Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50926

⸱

26 grudnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Streszczenie

MALDI-TOF jest szeroko stosowaną techniką spektrometrii mas w chemii i biochemii. Znalazł również zastosowanie w medycynie do identyfikacji cząsteczek i biomarkerów. Ostatnio znalazł zastosowanie w mikrobiologii do rutynowej identyfikacji bakterii wyhodowanych z próbek klinicznych, bez etapów przygotowania lub frakcjonowania. My i inni z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę spektrometrii mas MALDI-TOF dla całych komórek do komórek eukariotycznych. Obecne zastosowania obejmują zarówno identyfikację typów komórek, jak i kontrolę jakości, ocenę hodowli komórkowych i zastosowania diagnostyczne. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Pozwoliło to na zidentyfikowanie odcisków palców specyficznych dla makrofagów, które są reprezentatywne dla różnorodności odpowiedzi proteomicznych makrofagów. Ta aplikacja ilustruje dokładność i prostotę metody. Opisany tutaj protokół może być przydatny do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza w stanach patologicznych lub może zostać rozszerzony na szersze zastosowania diagnostyczne.

Wprowadzenie

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas czasu przelotu (MALDI-TOF MS) jest popularną techniką spektrometrii mas do badania próbek biologicznych. Zastosowanie wiązki laserowej i matrycy pochłaniającej energię umożliwia miękki proces jonizacji: parowanie i genezę dużych, w większości jednoładowanych biomolekuł. Proces ten nazywa się desorpcją/jonizacją, co uzasadnia akronim MALDI. Jony te są następnie przyspieszane przez przyłożenie napięcia i wprowadzane do analizatora TOF, który umożliwia oddzielenie tych jonów i ilościowe określenie ich odpowiednich mas1.

MALDI-TOF MS jest szeroko stosowany w biologii, chemii i medycynie do identyfikacji molekuł i biomarkerów2-4 lub do monitorowania modyfikacji potranslacyjnych na proteins5,6. Ostatnio kilka grup zastosowało MALDI-TOF MS do identyfikacji mikroorganizmów z próbek klinicznych7,8. To zastosowanie mikrobiologiczne jest obecnie rutynowo stosowane w warunkach klinicznych. Cała komórka MALDI-TOF ma wiele zalet w porównaniu z klasycznymi zastosowaniami MALDI-TOF MS. Próbki zawierające całe komórki są przetwarzane bezpośrednio, co pozwala uniknąć czasochłonnych etapów frakcjonowania lub oddzielania dużych ilości materiału. Co więcej, nie jest potrzebna charakterystyka różnych pików: całe widmo jest traktowane jako odcisk palca próbki, a algorytmy dopasowywania porównują badane widmo z bazą danych widm referencyjnych.

My i inni zastosowaliśmy tę technikę analizy całych komórek do komórek eukariotycznych. Technika ta może mieć wiele zastosowań: (1) identyfikacja głównych typów komórek z próbki mieszanej9-11; 2) ocena żywotności kultur komórkowych w czasie (w tym zastosowania przemysłowe w zakresie kontroli jakości)12; (3) monitorowanie stanów aktywacji pojedynczego ogniwa typu13; (4) ocenić złośliwą przemianę próbki klinicznej14,15.

Tutaj opisujemy użycie całokomórkowego MALDI-TOF MS do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej na patogeny drobnoustrojowe. Wykrywają czynniki zakaźne w tkankach za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców, które są w stanie wykryć konserwatywne wzorce mikrobiologiczne, takie jak lipopolisacharyd (LPS)16. Makrofagi to profesjonalne komórki prezentujące antygen, które oddziałują z limfocytami T w celu wytworzenia adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty T wpływają na makrofagi poprzez uwalnianie cytokin, które wzmacniają lub regulują aktywność mikrobójczą makrofagów. Analogicznie do polaryzacji limfocytów Th1 / Th2, makrofagi zapalne, bakteriobójcze i rakobójcze zostały sklasyfikowane jako makrofagi M1, a makrofagi immunoregulacyjne jako makrofagi M217-19. Termin M1 odnosi się do klasycznej aktywacji makrofagów przez cytokiny typu I, takie jak interferon (IFN)-γ i czynnik martwicy nowotworu (TNF) lub produkty bakteryjne, takie jak LPS18,20-23, podczas gdy makrofagi aktywowane przez alternatywne szlaki (interleukina (IL)-4, IL-10, transformujący czynnik wzrostu-β1 są uważane za makrofagi M219,24,25. Wysoka plastyczność fenotypowa i funkcjonalna makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko sprawia, że makrofagi te są przydatne do analizy subtelnych zmian za pomocą podejścia MALDI-TOF MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W obecnym protokole, technika MALDI-TOF dla całej komórki jest używana do uzyskania widma masowego traktowanego jako odcisk palca próbki. Analiza bioinformatyczna pozwoliła na porównanie i sklasyfikowanie tych odcisków palców. Protokół ten składał się z trzech głównych części:

  1. Przygotowanie próbek biologicznych: makrofagi kontrolne i makrofagi stymulowane różnymi agonistami.
  2. Analiza każdego rodzaju próbki z kontrpróbami technicznymi za pomocą całokomórkowych MALDI-TOF MS.
  3. Bioinformatyczna analiza surowych danych.

Przygotuj sterylne roztwory do izolacji komórek i hodowli. Przygotować i przechowywać wszystkie odczynniki w temperaturze 4 °C

1. Przygotowanie ludzkich monocytów

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych. Dodać 55 ml ludzkiej surowicy AB+ lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml roztworu antybiotyku (penicylina w stężeniu 10 000 j.m./ml i streptomycyna w stężeniu 10 000 μg/ml; stężenie końcowe 100 j.m./ml dla penicyliny i 100 μg/ml dla streptomycyny) do pożywki RPMI 1640 (500 ml).
    1. Wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z leukopacków (koncentratów leukocytów).
      1. Przygotować 50 ml probówek zawierających 15 ml Ficollu. Rozcieńczyć krew w roztworze soli fizjologicznej (obj./obj., 1/10). Umieść 30 ml rozcieńczonych PBMC na Ficoll, jak opisano wcześniej26.
      2. Wirować przy 700 x g przez 20 min. Odzyskać PBMC na granicy faz między Ficollem (gęstość 1,077 g/ml) a rozcieńczonym osoczem. Rozcieńczyć PBMC w pożywce hodowlanej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    2. Przygotuj monocyty CD14+ z PBMC za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD14.
      Uwaga: Produkty i komórki należy przechowywać w temperaturze 4 °C aż do ustąpienia monocytów.
      1. Przygotować bufor do pracy składający się z buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
      2. Delikatnie zdysocjuj granulowane PBMC (107 komórek na test) na 80 μl działającego buforu.
      3. Dodaj 20 μl mikrokulek CD14 do PBMC. Mieszać i inkubować PBMC przez 15 minut. Przemyć PBMC 5 ml bieżącego buforu i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować granulowane PBMC na 500 μl buforu roboczego dla 108 PBMCs.
        Uwaga: należy użyć 500 μl buforu bieżącego dla stężeń PBMC niższych niż 108 PBMC.
      4. Przejdź do separacji magnetycznej.
        Uwaga: w przypadku mniej niż 2 x 108 PBMC należy użyć kolumny MS; dla więcej niż 2 x 108 PBMC i mniej niż 2 x 109 PBMC użyj kolumny LS.
      5. Przepłukać kolumnę wstępną i kolumnę działającym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS).Dodaj PBMC do kolumny wstępnej (poczekaj, aż komórki bez etykiet przejdą przez kolumnę). Przepłukać 3 razy bieżącym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS). Usuń kolumnę wstępną.
      6. Umieścić kolumnę na probówkach o pojemności 15 ml. Dodaj bufor do biegania (1 ml dla kolumny MS lub 5 ml dla kolumny LS) na kolumnę i eluuj komórki CD14 +, wywierając nacisk na kolumnę.
      7. Odwirować eluat o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Przemyć osad monocytów 10 ml pożywki hodowlanej.
        Uwaga: Przeanalizuj czystość preparatu monocytów przy użyciu przeciwciał anty-CD14 i cytometrii przepływowej (klasycznie wyższej niż 95%).
  2. Różnicowanie monocytów w makrofagi.
    1. Inkubować monocyty (10-6 monocytów na basenie na płytkach 6-dołkowych) w 3 ml pożywki zawierającej 10% ludzkiej surowicy AB+ w temperaturze 37 °C. Po 4 dniach należy zastąpić pożywkę zawierającą surowicę ludzką pożywką hodowlaną zawierającą 3 ml pożywki zawierającej 10% FBS na dodatkowe 3 dni.
    2. Zidentyfikuj uzyskaną populację komórek jako makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) za pomocą cytometrii przepływowej (patrz ryc. 1).
