Artykuł metodologiczny

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

32.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50930

⸱

2 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Laboratory Animal Science, University of Zurich, 2Department of Genetics, Cell Biology & Development and Center for Genome Engineering, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Streszczenie

Transgeniczne myszy z specyficznymi dla danego miejsca modyfikacjami genomu (knockout, knock-in) mają kluczowe znaczenie dla analizowania złożonych systemów biologicznych, jak również dla modelowania chorób ludzkich i testowania strategii terapeutycznych. Niedawne postępy w stosowaniu zaprojektowanych nukleaz, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz system 9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 do inżynierii genomu specyficznego dla miejsca, otwierają możliwość przeprowadzenia szybkiej, ukierunkowanej modyfikacji genomu u praktycznie każdego gatunku laboratoryjnego bez konieczności polegania na technologii embrionalnych komórek macierzystych (ES). Eksperyment edycji genomu zazwyczaj rozpoczyna się od identyfikacji zaprojektowanych miejsc docelowych nukleazy w genie będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie konstrukcji niestandardowych domen wiążących DNA, aby skierować aktywność nukleazy do zdefiniowanego przez badacza locus genomu. Plazmidy nukleazy projektowanej są transkrybowane in vitro w celu wytworzenia mRNA do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający osiągnięcie ukierunkowanej modyfikacji genomu poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy.

Wprowadzenie

Myszy są zdecydowanie najpopularniejszą platformą do generowania transgenicznych modeli zwierząt. Wszechstronny zestaw narzędzi do inżynierii genetycznej zarodkamyszy 1-3 został niedawno rozszerzony o podejścia do edycji genomu oparte na zaprojektowanych nukleazach, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN)4-6, nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN)7,8 oraz system zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9. ZFN i TALEN funkcjonują jako pary dwóch specjalnie zaprojektowanych domen wiążących DNA opartych na białkach (odpowiednio układy białek palca cynkowego i reszt o zmiennej powtarzalności (RVD), z których każda jest sprzężona z endonukleazą FokI10-12. I odwrotnie, specyficzność rozszczepienia DNA za pośrednictwem Cas9 jest zapewniona przez transaktywację RNA CRISPR (crRNA i tracrRNA, które można również połączyć w pojedynczą chimeryczną cząsteczkę RNA zwaną przewodnikiem RNA)11, które działają w kompleksie z białkiem CRISPR.

TALENy z określoną sekwencją RVD mogą być szybko konstruowane przez indywidualnych eksperymentatorów z wieloma strategiami montażu do wyboru od13 do 17. CRISPR/Cas9 obiecuje jeszcze mniej pracochłonne generowanie nukleaz projektowanych, jednak specyficzność wiązania przewodnika RNA-DNA nadal nie została w pełni rozwiązana18,19. Wytwarzanie niestandardowych ZFN było do tej pory ograniczone do wyspecjalizowanych laboratoriów akademickich i dostawców komercyjnych, takich jak Sangamo Biosciences i serwis Sigma CompoZr.

Ogólnie rzecz biorąc, edycja genomu za pomocą nukleaz projektanta ma na celu wprowadzenie pęknięć podwójnej nici (DSB) w określonych loci genomowych, które następnie przyciągają niehomologiczne mechanizmy naprawy DNA do łączenia końców (NHEJ) lub rekombinacji homologicznej (HR)10,12. Naprawa DSB za pośrednictwem NHEJ często skutkuje wprowadzeniem wstawień i usunięć w bliskiej odległości od miejsca naprawy. W ten sposób naprawa NHEJ może być wykorzystana do wyeliminowania funkcji genu docelowego poprzez wprowadzenie mutacji z przesunięciem ramki odczytu w sekwencji genów kodujących białko4,7,9. Alternatywnie, zdefiniowane dodawanie lub zastępowanie informacji genetycznej można osiągnąć poprzez dostarczenie dawcy DNA wraz z zaprojektowanymi nukleazami. Dawca DNA składa się z zaprojektowanych przez badaczy sekwencji DNA otoczonych regionami homologii z locus docelowym, służąc w ten sposób jako matryca do naprawy DSB przez HR. Zarówno plazmidy5,6,20, jak i jednoniciowe oligonukleotydy8,9,21 zostały z powodzeniem wykorzystane jako dawcy. Ani edycja genomu za pośrednictwem NHEJ, ani HR nie wymaga wprowadzenia selektywnego markera do genomu zarodka myszy, co sprawia, że strategie te szczególnie dobrze nadają się do tworzenia niewielkich zmian w sekwencji nukleotydów bez naruszania ogólnej architektury genetycznej.

W tym protokole opisujemy wszystkie niezbędne procedury edycji genomu w embrionie myszy za pomocą TALEN-ów. Obejmują one: 1) identyfikację miejsca docelowego TALEN22, 2) budowę TALEN-ów poprzez klonowanie Golden Gate13, 3) syntezę mRNA TALEN in vitro, 4) mikroiniekcję mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy, 5) zabiegi chirurgiczne transferu zarodków oraz 6) analizę mutagenezy indukowanej przez TALEN u zwierząt założycielskich. Koncentrujemy się na mikroiniekcji mRNA TALEN i badaniach przesiewowych założycieli pod kątem insercji/delecji wywołanych przez NHEJ. W tym celu uzyskaliśmy dwufunkcyjne konstrukty TALEN, które umożliwiają zarówno ekspresję w komórkach ssaków po transfekcji w postaci plazmidów, jak i syntezę in vitro mRNA TALEN do mikroiniekcji do zarodków myszy. Konstrukty te składają się ze skróconego szkieletu TALE23 połączonego z heterodimerycznymi domenami FokI24,25 w celu optymalnej edycji genomu w komórkach ssaków. Protokół ten może być również przyjęty do mikroiniekcji innych zaprojektowanych nukleaz lub do skojarzonych iniekcji zaprojektowanych nukleaz i konstruktów dawcy (konstrukcja dawców DNA została opisana w doskonałych publikacjach technicznych przez Wefersa i wsp.26,27).

Oświadczenie etyczne

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Kantonalnego Biura Weterynaryjnego Kantonu Zurych.

