Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Summary

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Abstract

Transgeniczne myszy z specyficznymi dla danego miejsca modyfikacjami genomu (knockout, knock-in) mają kluczowe znaczenie dla analizowania złożonych systemów biologicznych, jak również dla modelowania chorób ludzkich i testowania strategii terapeutycznych. Niedawne postępy w stosowaniu zaprojektowanych nukleaz, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz system 9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 do inżynierii genomu specyficznego dla miejsca, otwierają możliwość przeprowadzenia szybkiej, ukierunkowanej modyfikacji genomu u praktycznie każdego gatunku laboratoryjnego bez konieczności polegania na technologii embrionalnych komórek macierzystych (ES). Eksperyment edycji genomu zazwyczaj rozpoczyna się od identyfikacji zaprojektowanych miejsc docelowych nukleazy w genie będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie konstrukcji niestandardowych domen wiążących DNA, aby skierować aktywność nukleazy do zdefiniowanego przez badacza locus genomu. Plazmidy nukleazy projektowanej są transkrybowane in vitro w celu wytworzenia mRNA do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający osiągnięcie ukierunkowanej modyfikacji genomu poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy.

Introduction

Myszy są zdecydowanie najpopularniejszą platformą do generowania transgenicznych modeli zwierząt. Wszechstronny zestaw narzędzi do inżynierii genetycznej zarodka^{myszy 1-3} został niedawno rozszerzony o podejścia do edycji genomu oparte na zaprojektowanych nukleazach, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN)^4-6, nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN)^7,8 oraz system zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9. ZFN i TALEN funkcjonują jako pary dwóch specjalnie zaprojektowanych domen wiążących DNA opartych na białkach (odpowiednio układy białek palca cynkowego i reszt o zmiennej powtarzalności (RVD), z których każda jest sprzężona z endonukleazą FokI^10-12. I odwrotnie, specyficzność rozszczepienia DNA za pośrednictwem Cas9 jest zapewniona przez transaktywację RNA CRISPR (crRNA i tracrRNA, które można również połączyć w pojedynczą chimeryczną cząsteczkę RNA zwaną przewodnikiem RNA)¹¹, które działają w kompleksie z białkiem CRISPR.

TALENy z określoną sekwencją RVD mogą być szybko konstruowane przez indywidualnych eksperymentatorów z wieloma strategiami montażu do wyboru od^{13 do 17}. CRISPR/Cas9 obiecuje jeszcze mniej pracochłonne generowanie nukleaz projektowanych, jednak specyficzność wiązania przewodnika RNA-DNA nadal nie została w pełni rozwiązana^18,19. Wytwarzanie niestandardowych ZFN było do tej pory ograniczone do wyspecjalizowanych laboratoriów akademickich i dostawców komercyjnych, takich jak Sangamo Biosciences i serwis Sigma CompoZr.

Ogólnie rzecz biorąc, edycja genomu za pomocą nukleaz projektanta ma na celu wprowadzenie pęknięć podwójnej nici (DSB) w określonych loci genomowych, które następnie przyciągają niehomologiczne mechanizmy naprawy DNA do łączenia końców (NHEJ) lub rekombinacji homologicznej (HR)^10,12. Naprawa DSB za pośrednictwem NHEJ często skutkuje wprowadzeniem wstawień i usunięć w bliskiej odległości od miejsca naprawy. W ten sposób naprawa NHEJ może być wykorzystana do wyeliminowania funkcji genu docelowego poprzez wprowadzenie mutacji z przesunięciem ramki odczytu w sekwencji genów kodujących białko^4,7,9. Alternatywnie, zdefiniowane dodawanie lub zastępowanie informacji genetycznej można osiągnąć poprzez dostarczenie dawcy DNA wraz z zaprojektowanymi nukleazami. Dawca DNA składa się z zaprojektowanych przez badaczy sekwencji DNA otoczonych regionami homologii z locus docelowym, służąc w ten sposób jako matryca do naprawy DSB przez HR. Zarówno plazmidy^5,6,20, jak i jednoniciowe oligonukleotydy^8,9,21 zostały z powodzeniem wykorzystane jako dawcy. Ani edycja genomu za pośrednictwem NHEJ, ani HR nie wymaga wprowadzenia selektywnego markera do genomu zarodka myszy, co sprawia, że strategie te szczególnie dobrze nadają się do tworzenia niewielkich zmian w sekwencji nukleotydów bez naruszania ogólnej architektury genetycznej.

W tym protokole opisujemy wszystkie niezbędne procedury edycji genomu w embrionie myszy za pomocą TALEN-ów. Obejmują one: 1) identyfikację miejsca docelowego TALEN²², 2) budowę TALEN-ów poprzez klonowanie Golden Gate¹³, 3) syntezę mRNA TALEN in vitro, 4) mikroiniekcję mRNA TALEN do zapłodnionych oocytów myszy, 5) zabiegi chirurgiczne transferu zarodków oraz 6) analizę mutagenezy indukowanej przez TALEN u zwierząt założycielskich. Koncentrujemy się na mikroiniekcji mRNA TALEN i badaniach przesiewowych założycieli pod kątem insercji/delecji wywołanych przez NHEJ. W tym celu uzyskaliśmy dwufunkcyjne konstrukty TALEN, które umożliwiają zarówno ekspresję w komórkach ssaków po transfekcji w postaci plazmidów, jak i syntezę in vitro mRNA TALEN do mikroiniekcji do zarodków myszy. Konstrukty te składają się ze skróconego szkieletu TALE²³ połączonego z heterodimerycznymi domenami FokI^24,25 w celu optymalnej edycji genomu w komórkach ssaków. Protokół ten może być również przyjęty do mikroiniekcji innych zaprojektowanych nukleaz lub do skojarzonych iniekcji zaprojektowanych nukleaz i konstruktów dawcy (konstrukcja dawców DNA została opisana w doskonałych publikacjach technicznych przez Wefersa i wsp.^26,27).

