklową (oczyszczanie MexA) lub żywicą kobaltową (oczyszczanie MexB) zrównoważoną z Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolem 5% (w/v), imidazolem 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   9. Wlej żywicę do pustej kolumny. Zbierz przepływ.
   10. Żywicę przemyć 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolu 20% (w/v), imidazolu 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, następnie 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolu 5% (w/v), imidazolu 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   11. Eluować białko za pomocą 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolu 5% (w/v), imidazolu 300 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.
   12. Zagęścić białko za pomocą urządzenia do ultrafiltracji do 3 ml i załadować na kolumnę odsalającą zrównoważoną buforem bez imidazolu. Tuż przed rozpuszczeniem (patrz poniżej) należy ultraodwirować rozpuszczone białka (100 000 x g przez 20 minut), aby pozbyć się lipidów i nierozpuszczonych białek. Następnie ponownie zagęścić białko do 0,3 ml.
2. Bakteriorodopsyna z Halobacter salinarium
   1. Hodować komórki Halobacter salinarium pod oświetleniem w temperaturze 37 °C przez 10 dni w płynnej pożywce wzrostowej zawierającej NaCl 4 M, MgSO₄ 150 mM, cytrynian 10 mM, KCl 30 mM, ekstrakt drożdżowy 5 g/l i pepton 5 g/l.
   2. Rozbijaj komórki poprzez dializę przeciwko wodzie dejonizowanej.
   3. Oczyść fioletową błonę na gradiencie sacharozy 30-40% (w/v) (100 000 x g przez 17 godzin).
   4. Zawiesinę błonową rozpuścić z 2% oktyloglukozydem przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (objętość do rozpuszczania w celu ponownego zawieszenia membrany w stosunku 2:1 (m/w) detergentu do białka). Oszacuj stężenie rozpuszczonego BR za pomocą ε (570 nm) = 54 000 ^{M-1 cm-1}. Tuż przed rozpuszczeniem (patrz poniżej) należy ultraodwirować rozpuszczony BR (100 000 x g przez 20 minut), aby pozbyć się lipidów i nierozpuszczonych białek.
      Uwaga: Natywne membrany są naturalnie wzbogacone w BR, więc nie jest potrzebne dalsze oczyszczanie.