Protokół

1. Identyfikacja miejsc docelowych TALEN

  1. Odwiedź stronę TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (http://tale-nt.cac.cornell.edu) i wybierz "TALEN Targeter".
  2. Wprowadź sekwencję docelowego genu. Jeśli używane są konstrukcje wyrażeń pCAG-T7-TALEN (Rysunek 1C), wybierz "Miller et al., 2011" w sekcji "Użyj architektury predefiniowanej", aby przewidzieć miejsca docelowe, które mogą być celem z optymalną długością dystansu (15-20 bp) i liczbą RVD TALE (15-20) dla tej architektury TALEN.
  3. Wybierz "NN" w sekcji "G Substitute" (dostępne są również NH RVD specyficzne dla guanozyny, ale nie zostały jeszcze dokładnie przetestowane pod kątem montażu TALEN).
  4. Opcjonalnie: aby uzyskać informacje o innych ustawieniach i opcjach, postępuj zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej i podanymi tam linkami.
  5. Generowany jest plik tekstowy z potencjalnymi lokalizacjami docelowymi, który można zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu wygodniejszego przeglądania. Wybierz parę TALEN dla zestawu Golden Gate.
  6. Opcjonalnie: Sekwencjonowanie regionu genomowego będącego przedmiotem zainteresowania w szczepie myszy, który zostanie wykorzystany do mikroiniekcji, w celu wykrycia możliwych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), które mogą nie być uwzględnione w publicznych bazach danych i mogą potencjalnie zapobiec wiązaniu nukleazy.
  7. Opcjonalnie: Zapoznaj się z Tabelą 3, aby uzyskać dodatkowe zasoby online związane z nukleazami projektanta.
  8. Większość plazmidów wymaganych do budowy ZFN i TALEN można uzyskać z Addgene:
    http://www.addgene.org/special-collections/
    Identyfikatory Addgene dla zestawu Golden Gate TALEN i konstrukcji ekspresji TALEN u ssaków podano w tabeli 2.
    Alternatywnie, poszczególne moduły funkcjonalne, takie jak domeny palca cynkowego, można zamówić u dostawcy usług syntezy genów.

2. Montaż TALEN Golden Gate

Ta sekcja opisuje montaż TALEN-ów za pomocą protokołu opublikowanego przez Cermak et al.13 Pełnowymiarowe TALEN-y są konstruowane przy użyciu dwóch kolejnych etapów klonowania Golden Gate (rysunek 1). Takie podejście pozwala na włączenie dowolnej liczby RVD z zakresu od 12 do 31 do końcowych konstrukcji wyrażeń. Protokół składania został dostosowany do wektorów docelowych przeznaczonych do generowania mRNA (Figura 1C), które wyrażają wysoce aktywne TALEN-y po mikroiniekcji oocytów. Proszę również zapoznać się z protokołem online zestawu Golden Gate TALEN do tworzenia i utrzymywania biblioteki plazmidów (http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/).