Oświadczenie etyczne

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Kantonalnego Biura Weterynaryjnego Kantonu Zurych.

Protocol

1. Identyfikacja miejsc docelowych TALEN

1. Odwiedź stronę TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (http://tale-nt.cac.cornell.edu) i wybierz "TALEN Targeter".
2. Wprowadź sekwencję docelowego genu. Jeśli używane są konstrukcje wyrażeń pCAG-T7-TALEN (Rysunek 1C), wybierz "Miller et al., 2011" w sekcji "Użyj architektury predefiniowanej", aby przewidzieć miejsca docelowe, które mogą być celem z optymalną długością dystansu (15-20 bp) i liczbą RVD TALE (15-20) dla tej architektury TALEN.
3. Wybierz "NN" w sekcji "G Substitute" (dostępne są również NH RVD specyficzne dla guanozyny, ale nie zostały jeszcze dokładnie przetestowane pod kątem montażu TALEN).
4. Opcjonalnie: aby uzyskać informacje o innych ustawieniach i opcjach, postępuj zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej i podanymi tam linkami.
5. Generowany jest plik tekstowy z potencjalnymi lokalizacjami docelowymi, który można zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu wygodniejszego przeglądania. Wybierz parę TALEN dla zestawu Golden Gate.
6. Opcjonalnie: Sekwencjonowanie regionu genomowego będącego przedmiotem zainteresowania w szczepie myszy, który zostanie wykorzystany do mikroiniekcji, w celu wykrycia możliwych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), które mogą nie być uwzględnione w publicznych bazach danych i mogą potencjalnie zapobiec wiązaniu nukleazy.
7. Opcjonalnie: Zapoznaj się z Tabelą 3, aby uzyskać dodatkowe zasoby online związane z nukleazami projektanta.
8. Większość plazmidów wymaganych do budowy ZFN i TALEN można uzyskać z Addgene:
   http://www.addgene.org/special-collections/
   Identyfikatory Addgene dla zestawu Golden Gate TALEN i konstrukcji ekspresji TALEN u ssaków podano w tabeli 2.
   Alternatywnie, poszczególne moduły funkcjonalne, takie jak domeny palca cynkowego, można zamówić u dostawcy usług syntezy genów.

2. Montaż TALEN Golden Gate

Ta sekcja opisuje montaż TALEN-ów za pomocą protokołu opublikowanego przez Cermak et al.¹³ Pełnowymiarowe TALEN-y są konstruowane przy użyciu dwóch kolejnych etapów klonowania Golden Gate (rysunek 1). Takie podejście pozwala na włączenie dowolnej liczby RVD z zakresu od 12 do 31 do końcowych konstrukcji wyrażeń. Protokół składania został dostosowany do wektorów docelowych przeznaczonych do generowania mRNA (Figura 1C), które wyrażają wysoce aktywne TALEN-y po mikroiniekcji oocytów. Proszę również zapoznać się z protokołem online zestawu Golden Gate TALEN do tworzenia i utrzymywania biblioteki plazmidów (http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/).