      1. Zastąp pożywkę hodowlaną 3 ml PBS. Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Wirować przy 400 x g przez 5 min. Dodać PBS zawierający 2% BSA do granulowanych MDM i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Dostosować stężenie komórek (10-6 MDM w 200 ml PBS) i inkubować w temperaturze 4 °C.
      2. Dodać 10 ml przeciwciał anty-CD14 i 10 ml przeciwciał anty-CD68 do zawiesiny MDM i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
        Uwaga: przeciwciała te muszą być znakowane dwoma różnymi fluorochromami zgodnymi z analizą cytometrii przepływowej. Na przykład przeciwciała anty-CD14 mogą być sprzężone z fikoerytryną (do barwienia monocytów), a przeciwciała anty-CD68 sprzężone z Alexa Fluor 647 (do barwienia makrofagów).
      3. Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatanty. Delikatnie zdysocjuj osad komórkowy i inkubuj MDM w 250 ml 3% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować MDM z utrwalonym PFA przy 400 x g przez 5 min. Przemyć MDM 3 ml PBS i odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować osad MDM w 400 ml PBS.
      4. Przeanalizuj różnicowanie monocytów (które wyrażają CD14, ale nie CD68) w monocyty (które wyrażają CD68, ale nie CD14). Uwaga: klasycznie ponad 95% komórek to MDM.
  3. 18 godzinna stymulacja MDM.
    1. Zastąp pożywkę z przylegających MDM świeżą pożywką o pojemności 3 ml (zawierającą 10% FBS).
    2. Aby wywołać polaryzację M1 lub M2, użyj następujących ludzkich rekombinowanych cytokin: IFN-γ i TNF do polaryzacji M1 oraz IL-4 do polaryzacji M2. Makrofagi M1 uzyskuje się również przez stymulację LPS. Należy zauważyć, że roztwory podstawowe cytokin są konserwowane w temperaturze -80 °C, a roztwór podstawowy LPS zachowuje się w temperaturze -20 °C.
      1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy IFN-gγ (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IFN-γ do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IFN-γ 20 ng/ml.
      2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy TNF (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia TNF do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie TNF 20 ng/ml.
      3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy IL-4 (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej, aby uzyskać rozcieńczenie 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IL-4 do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IL-4 20 ng/ml.
      4. Dodać 3 μl roztworu podstawowego LPS (1 mg/ml) do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie LPS 1 μg/ml.
    3. Aby stymulować MDM bakteriami, użyj bakterii zabitych termicznie. Umyj żywe bakterie PBS i podgrzewaj je w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. Użyj Orientia tsutsugamushi (szczep Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG szczep 671203) i Coxiella burnetii (Nine Mile w fazie I), ponieważ wiadomo, że te patogeny infekują makrofagi. W ten sposób należy przygotować zawiesinę O. tsutsugamushi o stężeniu 109 bakterii/ml. Dodaj 50 μl do MDM. Powtórz ten sam krok dla M. bovis i C. burnetii.
  4. Przygotowanie próbek biologicznych do MALDI-TOF MS.
    1. Przemyt stymulowane MDM PBS bez Ca2+ lub Mg2+ (komórki mogą aglutynować w obecności Ca2+ lub Mg2+). Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Odwirować MDM. Ponownie umyć MDM w PBS bez Ca2+ lub Mg2+ w 400 x g przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenie FBS.
    2. Dostosuj stężenie komórek (2 x 106 MDM na test). Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatanty. Zebrać granulki komórek w 20 μl PBS bez Ca2+ lub Mg2+.
    3. Przed analizą należy natychmiast przeanalizować próbki lub przechowywać je w PBS w temperaturze -80 °C.