  1. Dzień 1 - Reakcja Golden Gate #1 - Montaż tablic RVD w wektory pFUS
    1. Opcjonalnie: Dla każdej pary TALEN zaprojektowanej w Protokole 1 wprowadź sekwencję DNA dwóch miejsc docelowych (w tym początkowego T, od 5' do 3') do arkusza kalkulacyjnego TALEN_Voytas_Pipetting, aby wygenerować schemat pipetowania dla każdej reakcji Golden Gate (wprowadź również stężenia wszystkich plazmidów używanych w zestawach). Arkusz kalkulacyjny zawiera również oczekiwaną sekwencję DNA wszystkich RVD, które można wykorzystać do wyrównania wyników sekwencjonowania w sekcji 2.5.2.
    2. Dla każdego unikalnego numeru TALEN zaprojektowanego w Protokole 1:
      Jeśli długość TALEN wynosi 12-21 (standardowa), wybierz powtórzone zmienne reszty di-reszty (RVD) 1-10 i wektor docelowy pFUS_A. Wybierz pozostałe RVD i pFUS_B wektor docelowy, np. dla TALEN z 15 RVD (w tym ostatnie powtórzenie, które zostanie dodane do końcowego montażu w sekcji 2.3.3), wybierz RVD 11-14 i wektor docelowy pFUS_B4 (Rysunek 1A).
      Jeśli długość TALEN wynosi 22-31, użyj RVD 1-10 i wektora docelowego pFUS_A30A. Wybierz RVD 11-20 i wektor docelowy pFUS_A30B. Wybierz pozostałe RVD i wektor pFUS_Bdestination, np. dla TALEN z 24 RVD wybierz RVD 21-23 i wektor docelowy pFUS_B3.
    3. Ustaw reakcję Golden Gate #1 osobno dla każdej kombinacji pFUS + RVD, tj. 1-10 + pFUS_A i pozostałych RVD + odpowiedni wektor pFUS_B lub dla TALEN dłuższego niż 21 RVD, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B i pozostałych RVD + odpowiedni wektor pFUS_B. Użyj 150 ng każdego wektora RVD, 150 ng wektora pFUS, 1 μl BsaI, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i H2O do 20 μl całkowitej objętości reakcji. (Zaleca się stosowanie świeżych porcji buforu ligazy T4 dla każdej rundy zespołów Golden Gate, ponieważ wielokrotne rozmrażanie/zamrażanie buforu ligazy T4 może zmniejszyć wydajność reakcji.)
    4. Umieść reakcje Golden Gate w termocyklerze.
      Program:
      37 °C 5 min
      16 °C 10 min
      10 cykli
      50 °C 5 min
      80 °C 5 min
    5. Dodać 1 μl 10 mM ATP i 1 μl nukleazy bezpiecznej dla plazmidu do każdej mieszanki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zabieg ten usunie liniowe, niekompletne produkty ligacji, które można sklonować do wektorów docelowych przez rekombinację homologiczną in vivo w przekształconych bakteriach.
    6. Transformacja E. coli z indywidualnymi reakcjami ligacji (elektrokompetentne lub chemicznie kompetentne E. coli, które ułatwiają α-komplementację, takie jak XL1-Blue lub DH5α, mogą być stosowane tutaj i w kolejnych transformacjach).
    7. Płytki bakterii na płytkach spektynomycyny (50 μg/ml) z X-Gal i IPTG (40 μg/ml każda) w celu selekcji niebiesko-białej kolonii.
  2. Dzień 2 - Potwierdzenie prawidłowego montażu pFUS-RVD
    1. Stosując PCR kolonii ze starterami pCR8_F1 i pCR8_R1 (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów) przesiewaj 1-3 białe kolonie z każdej płytki. Prawidłowe zespoły pFUS-RVD zazwyczaj pokazują pasmo odpowiadające łącznej długości wszystkich sklonowanych RVD (np. około 1,1 kb dla 10 RVD) oraz "drabinę" mniejszych, mniej widocznych pasm (Rysunek 1B).
      Program PCR:
      95 °C 3 min
      95 °C 30 sek
      55 °C 30 sek
      72 °C 1 min 45 sek
      30-35 cykli < BR / > 72 °C 10 min
    2. Użyj potwierdzonych klonów, aby rozpocząć hodowlę przez noc (2-5 ml LB z 50 μg/ml spektynomycyny).
  3. Dzień 3 - Reakcja Golden Gate #2 - Tablice RVD do wektorów wyrażeń TALEN
    1. Wykonaj "miniprzygotowania", aby wyizolować zespoły pFUS-RVD (w zależności od liczby RVD pFUS_A i pFUS_B lub pFUS_A30A, pFUS_A30B i pFUS_B).
    2. Opcjonalnie: Sekwencjonowanie poszczególnych wektorów pFUS za pomocą starterów pCR8_F1, pCR8_R1 (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów). Sekwencjonowanie można również przeprowadzić na końcowych konstrukcjach TALEN (sekcja 2.5.2); jednak w przypadku dłuższych TALEN-ów pełne odczyty wszystkich RVD mogą nie być możliwe przy użyciu sekwencjonowania Sangera.
    3. Ustaw reakcję Golden Gate #2 dla każdego pojedynczego TALEN. 150 ng każdego wektora pFUS, 150 ng dla każdego wektora pFUS, 150 ng dla pLR-HD, pLR-NG, pLR-NI, pLR-NN (ostatnie "półpowtórzenie") zgodnie z projektem sekwencji RVD, a dla left TALEN użyj 75 ng z pCAG-T7-TALEN-ELD-Destination, a dla prawego TALEN użyj 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-Destination (lub odwrotnie). Dodać 1 μl Esp3I, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4, H2O do 20 μl całkowitej objętości reakcyjnej.
    4. Umieść reakcje Golden Gate w termocyklerze.
      Program:
      37 °C 5 min
      16 °C 10 min
      10 cykli
      37 °C 15 min
      80 °C 5 min
    5. Zastosować reakcje z sekcji 2.3.4 w celu przekształcenia E. coli.
  4. Dzień 4 - Potwierdzenie prawidłowego montażu TALEN
    1. Przesiać 1-3 białe kolonie z każdej płytki metodą PCR kolonii ze starterami TAL_F1 i TAL_R2 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów). Prawidłowo zmontowane TALEN-y pokazują produkt PCR o długości odpowiadającej całkowitej liczbie wbudowanych RVD (Rysunek 1D, to pasmo jest czasami trudne do wykrycia, podczas gdy "efekt drabiny" stanowi solidny wskaźnik udanego montażu).
      Program PCR:
      95 °C 3 min
      95 °C 30 sek
      55 °C 30 sek
      72 °C 3 min
      30-35 cykli < BR / > 72 °C 10 min
    2. Użyj potwierdzonych prawidłowych klonów, aby rozpocząć nocne hodowle bakterii (2-5 ml LB ze 100 μg/ml ampicyliny).
  5. Dzień 5 - Potwierdzenie prawidłowego montażu TALEN
    1. Wykonaj "miniprzygotowania" w celu wyizolowania plazmidów pCAG-T7-TALEN.
    2. Jeżeli sekwencjonowanie nie zostało przeprowadzone w sekcji 2.3.2, należy użyć starterów TAL_Seq_5-1 i TAL_R2 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów) w celu określenia prawidłowego montażu RVD w TALEN-ie o pełnej długości.