1. Dzień 1 - Reakcja Golden Gate #1 - Montaż tablic RVD w wektory pFUS
   1. Opcjonalnie: Dla każdej pary TALEN zaprojektowanej w Protokole 1 wprowadź sekwencję DNA dwóch miejsc docelowych (w tym początkowego T, od 5' do 3') do arkusza kalkulacyjnego TALEN_Voytas_Pipetting, aby wygenerować schemat pipetowania dla każdej reakcji Golden Gate (wprowadź również stężenia wszystkich plazmidów używanych w zestawach). Arkusz kalkulacyjny zawiera również oczekiwaną sekwencję DNA wszystkich RVD, które można wykorzystać do wyrównania wyników sekwencjonowania w sekcji 2.5.2.
   2. Dla każdego unikalnego numeru TALEN zaprojektowanego w Protokole 1:
      Jeśli długość TALEN wynosi 12-21 (standardowa), wybierz powtórzone zmienne reszty di-reszty (RVD) 1-10 i wektor docelowy pFUS_A. Wybierz pozostałe RVD i pFUS_B wektor docelowy, np. dla TALEN z 15 RVD (w tym ostatnie powtórzenie, które zostanie dodane do końcowego montażu w sekcji 2.3.3), wybierz RVD 11-14 i wektor docelowy pFUS_B4 (Rysunek 1A).
      Jeśli długość TALEN wynosi 22-31, użyj RVD 1-10 i wektora docelowego pFUS_A30A. Wybierz RVD 11-20 i wektor docelowy pFUS_A30B. Wybierz pozostałe RVD i wektor pFUS_Bdestination, np. dla TALEN z 24 RVD wybierz RVD 21-23 i wektor docelowy pFUS_B3.
   3. Ustaw reakcję Golden Gate #1 osobno dla każdej kombinacji pFUS + RVD, tj. 1-10 + pFUS_A i pozostałych RVD + odpowiedni wektor pFUS_B lub dla TALEN dłuższego niż 21 RVD, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B i pozostałych RVD + odpowiedni wektor pFUS_B. Użyj 150 ng każdego wektora RVD, 150 ng wektora pFUS, 1 μl BsaI, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i H₂O do 20 μl całkowitej objętości reakcji. (Zaleca się stosowanie świeżych porcji buforu ligazy T4 dla każdej rundy zespołów Golden Gate, ponieważ wielokrotne rozmrażanie/zamrażanie buforu ligazy T4 może zmniejszyć wydajność reakcji.)
   4. Umieść reakcje Golden Gate w termocyklerze.
      Program:
      37 °C 5 min
      16 °C 10 min
      10 cykli
      50 °C 5 min
      80 °C 5 min
   5. Dodać 1 μl 10 mM ATP i 1 μl nukleazy bezpiecznej dla plazmidu do każdej mieszanki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zabieg ten usunie liniowe, niekompletne produkty ligacji, które można sklonować do wektorów docelowych przez rekombinację homologiczną in vivo w przekształconych bakteriach.
   6. Transformacja E. coli z indywidualnymi reakcjami ligacji (elektrokompetentne lub chemicznie kompetentne E. coli, które ułatwiają α-komplementację, takie jak XL1-Blue lub DH5α, mogą być stosowane tutaj i w kolejnych transformacjach).
   7. Płytki bakterii na płytkach spektynomycyny (50 μg/ml) z X-Gal i IPTG (40 μg/ml każda) w celu selekcji niebiesko-białej kolonii.
2. Dzień 2 - Potwierdzenie prawidłowego montażu pFUS-RVD
   1. Stosując PCR kolonii ze starterami pCR8_F1 i pCR8_R1 (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów) przesiewaj 1-3 białe kolonie z każdej płytki. Prawidłowe zespoły pFUS-RVD zazwyczaj pokazują pasmo odpowiadające łącznej długości wszystkich sklonowanych RVD (np. około 1,1 kb dla 10 RVD) oraz "drabinę" mniejszych, mniej widocznych pasm (Rysunek 1B).
      Program PCR:
      95 °C 3 min
      95 °C 30 sek
      55 °C 30 sek
      72 °C 1 min 45 sek
      30-35 cykli < BR / > 72 °C 10 min
   2. Użyj potwierdzonych klonów, aby rozpocząć hodowlę przez noc (2-5 ml LB z 50 μg/ml spektynomycyny).
3. Dzień 3 - Reakcja Golden Gate #2 - Tablice RVD do wektorów wyrażeń TALEN
   1. Wykonaj "miniprzygotowania", aby wyizolować zespoły pFUS-RVD (w zależności od liczby RVD pFUS_A i pFUS_B lub pFUS_A30A, pFUS_A30B i pFUS_B).
   2. Opcjonalnie: Sekwencjonowanie poszczególnych wektorów pFUS za pomocą starterów pCR8_F1, pCR8_R1 (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów). Sekwencjonowanie można również przeprowadzić na końcowych konstrukcjach TALEN (sekcja 2.5.2); jednak w przypadku dłuższych TALEN-ów pełne odczyty wszystkich RVD mogą nie być możliwe przy użyciu sekwencjonowania Sangera.
   3. Ustaw reakcję Golden Gate #2 dla każdego pojedynczego TALEN. 150 ng każdego wektora pFUS, 150 ng dla każdego wektora pFUS, 150 ng dla pLR-HD, pLR-NG, pLR-NI, pLR-NN (ostatnie "półpowtórzenie") zgodnie z projektem sekwencji RVD, a dla left TALEN użyj 75 ng z pCAG-T7-TALEN-ELD-Destination, a dla prawego TALEN użyj 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-Destination (lub odwrotnie). Dodać 1 μl Esp3I, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4, H₂O do 20 μl całkowitej objętości reakcyjnej.
   4. Umieść reakcje Golden Gate w termocyklerze.
      Program:
      37 °C 5 min
      16 °C 10 min
      10 cykli
      37 °C 15 min
      80 °C 5 min
   5. Zastosować reakcje z sekcji 2.3.4 w celu przekształcenia E. coli.
4. Dzień 4 - Potwierdzenie prawidłowego montażu TALEN
   1. Przesiać 1-3 białe kolonie z każdej płytki metodą PCR kolonii ze starterami TAL_F1 i TAL_R2 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów). Prawidłowo zmontowane TALEN-y pokazują produkt PCR o długości odpowiadającej całkowitej liczbie wbudowanych RVD (Rysunek 1D, to pasmo jest czasami trudne do wykrycia, podczas gdy "efekt drabiny" stanowi solidny wskaźnik udanego montażu).
      Program PCR:
      95 °C 3 min
      95 °C 30 sek
      55 °C 30 sek
      72 °C 3 min
      30-35 cykli < BR / > 72 °C 10 min
   2. Użyj potwierdzonych prawidłowych klonów, aby rozpocząć nocne hodowle bakterii (2-5 ml LB ze 100 μg/ml ampicyliny).
5. Dzień 5 - Potwierdzenie prawidłowego montażu TALEN
   1. Wykonaj "miniprzygotowania" w celu wyizolowania plazmidów pCAG-T7-TALEN.
   2. Jeżeli sekwencjonowanie nie zostało przeprowadzone w sekcji 2.3.2, należy użyć starterów TAL_Seq_5-1 i TAL_R2 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów) w celu określenia prawidłowego montażu RVD w TALEN-ie o pełnej długości.