2. Analiza makrofagów przez całe komórki Maldi-TOF MS

  1. Przygotowanie matrycy CHCA.
    1. Do fiolki dodać 500 μl acetonitrylu, 250 μl 10% kwasu trifluorooctowego i 250 μl wody z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Rozcieńczyć 10 mg CHCA w tym roztworze do końcowego stężenia 10 mg/ml. Mieszać i sonikować przez co najmniej 20 minut.
      Uwaga: sonikacja poprawi nasycenie matrycy, ale ten krok nie jest obowiązkowy.
    2. Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić osad i zachować supernatant.
      Uwaga: roztwór matrycy należy przygotować tuż przed użyciem. Roztwór matrycy zawierający kryształy nie pozwala na dobrą jonizację cząsteczek próbki, a to może mieć wpływ na jakość widm.
  2. Przygotowanie tarczy stalowej MALDI.
    1. Zwilż tarczę z polerowanej stali gorącą wodą z kranu. Przetrzyj precyzyjnym papierem do wycierania. Dodaj 70% etanolu i natrzyj. Spłucz wodą przez pocieranie. Dodaj 70% etanolu i przetrzyj precyzyjnym papierem.
    2. Zanurz tarczę w 70% etanolu i poddaj sonikacji na co najmniej 15 minut. Przykryj tarczę 500 μl do 1 ml kwasu trifluorooctowego w stężeniu 80%. Przetrzyj i wytrzyj precyzyjnym papierem. Spłucz wodą HPLC bez pocierania. Wysuszyć tarczę w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: niewłaściwie oczyszczony cel może wpłynąć na jakość widm.
  3. Przygotowanie depozytów.
    1. Umieść czysty cel na poziomym i równym wsporniku, aby uzyskać jednolite osady.
    2. Delikatnie rozmrozić próbki MDM na lodzie. Uwaga: szybkie i energiczne rozmrażanie może zmienić próbki, wpływając w ten sposób na jakość widm. Homogenizować MDM (przez pipetowanie tam i z powrotem zawiesiny komórek) przed nałożeniem 1 μl (zawierającego około 1 x 105 komórek) na tarczę MALDI. Dodać 1 μl roztworu matrycy MALDI na próbkę. Unikać mieszania miejsca z pipetą. Mieszanie plam za pomocą pipet zmienia jakość widm. Umieścić 12-16 próbek/test (kontrpróby techniczne).
    3. Odparować samoistnie w temperaturze pokojowej. Uwaga: parowanie odbywa się stopniowo i prowadzi do powstania kryształów matrycy/próbki. Osady mogą być natychmiast analizowane lub przechowywane w ciemności przez kilka dni przed analizą (do 2 tygodni).
    4. Użytkownik powinien sprawdzić, czy cytokiny lub bakterie zabijane termicznie użyte w eksperymencie nie zapewniają pików w zakresie widm stymulowanych makrofagów. W tym przypadku sprawdziliśmy, czy same cytokiny i bakterie zabijane termicznie nie dostarczały żadnego sygnału w badanym zakresie (0-20 kDa).
  4. Dostrajanie spektrometru mas i akwizycja danych.
    1. Wprowadzić stalową tarczę zawierającą próbki do spektrometru masowego.
    2. Skonfiguruj spektrometr mas i uruchom akwizycję danych. Użyj konfiguracji domyślnej do automatycznego pobierania danych.
    3. Uwaga: szczegółowy widok konfiguracji oprogramowania flexControl znajduje się w dodatku/tabeli 1. Może się to różnić w zależności od używanego spektrometru mas i oprogramowania.

3. Analiza bioinformatyczna

Uwaga: analiza bioinformatyczna została przeprowadzona przy użyciu darmowego oprogramowania do analizy statystycznej R o otwartym kodzie źródłowym, wraz ze specyficznymi bibliotekami analiz (MALDIquant). R można pobrać bezpłatnie z jego strony internetowej http://cran.r-project.org/. Szczegółowy opis skryptu znajduje się pod następującym materiał uzupełniający.