3. Synteza mRNA nukleazy

  1. Generowanie matrycy DNA
    1. Przygotuj wysokiej jakości midi lub maxipreps plazmidów pCAG-T7-TALEN do syntezy mRNA.
    2. Linearyzować 10 μg plazmidu syntezy mRNA TALEN lub ZFN przy użyciu enzymu restrykcyjnego, który preferencyjnie rozszczepia się poniżej i w bliskiej odległości od kodonu STOP nukleazy (w przypadku wektorów pCAG-T7-TALEN należy użyć SacI). Plazmidy do syntezy mRNA zazwyczaj zawierają promotor faga T7 lub SP6 przed sekwencją kodującą nukleazę.
    3. Uruchom 200-500 ng strawionego plazmidu na 0,7-1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy jest całkowicie strawiony.
    4. Usuń sole z trawienia plazmidu, wytrącając DNA za pomocą 0,1 objętości octanu sodu i 3 objętości etanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Osadzać DNA przez odwirowanie przy 14 000 x g lub więcej przez 10 minut, przemyć osad 200 μl 70% etanolu, wirować przez kolejne 5 minut, usunąć etanol, wysuszyć osad na powietrzu i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości wody wolnej od RNAzy. Oczyszczanie zlinearyzowanego plazmidu jest również możliwe za pomocą systemu opartego na kolumnach, np. QIAquick PCR Purification Kit.
    5. Określić stężenie matrycy liniowej i użyć 1 μg do ustawienia transkrypcji in vitro.
  2. Synteza mRNA i poliadenylacja
    1. Do transkrypcji in vitro plazmidów pCAG-T7-TALEN należy użyć zestawu mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Ustaw reakcję transkrypcji dla każdego TALEN-a na lodzie: do 20 μl z wodą wolną od nukleaz, 10 μl T7 2x NTP/ARCA, 2 μl 10x bufor reakcyjny T7, 1 μg matrycy DNA, 2 μl mieszanki enzymów T7. Wymieszać reakcję i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Użyj kompletnej mieszaniny 20 μl reakcji transkrypcyjnej, aby przygotować reakcję poliadenylacji na lodzie: 36 μl wody wolnej od nukleaz, 20 μl 5x bufor EPAP, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μl 10 mM ATP. Wymieszać i usunąć 2,5 μl mieszaniny reakcyjnej jako próbki kontrolne L1 i R1 (odpowiednio dla lewej i prawej nukleazy). Dodać 4 μl enzymu E-PAP i inkubować reakcję przez 45-60 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć kolejne 2,5 μl mieszaniny reakcyjnej jako próbki kontrolne L2 i R2.
  3. Oczyszczanie mRNA
    1. Użyj kolumn wirujących NucAway do oczyszczania mRNA (wymiana buforu i usuwanie niewbudowanych nukleotydów). Postukaj w kolumny, aby osadzić suchy żel na dnie kolumny. Kolumnę hydratu z 650 μl buforu do mikroiniekcji bez RNAz (1 mM Tris-Cl, 0,1 EDTA, pH 7,5). Zakryj, wiruj, wystukaj pęcherzyki powietrza i nawilżaj przez 5-15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej i wirować w temperaturze 750 x g, 4 °C przez 2 minuty w celu usunięcia nadmiaru płynu śródmiąższowego. Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce elucyjnej o pojemności 1,5 ml.
    3. Nanieść pełną mieszaninę reakcyjną z sekcji 3.2.2 na kolumnę i wirować w temperaturze 750 x g, 4 °C przez 2 minuty. MRNA nukleazy zostanie teraz rozpuszczone w buforze do mikroiniekcji. Usunąć 2,5 μl oczyszczonych próbek L3 i R3.
    4. Przechowywać mRNA w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania podwielokrotności do mikroiniekcji.
  4. Elektroforeza w żelu mRNA
    1. Wyczyść komorę żelową, aby usunąć zanieczyszczenia RNAzą za pomocą 10% roztworu SDS lub RNaseZAP.
    2. Przygotuj 1% żel agarozowy w buforze do biegania 1xTBE.
    3. Wymieszać każdą próbkę RNA L1/R1, L2/R2, L3/R3 z 3 objętościami barwnika NorthernMax Formaldehyde Load Dye i inkubować przez 15 minut w temperaturze 65 °C.
    4. Załaduj próbki i drabinkę wielkości RNA (np. znacznik wielkości RNA Millennium) na żel i uruchom żel przy 10 V/cm w 1x TBE, aż ładowanie barwnika dotrze do końca żelu.
    5. Żel barwić zielonym roztworem SYBR (Invitrogen) przez 30-60 minut z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
    6. Zobrazuj żel i porównaj rozmiary L1/R1 z L2/R2 i L3/R3. Próbki L2 / R2 i L3 / R3 powinny wykazywać prążki o zwiększonym rozmiarze w stosunku do L1 / R1, co wskazuje na udaną poliadenylację w (Figura 2).
    7. Określ stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru.
    8. Przygotuj porcje mRNA do mikroiniekcji, mieszając mRNA lewego nukleazy i prawego nukleazy w stosunku 1:1. Zalecamy przygotowanie podwielokrotności o łącznym stężeniu 200 ng/μl (100 ng/μl każdej nukleazy) poprzez rozcieńczenie buforem do mikroiniekcji. Przechowywać podwielokrotności mRNA w temperaturze -80 °C.

4. Izolacja zarodków i mikroiniekcja

  1. Izolacja zarodków. Protokół ten jest z powodzeniem stosowany w przypadku szczepów C57BL/6J i BDF1 i najprawdopodobniej może być dostosowany do innych szczepów powszechnie stosowanych w eksperymentach z mikroiniekcjami, takich jak FVB lub CBF1. Myszy są trzymane w cyklu 12-godzinnym jasno-ciemnym trwającym od 12 godzin do 12 godzin w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z jedzeniem i wodą ad libitum.
    1. Dawczynie superowulacji przeprowadza się w celu zwiększenia wydajności zarodków. 16 samic (w wieku 4 tygodni) ulega superowulacji przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG), a następnie wstrzyknięcie i.p. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) 5 IU 48 godzin później.
    2. Kryj 16 samic z superowulacją do 16 samców w wieku rozrodczym (2-8 miesięcy) natychmiast po wstrzyknięciu hCG.
    3. Składaj samice w ofierze za pomocą zatwierdzonego protokołu eutanazji, takiego jak wdychanie CO2 .
    4. Odzyskaj zapłodnione oocyty. Oocyty są pobierane z jajowodów następnego ranka, a następnie uwalniane z wszelkich pozostałych komórek wzgórka przez 3-5 minutowy zabieg w 0,1% hialuronidazie bydlęcej rozpuszczonej w pożywce M2. W zależności od wydajności krycia i użytego szczepu, wydajność zarodków może się różnić. 16 samic C57BL/6J produkuje zwykle 150-250 jaj, podczas gdy BDF1 daje odpowiednio 300-400 zapłodnionych oocytów.
  2. Mikroiniekcja zarodka
    1. Wstrzyknij mRNA nukleazy. Oocyty w stadium przedjądrzastym są zwykle wstrzykiwane wczesnym popołudniem. Mikroiniekcja cytoplazmatycznego mRNA przeprowadzana jest w pożywce M2 pod olejem mineralnym przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw Nomarski DIC z obiektywem 20X oraz z mikromanipulatorami zarodkowymi i jednostką iniekcyjną. Zalecamy rozpoczęcie iniekcji mRNA TALEN w stężeniu 10 ng/μl (łącznie 20 ng/μl).
    2. Odessać oocyt z kapilarą przytrzymującą i wstrzyknąć mRNA nukleazy do cytoplazmy zarodka, unikając kontaktu z przedjądrzami. Wstrzyknięcie powinno być płytkie, blisko błony plazmatycznej. Objętość wstrzyknięcia powinna być utrzymywana na małym poziomie, a igłę do mikroiniekcji należy wyjąć przy pierwszych objawach rozdęcia cytoplazmatycznego. Seria mikroiniekcji zwykle składa się ze 100-300 oocytów. Zazwyczaj co najmniej 80-90% zarodków powinno przeżyć wstrzyknięcie bez natychmiastowej lizy.
    3. Po mikroiniekcji umieścić zarodki na 1 godzinę w pożywce M16 (Sigma) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i przenieść zarodki, które przeżyły, do matek zastępczych w ciąży rzekomej.