3. Synteza mRNA nukleazy

1. Generowanie matrycy DNA
   1. Przygotuj wysokiej jakości midi lub maxipreps plazmidów pCAG-T7-TALEN do syntezy mRNA.
   2. Linearyzować 10 μg plazmidu syntezy mRNA TALEN lub ZFN przy użyciu enzymu restrykcyjnego, który preferencyjnie rozszczepia się poniżej i w bliskiej odległości od kodonu STOP nukleazy (w przypadku wektorów pCAG-T7-TALEN należy użyć SacI). Plazmidy do syntezy mRNA zazwyczaj zawierają promotor faga T7 lub SP6 przed sekwencją kodującą nukleazę.
   3. Uruchom 200-500 ng strawionego plazmidu na 0,7-1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy jest całkowicie strawiony.
   4. Usuń sole z trawienia plazmidu, wytrącając DNA za pomocą 0,1 objętości octanu sodu i 3 objętości etanolu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Osadzać DNA przez odwirowanie przy 14 000 x g lub więcej przez 10 minut, przemyć osad 200 μl 70% etanolu, wirować przez kolejne 5 minut, usunąć etanol, wysuszyć osad na powietrzu i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości wody wolnej od RNAzy. Oczyszczanie zlinearyzowanego plazmidu jest również możliwe za pomocą systemu opartego na kolumnach, np. QIAquick PCR Purification Kit.
   5. Określić stężenie matrycy liniowej i użyć 1 μg do ustawienia transkrypcji in vitro.
2. Synteza mRNA i poliadenylacja
   1. Do transkrypcji in vitro plazmidów pCAG-T7-TALEN należy użyć zestawu mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Ustaw reakcję transkrypcji dla każdego TALEN-a na lodzie: do 20 μl z wodą wolną od nukleaz, 10 μl T7 2x NTP/ARCA, 2 μl 10x bufor reakcyjny T7, 1 μg matrycy DNA, 2 μl mieszanki enzymów T7. Wymieszać reakcję i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.
   2. Użyj kompletnej mieszaniny 20 μl reakcji transkrypcyjnej, aby przygotować reakcję poliadenylacji na lodzie: 36 μl wody wolnej od nukleaz, 20 μl 5x bufor EPAP, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μl 10 mM ATP. Wymieszać i usunąć 2,5 μl mieszaniny reakcyjnej jako próbki kontrolne L1 i R1 (odpowiednio dla lewej i prawej nukleazy). Dodać 4 μl enzymu E-PAP i inkubować reakcję przez 45-60 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć kolejne 2,5 μl mieszaniny reakcyjnej jako próbki kontrolne L2 i R2.
3. Oczyszczanie mRNA
   1. Użyj kolumn wirujących NucAway do oczyszczania mRNA (wymiana buforu i usuwanie niewbudowanych nukleotydów). Postukaj w kolumny, aby osadzić suchy żel na dnie kolumny. Kolumnę hydratu z 650 μl buforu do mikroiniekcji bez RNAz (1 mM Tris-Cl, 0,1 EDTA, pH 7,5). Zakryj, wiruj, wystukaj pęcherzyki powietrza i nawilżaj przez 5-15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej i wirować w temperaturze 750 x g, 4 °C przez 2 minuty w celu usunięcia nadmiaru płynu śródmiąższowego. Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce elucyjnej o pojemności 1,5 ml.
   3. Nanieść pełną mieszaninę reakcyjną z sekcji 3.2.2 na kolumnę i wirować w temperaturze 750 x g, 4 °C przez 2 minuty. MRNA nukleazy zostanie teraz rozpuszczone w buforze do mikroiniekcji. Usunąć 2,5 μl oczyszczonych próbek L3 i R3.
   4. Przechowywać mRNA w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania podwielokrotności do mikroiniekcji.
4. Elektroforeza w żelu mRNA
   1. Wyczyść komorę żelową, aby usunąć zanieczyszczenia RNAzą za pomocą 10% roztworu SDS lub RNaseZAP.
   2. Przygotuj 1% żel agarozowy w buforze do biegania 1xTBE.
   3. Wymieszać każdą próbkę RNA L1/R1, L2/R2, L3/R3 z 3 objętościami barwnika NorthernMax Formaldehyde Load Dye i inkubować przez 15 minut w temperaturze 65 °C.
   4. Załaduj próbki i drabinkę wielkości RNA (np. znacznik wielkości RNA Millennium) na żel i uruchom żel przy 10 V/cm w 1x TBE, aż ładowanie barwnika dotrze do końca żelu.
   5. Żel barwić zielonym roztworem SYBR (Invitrogen) przez 30-60 minut z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
   6. Zobrazuj żel i porównaj rozmiary L1/R1 z L2/R2 i L3/R3. Próbki L2 / R2 i L3 / R3 powinny wykazywać prążki o zwiększonym rozmiarze w stosunku do L1 / R1, co wskazuje na udaną poliadenylację w (Figura 2).
   7. Określ stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru.
   8. Przygotuj porcje mRNA do mikroiniekcji, mieszając mRNA lewego nukleazy i prawego nukleazy w stosunku 1:1. Zalecamy przygotowanie podwielokrotności o łącznym stężeniu 200 ng/μl (100 ng/μl każdej nukleazy) poprzez rozcieńczenie buforem do mikroiniekcji. Przechowywać podwielokrotności mRNA w temperaturze -80 °C.