2. Przygotowanie proteoliposomów

1. Tworzenie liposomów: Umieść 400 μl DOPC rozpuszczonego w chloroformie (25 mg/ml) w szklanej zlewce i dodaj 1,5 mg cholesterolu przechowywanego w postaci proszku. Wysuszyć je tuż przed manipulacją pod parą azotu lub odkurzyć przez co najmniej 1 godzinę w szklanej zlewce. Stosunek DOPC do mola cholesterolu wynosi 3,3:1.
   1. Po wyschnięciu należy uwodnić lipidy 1 ml HEPES 25 mM pH 7, K₂SO₄ 100 mM, MgCl₂ 2 mM, piraniny 2 mM. Na tym etapie zawieszenie powinno wydawać się mętne.
   2. Podgrzewać roztwór przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Sonikować przez 10 minut przy 40 W z 30-sekundowym impulsem, 30-sekundowe cykle przerwy w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zawieszenie powinno wydawać się jasne.
   3. Aby uzyskać monodyspersyjną populację liposomów, należy wykonać dwa cykle ekstruzji i dla każdego cyklu przepuścić zawiesinę liposomów przez filtr co najmniej 11x. W pierwszym cyklu należy użyć porów membrany o wielkości 200 nm, a w drugim cyklu o wielkości porów membrany 100 nm. Na tym etapie można przeprowadzić pomiary dynamicznego rozpraszania światła w celu sprawdzenia jednorodności zawieszenia.
2. Włączenie białka
   Zasada: białka błonowe można odtworzyć w liposomach dzięki solubilizującemu działaniu detergentów. Liposomy rozpuszczone w detergentach są inkubowane z białkiem błonowym rozpuszczonym w detergentach, a tworzenie proteoliposomów jest wywoływane przez szybką eliminację detergentu za pomocą kulek polistyrenowych⁹.
   1. Dodać 28 mg Triton X-100 (0,56% końcowy) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C (temperaturę rozpuszczania można dostosować do badanego białka).
   2. Dodać rozpuszczone w detergentach białko (BR, MexB i MexA) do rozpuszczonych liposomów i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać białka do rozpuszczonej zawiesiny liposomów w następujących proporcjach (w/w): lipidy/MexB = 20, MexB/MexA = 2,5 i lipidy/BR = 30.
   3. Dodaj kulki polistyrenowe w stosunku 30:1 kulki do detergentu (w/w, biorąc pod uwagę całkowitą masę detergentu, w tym detergentu dodanego z oczyszczonymi białkami) i inkubować przez 5 godzin, w ciemności (ze względu na BR) w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem. Przed tą procedurą aktywuj biokulki inkubacją metanolu i etanolu i dokładnie przemyj wodą.
   4. Oczyść białka proteoliposomów i wolne substraty za pomocą kolumny odsalającej PD-10 zrównoważonej HEPES 25 mM pH 7, K₂SO₄ 100 mM i MgCl₂ 2 mM.
   5. Przechowuj proteoliposomy w temperaturze 18 °C w ciemności przez okres do 2-3 tygodni.
3. Ocena skuteczności rekonstytucji w gradieniu sacharozy.
   Aby sprawdzić, czy zarówno MexB, jak i BR zostały odtworzone w liposomach, należy oczyścić zawiesinę proteoliposomów w nieciągłym gradiencie sacharozy.
   1. Delikatnie osadź proteoliposomy na pięciowarstwowym gradiencie sacharozy (60%, 20%, 10%, 5% i 2,5%, w/v).
   2. Ultrawirowanie przez 17 godzin przy 100 000 x g (przy minimalnych prędkościach przyspieszania i zwalniania).
   3. Ostrożnie zbierz różne frakcje gradientowe (zwłaszcza interfejsy między każdą warstwą sacharozy) i przeanalizuj je na SDS-PAGE (10%) za pomocą barwienia Coomassie lub Western blot. Zagregowane białka znajdują się na dnie tuby, podczas gdy niewłączone, rozpuszczone w detergentach białka znajdują się na górze probówki. Proteoliposomy i liposomy znajdują się na granicy faz sacharozy, które odpowiadają ich wewnętrznej gęstości. Puste liposomy są odzyskiwane dalej w gradiencie niż proteoliposomy.

3. Pomiar fluorescencji

1. Pomiary fluorescencji należy wykonywać w temperaturze 25,0 °C za pomocą spektrofluorometru pozwalającego na pomiary podwójnej długości fali (lampa Xe, 150 W). Naprzemienne okresy oświetlenia (w celu aktywacji BR o długości fali wzbudzenia / emisji 550 nm / 550 nm) oraz pomiary fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia / emisji 455 nm / 509 nm przez 2 sekundy w celu pomiaru fluorescencji piraniny. Ustaw pasmo wzbudzenia i emisji na 5 nm. Pomiary należy wykonać w obecności 50 nM walinomycyny, aby zapobiec tworzeniu się odwrotnego potencjału błonowego ΔΨ,
   Uwaga: Rzeczywiście, ponieważ BR pompuje protony, wewnątrz liposomu jest więcej ładunków dodatnich niż na zewnątrz. Ten gradient ładunku można odrzucić za pomocą walinomycyny, która jest jonoforem selektywnym K⁺. Po dodaniu do zawiesiny liposomów walinomycyna, jako cząsteczka hydrofobowa, wprowadzi się do błony liposomowej, biernie transportując K⁺, a tym samym rozpraszając potencjał błonowy ΔΨ.

Wyniki

Analiza polega na monitorowaniu fluorescencji pyraniny w funkcji czasu podczas generowania gradientu protonowego. W tym celu próbki poddawane są naprzemiennie oświetleniu (co uruchamia pompowanie protonów przez BR), a następnie pomiarowi fluorescencji z wykorzystaniem długości fal wzbudzenia i emisji pyraniny (λ_ex = 455 nm i λ_em = 509 nm).