5. Chirurgiczny transfer zarodków

  1. Przygotować biorczynie zarodków w ciąży rzekomej (matki zastępcze) na dzień przed mikroiniekcją mRNA. Dojrzałe samice (w wieku 3-6 miesięcy) wytrzymałego szczepu niekrewniaczego, takiego jak CD-1, dobrze nadają się do tej roli. Wywołaj ciążę rzekomą poprzez krycie samic poprzedniego dnia z samcami poddanymi chirurgicznie lub genetycznie wazektomii28. Tylko samice o ciśnieniu 0,5 dpc z przezroczystym czopem kopulacyjnym są wykorzystywane jako biorcy zarodków. U niewykorzystanych samic ciąża rzekoma znika po około 3 tygodniach, co pozwala na ich wielokrotne stosowanie.
  2. Znieczulenie samic matki zastępczej o natężeniu 0,5 dpc poprzez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy, ksylazyny (odpowiednio 120 mg/kg i 16 mg/kg). Preparat ten gwarantuje, że czas tolerancji chirurgicznej ~30 min jest więcej niż wystarczający dla przewidywanego czasu operacji wynoszącego 5-10 min.
  3. Ułóż znieczulone zwierzę na brzuchu na ciepłej powierzchni i zdezynfekuj miejsce nacięcia odpowiednim środkiem dezynfekującym, takim jak 70% etanol lub mieszanina chlorheksydyny i alkoholu.
  4. Naciąć skórę na grzbiecie zwierzęcia i otworzyć jamę otrzewnej sterylnymi nożyczkami.
  5. Wizualizuj i uzewnętrzniaj róg macicy, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową przyczepioną do jajnika. Utrzymuj narządy wilgotne, używając ciepłego 0,9% roztworu NaCl. Należy pamiętać, że miejsce operacji może wymagać obciągnięcia sterylnym opatrunkiem lub ogolenia, aby zachować zgodność z lokalnymi wytycznymi weterynaryjnymi.
  6. Unieruchomij narządy rozrodcze, przycinając poduszeczkę tłuszczową jajnika za pomocą zacisku buldoga.
  7. Delikatnie chwyć jajowód tuż przed bańką za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i użyj igły podskórnej 30 G, aby utworzyć mały otwór w ścianie jajowodu.
  8. Wyjąć igłę i ponownie włożyć cienką szklaną kapilarnę zawierającą zarodki do otworu umożliwiającego umieszczenie zarodków w bańce, delikatnie w ustnik uchwytu kapilary. Po zdeponowaniu zarodków w bańce należy usunąć naczynia włosowate i umieścić narządy rozrodcze z powrotem w jamie ciała.
  9. Zamknij jamę otrzewnej serią sterylnych szwów (Prolene 6-0).
  10. Zamknij skórę za pomocą 1-2 klipsów do nawijania ran (Autoclip 9 mm) w zależności od wielkości otworu.
  11. Po operacji należy zwrócić zwierzęta do ich domowej klatki i nadzorować je, aż efekt znieczulenia ustąpi.
  12. Aby zminimalizować stres, w miarę możliwości trzymaj myszy w stabilnych grupach społecznych (2-4 zwierzęta/klatka typu III).
  13. Przez 3 dni po zabiegu należy stosować pooperacyjne leki przeciwbólowe w postaci Dafalganu dodawanego do wody pitnej (Paracetamol 200 mg/kg m.c.).

6. Analiza założycieli za pomocą PCR i endonukleazy T7 lub trawienia enzymem restrykcyjnym

  1. Zaprojektuj startery do amplifikacji obszaru między 200-700 pz wokół miejsca wiązania nukleazy. Odległości między regionem dystansowym starter-nukleaza do przodu i regionem dystansowym nukleazy i starterem odwrotnym powinny być wystarczająco różne, aby umożliwić wykrycie dwóch oddzielnych prążków dla trawionych produktów na żelu agarozowym (patrz rysunki 3 i 4 dla przykładów).
  2. Uruchom PCR w zoptymalizowanych warunkach. Sprawdź rozmiar amplikonu PCR na żelu agarozowym.
  3. Opcjonalnie: Oczyść produkty PCR, np. za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR w celu usunięcia soli i nukleotydów z mieszaniny PCR. Wiele enzymów restrykcyjnych jest aktywnych w próbkach PCR uzupełnionych odpowiednim buforem enzymu restrykcyjnego, a oczyszczanie nie jest konieczne. Z powodzeniem zastosowaliśmy również endonukleazę T7 w buforze QiagenTaq PCR uzupełnionym o NEBuffer 2.
    1. Test endonukleazy T7. Wymieszaj 17 μl produktu PCR z 2 μl NEBuffer 2 i uruchom program tworzenia heterodupleksu (Rysunek 3b) w termocyklerze:
      95 °C 2 min
      95 °C do 85 °C (-2 °C/s)
      85 °C do 25 °C (-0,1 °C/s)
      4 °C Hold.
      Dodać 1 μl endonukleazy T7 do każdej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. (Można tu również zastosować test geodezyjny (transgenomiczny), który opiera się na nukleazie CEL 1. Proszę zapoznać się z instrukcjami producenta.)
    2. Trawienie restrykcyjne produktu PCR. Zmieszać 17 μl produktu PCR z 2 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Trawić w odpowiedniej temperaturze przez 1 godzinę lub dłużej.
  5. Dodaj barwnik ładujący DNA do próbek i uruchom na 2% żelu agarozowym, aby wykryć wyraźne wzorce trawienia u zwierząt typu dzikiego i założycieli zawierających zmutowane allele. Na rysunkach 3 i 4 przedstawiono oczekiwane wyniki.
  6. Klonowanie produktów PCR założycieli z dodatnim wynikiem dla zmutowanych alleli do sekwencjonowania Sangera (np. poprzez klonowanie TA do pGEM-T Easylub bezpośrednie sekwencjonowanie mieszanin produktów PCR przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wyniki