4. Izolacja zarodków i mikroiniekcja

1. Izolacja zarodków. Protokół ten jest z powodzeniem stosowany w przypadku szczepów C57BL/6J i BDF1 i najprawdopodobniej może być dostosowany do innych szczepów powszechnie stosowanych w eksperymentach z mikroiniekcjami, takich jak FVB lub CBF1. Myszy są trzymane w cyklu 12-godzinnym jasno-ciemnym trwającym od 12 godzin do 12 godzin w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z jedzeniem i wodą ad libitum.
   1. Dawczynie superowulacji przeprowadza się w celu zwiększenia wydajności zarodków. 16 samic (w wieku 4 tygodni) ulega superowulacji przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG), a następnie wstrzyknięcie i.p. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) 5 IU 48 godzin później.
   2. Kryj 16 samic z superowulacją do 16 samców w wieku rozrodczym (2-8 miesięcy) natychmiast po wstrzyknięciu hCG.
   3. Składaj samice w ofierze za pomocą zatwierdzonego protokołu eutanazji, takiego jak wdychanie CO₂ .
   4. Odzyskaj zapłodnione oocyty. Oocyty są pobierane z jajowodów następnego ranka, a następnie uwalniane z wszelkich pozostałych komórek wzgórka przez 3-5 minutowy zabieg w 0,1% hialuronidazie bydlęcej rozpuszczonej w pożywce M2. W zależności od wydajności krycia i użytego szczepu, wydajność zarodków może się różnić. 16 samic C57BL/6J produkuje zwykle 150-250 jaj, podczas gdy BDF1 daje odpowiednio 300-400 zapłodnionych oocytów.
2. Mikroiniekcja zarodka
   1. Wstrzyknij mRNA nukleazy. Oocyty w stadium przedjądrzastym są zwykle wstrzykiwane wczesnym popołudniem. Mikroiniekcja cytoplazmatycznego mRNA przeprowadzana jest w pożywce M2 pod olejem mineralnym przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw Nomarski DIC z obiektywem 20X oraz z mikromanipulatorami zarodkowymi i jednostką iniekcyjną. Zalecamy rozpoczęcie iniekcji mRNA TALEN w stężeniu 10 ng/μl (łącznie 20 ng/μl).
   2. Odessać oocyt z kapilarą przytrzymującą i wstrzyknąć mRNA nukleazy do cytoplazmy zarodka, unikając kontaktu z przedjądrzami. Wstrzyknięcie powinno być płytkie, blisko błony plazmatycznej. Objętość wstrzyknięcia powinna być utrzymywana na małym poziomie, a igłę do mikroiniekcji należy wyjąć przy pierwszych objawach rozdęcia cytoplazmatycznego. Seria mikroiniekcji zwykle składa się ze 100-300 oocytów. Zazwyczaj co najmniej 80-90% zarodków powinno przeżyć wstrzyknięcie bez natychmiastowej lizy.
   3. Po mikroiniekcji umieścić zarodki na 1 godzinę w pożywce M16 (Sigma) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i przenieść zarodki, które przeżyły, do matek zastępczych w ciąży rzekomej.

5. Chirurgiczny transfer zarodków

1. Przygotować biorczynie zarodków w ciąży rzekomej (matki zastępcze) na dzień przed mikroiniekcją mRNA. Dojrzałe samice (w wieku 3-6 miesięcy) wytrzymałego szczepu niekrewniaczego, takiego jak CD-1, dobrze nadają się do tej roli. Wywołaj ciążę rzekomą poprzez krycie samic poprzedniego dnia z samcami poddanymi chirurgicznie lub genetycznie wazektomii²⁸. Tylko samice o ciśnieniu 0,5 dpc z przezroczystym czopem kopulacyjnym są wykorzystywane jako biorcy zarodków. U niewykorzystanych samic ciąża rzekoma znika po około 3 tygodniach, co pozwala na ich wielokrotne stosowanie.
2. Znieczulenie samic matki zastępczej o natężeniu 0,5 dpc poprzez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy, ksylazyny (odpowiednio 120 mg/kg i 16 mg/kg). Preparat ten gwarantuje, że czas tolerancji chirurgicznej ~30 min jest więcej niż wystarczający dla przewidywanego czasu operacji wynoszącego 5-10 min.
3. Ułóż znieczulone zwierzę na brzuchu na ciepłej powierzchni i zdezynfekuj miejsce nacięcia odpowiednim środkiem dezynfekującym, takim jak 70% etanol lub mieszanina chlorheksydyny i alkoholu.
4. Naciąć skórę na grzbiecie zwierzęcia i otworzyć jamę otrzewnej sterylnymi nożyczkami.
5. Wizualizuj i uzewnętrzniaj róg macicy, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową przyczepioną do jajnika. Utrzymuj narządy wilgotne, używając ciepłego 0,9% roztworu NaCl. Należy pamiętać, że miejsce operacji może wymagać obciągnięcia sterylnym opatrunkiem lub ogolenia, aby zachować zgodność z lokalnymi wytycznymi weterynaryjnymi.
6. Unieruchomij narządy rozrodcze, przycinając poduszeczkę tłuszczową jajnika za pomocą zacisku buldoga.
7. Delikatnie chwyć jajowód tuż przed bańką za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i użyj igły podskórnej 30 G, aby utworzyć mały otwór w ścianie jajowodu.
8. Wyjąć igłę i ponownie włożyć cienką szklaną kapilarnę zawierającą zarodki do otworu umożliwiającego umieszczenie zarodków w bańce, delikatnie w ustnik uchwytu kapilary. Po zdeponowaniu zarodków w bańce należy usunąć naczynia włosowate i umieścić narządy rozrodcze z powrotem w jamie ciała.
9. Zamknij jamę otrzewnej serią sterylnych szwów (Prolene 6-0).
10. Zamknij skórę za pomocą 1-2 klipsów do nawijania ran (Autoclip 9 mm) w zależności od wielkości otworu.
11. Po operacji należy zwrócić zwierzęta do ich domowej klatki i nadzorować je, aż efekt znieczulenia ustąpi.
12. Aby zminimalizować stres, w miarę możliwości trzymaj myszy w stabilnych grupach społecznych (2-4 zwierzęta/klatka typu III).
13. Przez 3 dni po zabiegu należy stosować pooperacyjne leki przeciwbólowe w postaci Dafalganu dodawanego do wody pitnej (Paracetamol 200 mg/kg m.c.).