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywną próbę kontrolną uzyskaną w tym teście w obecności MexA/MexB, potwierdzającą, że gradient protonowy generowany przez BR jest odwracalny. Po jednym cyklu zakwaszania proteoliposomy są przechowywane w ciemności przez 45 min, aby BR przestało pompować protony (protony dyfundują powoli i pasywnie przez dwuwarstwy lipidowe zgodnie z gradientem stężeń). Po tym czasie regeneracji ponowna aktywacja BR jest możliwa poprzez ponowne naświetlenie tej samej zawiesiny.

Rycina 2 przedstawia rzeczywisty pomiar transportu. Kontrola negatywna z liposomami wolnymi od białek pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami pH pozostaje stałe podczas naświetlania (Ryciny 2A i 2B, pomarańczowe okręgi). Jednak proteoliposomy zawierające BR w swoich błonach pompują protony, w związku z czym pH wewnątrz liposomu spada i tworzy się stabilny gradient (Ryciny 2A i 2B, fioletowe kwadraty). Szare trójkąty i czerwone romby (Rycina 2A) reprezentują pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB, odpowiednio w obecności lub w nieobecności Hoechst 33342. Obserwujemy aktywność niezależną od substratu, w której gradient protonowy jest tylko częściowo rozpraszany przez kontratransport MexB. Obserwację tę przypisujemy aktywności podstawowej MexB.

Aby zbadać wpływ MexA na aktywność MexB, do rekonstytucji dodano MexA, najpierw w obecności samego białka, bez żadnego substratu (Rysunek 2B, niebieskie romby). Ponownie gradient protonowy generowany przez BR zostaje rozproszony tylko częściowo. Właściwy pomiar transportu przeprowadzono na tej samej próbce. Wcześniej należy ponownie zainicjować gradient protonowy i dodać substrat do zawiesiny, aby dotarł on do miejsca wiązania w białku. W tym celu zawiesinę inkubowano w ciemności w obecności substratu przez 45 min. Po następnym naświetleniu można zauważyć, że gradient protonowy generowany przez BR jest teraz całkowicie rozproszony przez MexAB (Rysunek 2B, zielone trójkąty), co jest następstwem transportu substratu przez pompę.

Rysunek 1. Odwracalność gradientu protonowego wytworzonego przez naświetlanie BR: Fluorescencja pyraniny w proteoliposomach BR mierzona w funkcji czasu. Od 0 do 15 min BR pompuje protony w wyniku aktywacji światłem. Od 15 do 60 min proteoliposomy są inkubowane w ciemności; w tym czasie protony pasywnie opuszczają liposomy, aż do momentu wyrównania pH wewnątrz pęcherzyków i pH na zewnątrz. Od 60 do 75 min BR nadal pozostaje funkcjonalny i pompuje protony po naświetleniu.

Rysunek 2. Analiza transportu: fluorescencja pyraniny, przeliczona na odpowiadające jej zmiany pH, w funkcji czasu. A>) pH wewnątrz liposomów kontrolnych (pomarańczowe koła); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR w błonie (fioletowe kwadraty); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB w błonie bez Hoechst 33342 (czerwone romby); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB w błonie z Hoechst 33342 (szare trójkąty). B>) pH wewnątrz liposomów kontrolnych (pomarańczowe koła); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR w błonie (fioletowe kwadraty); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR, MexB i MexA w błonie bez Hoechst 33342 (niebieskie romby); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR, MexB i MexA w błonie z Hoechst 33342 (zielone trójkąty).