Skonstruowaliśmy plazmidy docelowe kompatybilne z metodą assembly Golden GateTALEN opublikowaną przez Cermak et al.13 , które umożliwiają ekspresję TALEN w komórkach ssaków, a także syntezę mRNA in vitro z promotora faga T7 (Rysunek 1C). Plazmidy te zawierają heterodimeryczne domeny FokI (mutacje ELD lub KKR), o których wykazano, że redukują efekty poza celowe (off-target) w porównaniu do homodimerów FokI oraz zwiększają aktywność cięcia w porównaniu do heterodimerów FokI pierwszej generacji25,29. Reakcje assembly Golden gate nr 1 i nr 2 są zazwyczaj bardzo wydajne, a każda biała kolonia, po analizie za pomocą PCR kolonii, wykazuje oczekiwany wzór dla konkretnej liczby sklonowanych RVD (Rysunki 1B i 1D).

Analiza żelowa mRNA syntetyzowanego in vitro (Rycina 2) powinna wykazać pojedynczy, wyraźny prążek z niewielkim rozmyciem lub jego brakiem dla każdej analizowanej próbki. Między próbkami L1/R1 a L2/R2 i L3/R3 powinno wystąpić wyraźne przesunięcie wielkości, co wskazuje na pomyślną poliadenylację.

Zwierzęta założycielskie można przesiewać pod kątem alleli zmutowanych w wyniku NHEJ, wykorzystując PCR do genotypowania, a następnie trawienie endonukleazą T7 (Rycina 3) lub trawienie restrykcyjne z użyciem enzymu, który przecina sekwencję typu dzikiego w obrębie regionu łącznika (spacer) pary nukleaz (Rycina 4). Test z endonukleazą T7 jest możliwy do zastosowania przy każdym rodzaju mutacji, niezależnie od konkretnej sekwencji genomowej w regionie łącznika wstrzykniętej pary nukleaz; wykrywa on jednak wyłącznie niedopasowania między niciami DNA w heterodupleksowych produktach PCR. Zatem w rzadkim przypadku, gdy zwierzę założycielskie posiada dwa identycznie zmutowane allele, produkty PCR nie wykażą wzoru trawienia przez T7. Takie rozróżnienie jest jednak zawsze możliwe, gdy w regionie łącznika nukleaz znajduje się specyficzna sekwencja rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, która zostanie usunięta w wyniku insercji/delecji wywołanych przez NHEJ (Rycina 5). W tym przypadku prążki nietrawione wskazują na obecność mutacji, a brak jakichkolwiek produktów trawienia silnie sugeruje, że zwierzę założycielskie posiada mutacje w obu allelach genu docelowego (oznaczone gwiazdkami na Rycina 4b).

figure-results-1
Rysunek 1. Klonowanie Golden Gate RVD TALEN do heterodimerycznych wektorów pCAG-T7-Destination. A) Montaż macierzy RVD w wektorach pFUS. Tutaj pokazano przykład dla pary TALEN z poszczególnymi macierzami TALE składającymi się odpowiednio z 15 RVD i 17 RVD (dla macierzy TALE dłuższych niż 21 RVD wymagane są trzy montaże pFUS-RVD, nie pokazano). Strzałki wskazują primery do reakcji PCR kolonii specyficznych dla pFUS. B) Produkty PCR amplifikowane z prawidłowych montaży pFUS zazwyczaj wykazują prążek odpowiadający łącznej długości wszystkich sklonowanych RVD (np. około 1,1 kb dla 10 RVD) oraz „drabinę” mniejszych, mniej wyraźnych prążków ze względu na repetytywny charakter macierzy RVD. C) Końcowy montaż macierzy pFUS-RVD i plazmidu zawierającego ostatnią powtórkę (pLR) do heterodimerycznych wektorów ekspresyjnych TALEN z wariantami FokIELD i FokIKKR, odpowiednio. Szkielet TALEN (oznaczony jako N i C) przypomina architekturę opublikowaną przez Millera et al.23 Promotor CAG (element wzmacniający wczesny CMV/ kurza beta-aktyna) zapewnia wysoki poziom ekspresji w transfekowanych komórkach ssaków, natomiast promotor faga T7 umożliwia syntezę mRNA in vitro (do linearyzacji wektora poniżej kodonu STOP nukleazy należy użyć SacI). D) PCR kolonii z użyciem primerów wskazanych strzałkami w C) pozwala na identyfikację prawidłowo zmontowanych TALEN. Pełnowymiarowe produkty PCR są często mniej wyraźne, podczas gdy „efekt drabiny” stanowi wiarygodny wskaźnik udanego montażu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

figure-results-2
Rysunek 2. Kontrola jakości syntezy mRNA nukleazy in vitro z wykorzystaniem elektroforezy w żelu agarozowym. Jako przykład przedstawiono mRNA ZFN (L, lewy ZFN; R, prawy ZFN). Próbki L1/R1 przedstawiają mRNA przed poliadenylacją, próbki L2/R2 przedstawiają mRNA poliadenylowane, a próbki L3/R3 przedstawiają oczyszczone mRNA poliadenylowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-3
Rysunek 3. Przykład testu z endonukleazą T7 stosowanego do identyfikacji zwierząt założycieli niosących mutacje w locus docelowym wywołane przez nukleazę. A) Zaprojektowano parę TALEN do cięcia w obrębie regionu kodującego gen białka prionowego myszy (Prnp, sekwencja docelowa TALEN dostępna na życzenie). Produkt PCR generowany jest przy użyciu startera forward (F) znajdującego się 110 bp powyżej oraz startera reverse (R) 250 bp poniżej miejsca cięcia TALEN. B) Produkt PCR jest następnie poddawany tworzeniu heterodupleksów i trawieniu endonukleazą T7. C) Mutageneza indukowana przez TALEN w docelowym regionie genomowym u pojedynczych założycieli objawia się obecnością pełnowymiarowego produktu PCR wraz z produktami trawienia o długości 250 i 110 bps. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-4
Rysunek 4. Przykład trawienia restrykcyjnego produktów PCR wykorzystanego do identyfikacji zwierząt założycieli niosących mutacje w locus docelowym wywołane przez nukleazę. ZFN specyficzne dla locus Rosa26 myszy29 celują w miejsce restrykcyjne XbaI w obrębie intronu 1. A) Zwierzęta założyciele były przesiewane za pomocą PCR genotypującego z użyciem primera forward (F) zlokalizowanego 500 bp powyżej oraz primera reverse (R) 250 bp poniżej miejsca cięcia. B) Trawienie produktów PCR enzymem XbaI ujawnia wzory trawienia wskazujące na myszy z mutacjami biallelicznymi (oznaczone gwiazdkami), mutacjami monoallelicznymi (prążki trawione i nietrawione, np. zwierzę 2) oraz myszy typu dzikiego (całkowite trawienie, np. zwierzę 21). C) Sekwencjonowanie myszy z potencjalnymi modyfikacjami biallelicznymi wykazuje do 3 (zwierzę 24) różnych insercji/delecji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Nazwa starteraSekwencja 5’ do 3’
pCR8_F1ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1catcgcgcaatgcactgac