6. Analiza założycieli za pomocą PCR i endonukleazy T7 lub trawienia enzymem restrykcyjnym

1. Zaprojektuj startery do amplifikacji obszaru między 200-700 pz wokół miejsca wiązania nukleazy. Odległości między regionem dystansowym starter-nukleaza do przodu i regionem dystansowym nukleazy i starterem odwrotnym powinny być wystarczająco różne, aby umożliwić wykrycie dwóch oddzielnych prążków dla trawionych produktów na żelu agarozowym (patrz rysunki 3 i 4 dla przykładów).
2. Uruchom PCR w zoptymalizowanych warunkach. Sprawdź rozmiar amplikonu PCR na żelu agarozowym.
3. Opcjonalnie: Oczyść produkty PCR, np. za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR w celu usunięcia soli i nukleotydów z mieszaniny PCR. Wiele enzymów restrykcyjnych jest aktywnych w próbkach PCR uzupełnionych odpowiednim buforem enzymu restrykcyjnego, a oczyszczanie nie jest konieczne. Z powodzeniem zastosowaliśmy również endonukleazę T7 w buforze QiagenTaq PCR uzupełnionym o NEBuffer 2.
4. 1. Test endonukleazy T7. Wymieszaj 17 μl produktu PCR z 2 μl NEBuffer 2 i uruchom program tworzenia heterodupleksu (Rysunek 3b) w termocyklerze:
      95 °C 2 min
      95 °C do 85 °C (-2 °C/s)
      85 °C do 25 °C (-0,1 °C/s)
      4 °C Hold.
      Dodać 1 μl endonukleazy T7 do każdej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. (Można tu również zastosować test geodezyjny (transgenomiczny), który opiera się na nukleazie CEL 1. Proszę zapoznać się z instrukcjami producenta.)
   2. Trawienie restrykcyjne produktu PCR. Zmieszać 17 μl produktu PCR z 2 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Trawić w odpowiedniej temperaturze przez 1 godzinę lub dłużej.
5. Dodaj barwnik ładujący DNA do próbek i uruchom na 2% żelu agarozowym, aby wykryć wyraźne wzorce trawienia u zwierząt typu dzikiego i założycieli zawierających zmutowane allele. Na rysunkach 3 i 4 przedstawiono oczekiwane wyniki.
6. Klonowanie produktów PCR założycieli z dodatnim wynikiem dla zmutowanych alleli do sekwencjonowania Sangera (np. poprzez klonowanie TA do pGEM-T Easylub bezpośrednie sekwencjonowanie mieszanin produktów PCR przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Results

Skonstruowaliśmy plazmidy docelowe zgodne z zestawem Golden GateTALEN opublikowanym przez Cermak et al.¹³, które umożliwiają ekspresję TALEN-ów w komórkach ssaków, a także syntezę mRNA in vitro z promotora faga T7 (ryc. 1C). Plazmidy te przenoszą heterodimeryczne domeny FokI (mutacje ELD lub KKR), które, jak wykazano, zmniejszają efekty off-target w stosunku do homodimerów FokI i zwiększają aktywność rozszczepienia w porównaniu z heterodimerami FokI^{pierwszej generacji 25,29}. Reakcje składania Golden Gate #1 i #2 są zwykle bardzo wydajne, a każda biała kolonia, po przeanalizowaniu za pomocą PCR kolonii, pokazuje oczekiwany wzorzec dla określonej liczby klonowanych RVD (ryc. 1B i 1D).

Analiza żelowa mRNA syntetyzowanego in vitro (Rysunek 2) powinna ujawnić pojedyncze rozróżnialne pasmo z niewielkim lub żadnym rozmazem dla każdej analizowanej próbki. Powinno nastąpić wyraźne przesunięcie wielkości między próbkami L1/R1 i L2/R2, L3/R3, co wskazuje na udaną poliadenylację.

Zwierzęta założycielskie mogą być badane pod kątem zmutowanych alleli indukowanych przez NHEJ za pomocą genotypowania PCR, a następnie trawienia endonukleazy T7 (Rysunek 3) lub trawienia restrykcyjnego przy użyciu enzymu, który rozszczepia sekwencję typu dzikiego w obszarze dystansowym pary nukleaz (Rysunek 4). Test endonukleazy T7 ma zastosowanie do każdego rodzaju mutacji, niezależnie od specyficznej sekwencji genomowej w regionie dystansowym wstrzykniętej pary nukleaz; jednak wykrywa tylko niezgodności między niciami DNA w produktach heteroduplex PCR. Tak więc, w rzadkim przypadku, gdy założyciel jest nosicielem dwóch identycznie zmutowanych alleli, produkty PCR nie wykazywałyby żadnego wzorca trawienia T7. Takie rozróżnienie jest jednak zawsze możliwe, gdy określone miejsce restrykcyjne znajduje się w regionie dystansowym nukleazy, które zostanie wyeliminowane przez insercji/delecje wywołane przez NHEJ (ryc. 5). W tym przypadku niestrawione prążki wskazują na obecność mutacji, a brak jakichkolwiek strawionych produktów silnie sugeruje, że założyciel jest nosicielem mutacji w obu allelach docelowego genu (oznaczonych gwiazdkami na rycinie 4b).