  1. Wczytywanie i wstępne przetwarzanie surowych danych.
    1. Przechowuj surowe dane na komputerze powiązanym ze spektrometrem mas w wielu plikach i folderach. Pobierz folder główny eksperymentu ze wszystkimi podfolderami. Skopiuj folder główny na komputer osobisty w celu analizy.
    2. Użyj bibliotek readBrukerFlexData i MALDIquant, aby załadować i przeanalizować surowe dane.
      Uwaga: readBrukerFlexData umożliwia załadowanie surowych danych ze spektrometru mas do określonego obiektu w R w celu dalszej analizy. Więcej informacji można znaleźć w opisie MALDIquant 27.
    3. Analiza wygenerowanych widm.
      Uwaga: każde widmo składa się z listy pików wraz z ich odpowiednimi masami i intensywnościami (obfitość względna). Użyj pierwiastka kwadratowego z intensywności, aby poprawić graficzną wizualizację widm. Skoryguj tło przy użyciu wrażliwego statystycznie nieliniowego algorytmu obcinania pików w celu oszacowania linii bazowej27. Użyj stosunku sygnału do szumu wynoszącego 6, aby wykryć szczyty. Weź pod uwagę, że wykryte piki są podobne we wszystkich widmach, gdy wartości masy/ładunku (m/z) mieszczą się w oknie 2,000 ppm.
  2. Definiowanie i obliczanie wyników. Klasyfikuj widma za pomocą hierarchicznego grupowania z algorytmem totema dla aglomeracji i macierzą odmienności opartą na odległości Jaccarda.
    Uwaga: indeks Jaccarda mierzy podobieństwo między zestawami próbek logicznych (tj. obecność/brak listy pików).
  3. Porównanie widm i oglądanie.
    1. Analizuj surowe wykresy widm. Uwaga: oś x reprezentuje stosunek m/z (w daltonach), a oś y reprezentuje intensywność (obfitość względną).
    2. Oceń podobieństwo między widmami za pomocą hierarchicznego grupowania. Reprezentują podobieństwo (lub rozbieżność) jako dendrogram.
    3. Oceń odtwarzalność za pomocą wirtualnej reprezentacji żelowej. Uwaga: wirtualna reprezentacja gel-view to zmodyfikowany wykres mapy cieplnej, na którym względna obfitość jest oznaczona kolorem o rosnącej intensywności koloru niebieskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest wykazanie dokładności metody MALDI-TOF MS całych komórek w ocenie reaktywności makrofagów na ich mikrośrodowisko.

Rycina 1 przedstawia przygotowanie stymulowanych makrofagów z próbek krwi. Rycina 2 obrazuje analizę monocytów oraz MDM za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że monocyty wykazywały ekspresję CD14, ale nie CD68 (Rycina 1A). Z kolei MDM wykazywały ekspresję CD68, ale nie CD14 (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje zastosowanie MALDI-TOF-MS na całych komórkach eukariotycznych. W tym miejscu ilustrujemy dokładność metody, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Sukces protokołu zależy od kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, każde zanieczyszczenie roztworem może zmienić widma. Na przykład ważne jest, aby umyć komórki w PBS w celu usunięcia pożywki hodowlanej i białek surowicy przed osadzaniem na celu. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, pot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. RO, JLM i CC są wynalazcami międzynarodowego patentu WO 2011/154650 o nazwie "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Podziękowania

Richard Ouedraogo jest wspierany przez grant z Ministère de la Santé (PHRC 2010). Dziękujemy Laurentowi Gorvelowi, Christophe'owi Flaudropsowi i Nicolasowi Amstrongowi za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
  2. Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
  3. Diamandis, E. P. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations. Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  4. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  7. Carbonnelle, E., et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification. J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).
  8. Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).
  9. Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).
  10. Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PloS One. 5 (10), 13691 (2010).
  11. Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping. Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).
  12. Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).
  13. Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages. J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).
  14. Amann, J. M., et al. Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).
  15. Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis. Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).
  16. Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections. Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).
  17. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).
  18. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  19. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  20. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  21. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).
  22. Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).
  23. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).
  24. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  25. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).
  26. Delaby, A., Gorvel, L., et al. Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency. J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).
  27. Gibb, S., Strimmer, K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja monocytówkomórki CD14-dodatniecytometria przepływowaprzygotowanie tarczy MALDImatryca CHCAanaliza spektralnarozróżnianie M1 M2
Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.