Tabela 1. Sekwencje starterów użytych do koloniowej reakcji PCR oraz sekwencjonowania w protokole montażu Golden Gate TALEN.

Plazmid/KolekcjaWspółtwórcaIdentyfikator AddgeneKomentarze
Zestaw Golden Gate TALEN i TAL Effector Kit 2.0Laboratorium Voytasa1000000024Zawiera wszystkie plazmidy niezbędne do montażu TALEN metodą Golden Gate
wektory docelowe pCAG-T7-TALEN -KKR/ELDLaboratorium Pelczara40131, 40132Plazmidy pomocnicze do ekspresji TALEN w komórkach ssaków i in vitro synteza mRNA

Tabela 2. Plazmidy i kolekcje plazmidów wymagane do montażu Golden Gate TALEN można pozyskać z Addgene (www.addgene.org).

Zasób internetowyKomentarze
http://tale-nt.cac.cornell.eduProjektowanie TALEN; przewidywanie efektów off-target dla TALEN
http://zifit.partners.org/ZiFiT/Projektowanie TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9
http://www.genome-engineering.orgProjektowanie TALEN, CRISPR/Cas9; przewidywanie efektów off-target dla CRISPR/Cas9
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.htmlSkładanie sekwencji TALEN w celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.htmlProjektowanie modułowego składania ZFN
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab/segallabsoftwareProjektowanie modułowego składania ZFN

Tabela 3. Zasoby online do projektowania ZFN, TALEN i CRISPR/Cas9.

Dyskusja

Zaprojektowane podejścia do edycji genomu oparte na nukleazach znacznie rozszerzyły zakres gatunków podatnych na ukierunkowane modyfikacje ich odpowiednich genomów10,12. U myszy celowanie genowe w komórkach ES jest standardową techniką od ponad dwóch dekad; jednak okazało się, że trudno jest przystosować się do komórek ES od gatunków innych niż mysz, chociaż ostatnio odniesiono pewne sukcesy w komórkach ES szczurów. Nawet przy dostępności "gotowych" klonów mysich komórek ES ukierunkowanych na geny, dostarczanych przez konsorcja takie jak EUCOMM, KOMP lub NorCOMM3 , edycja genomu przez ZFN i TALEN zapewnia większą precyzję i elastyczność w zakresie spektrum modyfikacji, które można wprowadzić do genomu myszy. Zwierzęta założycielskie noszące mutacje zależne od nukleazy wydają się być wysoce kompetentne w linii zarodkowej4-6,20,21, co nie zawsze ma miejsce w przypadku chimer pochodzących z wstrzyknięć komórek ES w blastocysty. W związku z tym w niektórych przypadkach mikroiniekcja zaprojektowanych nukleaz może skutkować znacznie szybszym generowaniem nowych linii myszy z ukierunkowanymi modyfikacjami genomu.

Pomyślne wygenerowanie myszy z nokautem przez wstrzyknięcie ZFN i TALEN zależy w dużym stopniu od aktywności wstrzykniętej pary nukleaz. Wykazano, że TALEN-y mają wysoki wskaźnik sukcesu w celowaniu w szeroki zakres genów w wielu organizmach; jednak ostatnie badania sugerują, że wiązanie TALEN jest wrażliwe na metylację cytozyny30,31. W ten sposób nowo wygenerowane pary nukleaz, na przykład TALEN-y sklonowane do wektorów pCAG-T7, mogą być przejściowo transfekowane do linii komórkowej myszy, takiej jak NIH-3T3 lub Neuro-2a, które do pewnego stopnia naśladują stan chromatyny zarodka myszy. W tym przypadku aktywność nukleazy można oszacować za pomocą testu endonukleazy T7 lub trawienia restrykcyjnego produktu PCR, jak opisano w sekcji 5 przed syntezą mRNA i mikroiniekcją. Zalecamy sekwencjonowanie interesującego regionu genomu w odpowiedniej linii komórkowej i szczepie myszy używanym do eksperymentów mikroiniekcyjnych.

W mysich zygotach różne pary TALEN lub ZFN będą działać optymalnie przy różnych stężeniach mRNA, a zatem może być konieczne eksperymentalne określenie optymalnego stężenia roboczego mRNA mikroiniekowanej nukleazy. W zależności od pary nukleaz, zbyt niskie stężenie spowoduje brak rozszczepienia, podczas gdy zbyt wysokie może spowodować śmiertelność zarodka. W zależności od pary nukleaz odnieśliśmy sukces stosując całkowite stężenia mRNA tak niskie, jak 2 ng/μl i tak wysokie, jak 200 μg/ul. Efekty te są trudne do przewidzenia na podstawie doświadczeń w hodowli komórkowej, a stężenie nukleazy optymalne zarówno dla przeżycia zarodka, jak i tempa modyfikacji locus docelowego musi zostać określone empirycznie.