Rysunek 1. Klonowanie RVD TALEN do heterodimerycznych wektorów pCAG-T7-Destination. A) Składanie tablic RVD w wektory pFUS. W tym miejscu pokazano przykład dla pary TALEN z pojedynczymi tablicami TALE składającymi się odpowiednio z 15 i 17 RVD (w przypadku tablic TALE dłuższych niż 21 RVD wymagane są trzy zestawy pFUS-RVD, których nie pokazano). Strzałki wskazują startery dla specyficznych dla pFUS reakcji PCR kolonii. B) Produkty PCR amplifikowane z prawidłowych zestawów pFUS zazwyczaj wykazują prążek odpowiadający łącznej długości wszystkich sklonowanych RVD (np. około 1,1 kb dla 10 RVD) oraz "drabinę" mniejszych, mniej widocznych prążków ze względu na powtarzalny charakter macierzy RVD. C) Końcowy montaż macierzy pFUS-RVD i plazmidu zawierającego ostatnie powtórzenie (pLR) w heterodimeryczne wektory ekspresyjne TALEN z wariantami FokIELD i FokIKKR, odpowiednio. Szkielet TALEN (oznaczony jako N i C) przypomina architekturę opublikowaną przez Millera i wsp.²³ Promotor CAG (CMV early enhancer element / chicken beta-actin) zapewnia wysoki poziom ekspresji w transfekowanych komórkach ssaków, podczas gdy promotor faga T7 umożliwia syntezę mRNA in vitro (użyj SacI do linearyzacji wektora za kodonem STOP nukleazy). D) Colony PCR z użyciem starterów oznaczonych strzałkami w C) umożliwia identyfikację prawidłowo zmontowanych TALEN-ów. Produkty PCR o pełnej długości są często mniej widoczne, podczas gdy "efekt drabiny" stanowi solidny wskaźnik udanego montażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Kontrola jakości syntezy mRNA nukleazy in vitro z wykorzystaniem elektroforezy w żelu agarozowym. Jako przykład pokazano mRNA ZFN (L, lewy ZFN; R, prawy ZFN). Próbki L1/R1 wykazują mRNA przed poliadenylacją, próbki L2/R2 wykazują poliadenylowane mRNA, a L3/R3 wykazują oczyszczone poliadenylowane mRNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Przykład testu endonukleazy T7 stosowanego do identyfikacji zwierząt założycielskich będących nosicielami indukowanych nukleazą mutacji locus docelowego. A) Para TALEN została zaprojektowana do rozszczepiania w regionie kodującym mysi gen białka prionowego (Prnp, sekwencja docelowa TALEN może być dostarczona na żądanie). Produkt PCR jest wytwarzany przy użyciu startera skierowanego do przodu (F) umieszczonego 110 pz przed i startera odwrotnego (R) 250 pz za miejscem rozszczepienia TALEN. B) Produkt PCR jest następnie poddawany tworzeniu heterodupleksu i trawieniu endonukleazy T7. C) Mutageneza indukowana przez TALEN w obrębie docelowego regionu genomu pojedynczych założycieli ujawnia się przez obecność pełnowymiarowego produktu PCR z produktami trawienia 250 i 110 bps. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Przykład trawienia restrykcyjnego produktów PCR stosowanych do identyfikacji zwierząt założycielskich będących nosicielami mutacji locus docelowych wywołanych nukleazą. ZFN specyficzny dla myszy Rosa26 locus²⁹ jest ukierunkowany na miejsce ograniczenia XbaI w intronie 1. A) Założyciele zostali przebadani przez genotypowanie PCR przy użyciu startera do przodu (F) umieszczonego 500 pz przed i startera odwrotnego (R) 250 pz poniżej miejsca rozszczepienia. B) Trawienie produktów PCR z XbaI ujawnia wzorce trawienia wskazujące na myszy z mutacjami biallelicznymi (oznaczone gwiazdkami), mutacjami monoallelicznymi (strawione i niestrawione prążki, np. zwierzę 2) i myszy wt (pełne trawienie, np. zwierzę 21). C) Sekwencjonowanie myszy z potencjalnymi modyfikacjami biallelicznymi wykazuje do 3 (zwierzę 24) różnych insercji/delecji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

powiedział: powiedział: powiedział:

Nazwa podkładu	Sekwencja od 5 stóp do 3 stóp
pCR8_F1	ttgatgcctggcagttccct powiedział:
pCR8_R1	cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1	ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2	ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1	catcgcgcaatgcactgac powiedział:

Tabela 1. Sekwencje starterów używanych do PCR kolonii i sekwencjonowania w ramach protokołu składania Golden Gate TALEN.

Plazmid/Kolekcja	Współautorów	Identyfikator Addgene	Komentarze
Zestaw efektorów Golden Gate TALEN i TAL 2.0	Laboratorium Voytasa	1000000024	Zawiera wszystkie plazmidy niezbędne do montażu Golden Gate TALEN
pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD wektory docelowe	Laboratorium w Pelczarze	40131, 40132	Dodatkowe plazmidy do ekspresji TALEN w komórkach ssaków i syntezy mRNA in vitro

Tabela 2. Plazmidy i kolekcje plazmidów wymagane do montażu Golden Gate TALEN można uzyskać z Addgene (www.addgene.org).

Zasoby online	Komentarze
http://tale-nt.cac.cornell.edu	Projekt TALEN; Przewidywanie TALEN poza celem
http://zifit.partners.org/ZiFiT/	Konstrukcja TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9
http://www.genome-engineering.org	Projekt TALEN, CRISPR/Cas9; Prognozowanie niecelne CRISPR/Cas9
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html	Montaż sekwencji TALEN w celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html	Projekt montażu modułowego ZFN
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab/segallabsoftware	Projekt montażu modułowego ZFN

Tabela 3. Zasoby online do projektowania ZFN, TALEN i CRISPR/Cas9.