Dyskusja

Opisujemy procedurę rekonstytucji przeznaczoną do oznaczania transportu białek błonowych. Po ustaleniu, procedura rekonstytucji białka prowadzi do pomiarów, które są bardzo powtarzalne. Jednak dokładne warunki odtworzenia białka będą się różnić w zależności od białka. Należy zwrócić dużą uwagę na optymalizację następujących parametrów: i) jakość oczyszczania (czystość i brak zagregowanego materiału); ii) skuteczność etapu solubilizacji detergentu (jeśli to możliwe, należy preferować detergent o niskiej CMC, ponieważ łatwiej się ich pozbyć); iii) desorpcja detergentu (możliwe jest na przykład połączenie stosowania kulek polistyrenowych z etapem dializy, ale może to wpływać na szybkość desorpcji, parametr krytyczny dla późniejszej aktywności białka, patrz odnośnik [9]); iv) Rekonstytucja lipidów (charakter chemiczny lipidów, stosunek lipidów do białek, obecność dodatkowych amfifilów to krytyczne parametry, które należy zmieniać i optymalizować). Ponadto temperatura i czas inkubacji wpływają na wszystkie te kwestie.

Kontrola jakości jest zatem pierwszorzędna na każdym etapie procesu rekonstytucji. Z tego punktu widzenia rozpraszanie światła jest bardzo wygodną techniką, ponieważ jest szybkie, nieniszczące i wymaga jedynie 20 μl próbki o stężeniu w zakresie mikromolowym. Po utworzeniu proteoliposomów bardzo pomocny jest również gradient sacharozy, który otwiera drogę do systematycznej weryfikacji rekonstytucji: jakościowej (czy białko jest rzeczywiście osadzone w błonie liposomowej), a także ilościowej (ile białka w jednym liposomie). Tym ostatnim rozwiązaniem zostałby rozwiązany poprzez precyzyjny pomiar stężeń białek i lipidów.

Nasz test nie opiera się na miareczkowaniu samego substratu, co pozwala uniknąć niełatwych rozważań dotyczących możliwej sztucznej biernej dyfuzji cząsteczki z powodu hydrofobowego podziału w błonach. Test wykorzystuje właściwości piraniny jako wiarygodnej i ilościowej sondy do monitorowania zmian pH. Nasze wyniki są zgodne z wynikami uzyskanymi za pomocą innej procedury, w której tworzenie gradientu protonów przeprowadzono przy użyciu walinomycyny¹⁰, ale pozwala to na uzyskanie bardziej wytrzymałego i powtarzalnego gradientu¹¹. Ponadto, gradient protonów może być precyzyjnie dostrojony, po prostu zmieniając stężenie bufora (więcej szczegółów patrz Verchere et al.^{Rozdział 12}).

W procedurze najpierw wykonuje się pomiar kontrolny przy braku substratu (daje to dostęp do biernej aktywności białka). Rzeczywista aktywność transportera białek błonowych jest następnie mierzona po dodaniu substratu do tej samej kuwety. Jest to naprawdę atut, ponieważ eksperyment można uznać za autentyczny, jednoznaczny wynik wywołany substratem.

Protokół można dostosować do automatyzacji o wysokiej i średniej przepustowości (na przykład pomiary 96-dołkowe), ponieważ oświetlenie próbki wyzwala reakcję. Automatyzacja i zrównoleglenie polegałyby na przygotowaniu dużej partii proteoliposomu i dozowaniu porcji w 96-dołkowej płytce. Następnie dodawane byłyby substraty (a także ewentualne inhibitory) i po inkubacji w ciemności przez 45 minut płytka byłaby poddawana cyklom pomiaru oświetlenia / fluorescencji piraniny na czytniku mikropłytek.

Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat protokołu, czytelnicy są proszeni o zapoznanie się z Verchere i wsp. ^12,13

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Piranina (8- kwas hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowy)	Invitrogen	H-348
DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranozyd)	Affymetrix	D310LA
(wytłaczarka, gazoszczelne strzykawki Hamilton)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbenty	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatografia pusta kolumna	Biorad	732-1010
Kolumny odsalające	Bio-Rad	54805
Dynamiczny przyrząd do rozpraszania światła	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometr JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A

Zestaw ekstrudera