Wysoce aktywny ZFN lub TALEN może rozszczepić swoją sekwencję docelową poza stadium jednokomórkowe zarodka, któremu wstrzyknięto mikrowstrzyknięcie, a tym samym powodować złożone wzorce mutagenezy i mozaikowości u założycieli. My i inni4 zaobserwowaliśmy trzy lub więcej odrębnych zmutowanych alleli u jednego założyciela (Figura 5C). Tak więc, przy tworzeniu nowej linii myszy od tych założycieli, potomstwo powinno być dokładnie przebadane przez sekwencjonowanie pod kątem obecności korzystnej mutacji, ponieważ testy trawienia dostarczają dowodów tylko na obecność nieokreślonej mutacji.

Jednym z często wysuwanych zarzutów wobec systemów ZFN i TALEN jest możliwość, że nukleazy te są również zdolne do rozszczepiania sekwencji obecnych w innym miejscu genomu, które są podobne do miejsc docelowych. Takie efekty off-target zaobserwowano w przypadku odczynników wczesnej generacji wykorzystujących homodimeryczną domenę FokI, a konstrukty heterodimerów zaprojektowano w celu złagodzenia efektów off-target25. Potencjalne miejsca poza celem można do pewnego stopnia przewidzieć in silico32,33 i poddać je badaniom przesiewowym za pomocą PCR i sekwencjonowania. Oczywistą zaletą stosowania ZFN i TALEN-ów do generowania myszy, a nie linii komórkowych, jest możliwość usunięcia docelowych mutacji niezwiązanych z pożądaną modyfikacją genomu poprzez wykonanie kilku krzyżówek wstecznych z wybranym szczepem typu dzikiego. W przypadku analizy dużej liczby myszy założycieli, głębokie sekwencjonowanie nowej generacji produktów PCR wygenerowanych z locus ukierunkowanego na nukleazę i loci przewidywanych in silico poza celem może stanowić alternatywny odczyt jakościowy i ilościowy dla testów trawienia produktów PCR.

Techniki wspomaganego rozrodu opisane w tym protokole są zoptymalizowane dla standardowych szczepów myszy używanych do eksperymentów mikroiniekcyjnych, takich jak C57Bl/6J lub B6D2F1. Myszy różnego pochodzenia, takie jak szczepy niekrewniacze, mogą być w zasadzie wykorzystywane do metod edycji genomu i mogą stanowić bardziej odpowiednie tło genetyczne dla konkretnych pytań badawczych. Skuteczność technik wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, można przewidzieć dla wielu szczepów34-36 , ale może wymagać dalszej optymalizacji w przypadku szczepów niestandardowych w celu uzyskania wystarczającej liczby zarodków do mikroiniekcji nukleazy.

Oprócz ZFN i TALEN, wprowadzono nowe nukleazy projektowe, takie jak sterowany RNA system CRISPR/Cas99,37,38 do zastosowań w edycji genomu. Wszystkie opisane tutaj metody mikroiniekcji i analizy zwierząt założycielskich mają również zastosowanie do CRISPR/Cas9 i przyszłych trybów edycji genomu.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Monice Tarnowskiej, Kornelii Albrecht i Ewie Skoczylas za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to zostało sfinansowane z grantu SNF Sinergia CRSI33-125073 dla PP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BsaINEBR0535S lub L
Esp3IThermo ScientificER0451
T4 LigazaNEBM0202S lub L
SpectinomycinSigmaS0692-1ML
Ampicylina SigmaA0166
X-GalSigmaB4252
IPTGSigmaI6758
Epicentrum nukleazy bezpieczne dla plazmiduE3101K
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
QIAGEN Zestaw Midi PlasmidQiagen12143
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra KitInvitrogenAM1345
NucAway Spin ColumnsInvitrogenAM10070
RNaseZAPSigmaR2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load DyeInvitrogenAM8552
RNA Markery MillenniumInvitrogenAM7150
10x TBE bufor:Thermo ScientificB52
T7 endonukleazaNEBM0302S lub L
pGEM-T EasyVector System IPromegaA3600
SYBR Green I Soap Acid Gel StainInvitrogenS-7563
klacz ciężarna' s gonadotropina surowicy (PMSG)SigmaG4877
ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)SigmaCG5
M2 pożywka do hodowli zarodkówSigmaM7167
M16 pożywka do hodowli zarodkówSigmaM7292
Olej mineralny, testowany na zarodkachSigmaM8410
KetaminaCentraVetKet 201
XylazineSigma Aldrich46995
Equipment/Tools
Mikroskop odwrócony z optyką Nomarski DIC (na przykład Nikon Eclipse TE200)Mikromanipulatory firmy Nikon
(na przykład Narishige, NT88NF)Narishige
Naczynia włosowate do przechowywania zarodkówSutter InstrumentsB100-75-10
Naczynie włosowate do iniekcji zarodkówNarishigeGD-1
Ściągacz do naczyń włosowatych (na przykład Sutter P97)Sutter Instruments
Microforge (na przykład Narishige MF-900)do skóry Narishige
WaltonFST14077-10
Nożyczki chirurgiczneFST14041-10
Sonda chirurgicznaFST10140-03
System odruchowych klipsów do ran (9 mm)FST12031-09
Odruchowe klipsy do ran (9 mm)FST12032-09
Kleszcze precyzyjne Dumont 5FST11254-20
Kleszcze zakrzywione MoriaFST11370-31
Kleszcze precyzyjne MoriaFST11399-80
Zacisk Dietrich bulldogFST18038-45
C57BL/6J myszyJackson Labskod szczepu 000664
myszy CD-1kod szczepuCharles River
Nożyczki 000664

Bibliografia

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
  2. Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
  3. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  4. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  5. Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
  6. Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  10. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
  11. ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  12. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
  13. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
  14. Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
  15. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
  16. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
  17. Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
  18. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
  19. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  20. Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
  21. Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
  22. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  23. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
  24. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  25. Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
  26. Wefers, B., et al. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  27. Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. Current Protocols in Mouse Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  28. Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
  29. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
  30. Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
  31. Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
  32. Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
  33. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  34. Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
  35. Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
  36. Pease, S., Saunders, T. L. International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , Springer. (2011).
  37. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  38. Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mRNA TALENoocyty mysieedycja genomuprocedura mikroiniekcjizap odnione oocytyefektor TALmonta Golden Gatewtryskiwanie do pronukleusatransfer zarodk w
Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.