Discussion

Zaprojektowane podejścia do edycji genomu oparte na nukleazach znacznie rozszerzyły zakres gatunków podatnych na ukierunkowane modyfikacje ich odpowiednich genomów^10,12. U myszy celowanie genowe w komórkach ES jest standardową techniką od ponad dwóch dekad; jednak okazało się, że trudno jest przystosować się do komórek ES od gatunków innych niż mysz, chociaż ostatnio odniesiono pewne sukcesy w komórkach ES szczurów. Nawet przy dostępności "gotowych" klonów mysich komórek ES ukierunkowanych na geny, dostarczanych przez konsorcja takie jak EUCOMM, KOMP lub NorCOMM³ , edycja genomu przez ZFN i TALEN zapewnia większą precyzję i elastyczność w zakresie spektrum modyfikacji, które można wprowadzić do genomu myszy. Zwierzęta założycielskie noszące mutacje zależne od nukleazy wydają się być wysoce kompetentne w linii zarodkowej^4-6,20,21, co nie zawsze ma miejsce w przypadku chimer pochodzących z wstrzyknięć komórek ES w blastocysty. W związku z tym w niektórych przypadkach mikroiniekcja zaprojektowanych nukleaz może skutkować znacznie szybszym generowaniem nowych linii myszy z ukierunkowanymi modyfikacjami genomu.

Pomyślne wygenerowanie myszy z nokautem przez wstrzyknięcie ZFN i TALEN zależy w dużym stopniu od aktywności wstrzykniętej pary nukleaz. Wykazano, że TALEN-y mają wysoki wskaźnik sukcesu w celowaniu w szeroki zakres genów w wielu organizmach; jednak ostatnie badania sugerują, że wiązanie TALEN jest wrażliwe na metylację cytozyny^30,31. W ten sposób nowo wygenerowane pary nukleaz, na przykład TALEN-y sklonowane do wektorów pCAG-T7, mogą być przejściowo transfekowane do linii komórkowej myszy, takiej jak NIH-3T3 lub Neuro-2a, które do pewnego stopnia naśladują stan chromatyny zarodka myszy. W tym przypadku aktywność nukleazy można oszacować za pomocą testu endonukleazy T7 lub trawienia restrykcyjnego produktu PCR, jak opisano w sekcji 5 przed syntezą mRNA i mikroiniekcją. Zalecamy sekwencjonowanie interesującego regionu genomu w odpowiedniej linii komórkowej i szczepie myszy używanym do eksperymentów mikroiniekcyjnych.

W mysich zygotach różne pary TALEN lub ZFN będą działać optymalnie przy różnych stężeniach mRNA, a zatem może być konieczne eksperymentalne określenie optymalnego stężenia roboczego mRNA mikroiniekowanej nukleazy. W zależności od pary nukleaz, zbyt niskie stężenie spowoduje brak rozszczepienia, podczas gdy zbyt wysokie może spowodować śmiertelność zarodka. W zależności od pary nukleaz odnieśliśmy sukces stosując całkowite stężenia mRNA tak niskie, jak 2 ng/μl i tak wysokie, jak 200 μg/ul. Efekty te są trudne do przewidzenia na podstawie doświadczeń w hodowli komórkowej, a stężenie nukleazy optymalne zarówno dla przeżycia zarodka, jak i tempa modyfikacji locus docelowego musi zostać określone empirycznie.

Wysoce aktywny ZFN lub TALEN może rozszczepić swoją sekwencję docelową poza stadium jednokomórkowe zarodka, któremu wstrzyknięto mikrowstrzyknięcie, a tym samym powodować złożone wzorce mutagenezy i mozaikowości u założycieli. My i inni⁴ zaobserwowaliśmy trzy lub więcej odrębnych zmutowanych alleli u jednego założyciela (Figura 5C). Tak więc, przy tworzeniu nowej linii myszy od tych założycieli, potomstwo powinno być dokładnie przebadane przez sekwencjonowanie pod kątem obecności korzystnej mutacji, ponieważ testy trawienia dostarczają dowodów tylko na obecność nieokreślonej mutacji.

Jednym z często wysuwanych zarzutów wobec systemów ZFN i TALEN jest możliwość, że nukleazy te są również zdolne do rozszczepiania sekwencji obecnych w innym miejscu genomu, które są podobne do miejsc docelowych. Takie efekty off-target zaobserwowano w przypadku odczynników wczesnej generacji wykorzystujących homodimeryczną domenę FokI, a konstrukty heterodimerów zaprojektowano w celu złagodzenia efektów off-target²⁵. Potencjalne miejsca poza celem można do pewnego stopnia przewidzieć in silico^32,33 i poddać je badaniom przesiewowym za pomocą PCR i sekwencjonowania. Oczywistą zaletą stosowania ZFN i TALEN-ów do generowania myszy, a nie linii komórkowych, jest możliwość usunięcia docelowych mutacji niezwiązanych z pożądaną modyfikacją genomu poprzez wykonanie kilku krzyżówek wstecznych z wybranym szczepem typu dzikiego. W przypadku analizy dużej liczby myszy założycieli, głębokie sekwencjonowanie nowej generacji produktów PCR wygenerowanych z locus ukierunkowanego na nukleazę i loci przewidywanych in silico poza celem może stanowić alternatywny odczyt jakościowy i ilościowy dla testów trawienia produktów PCR.

Techniki wspomaganego rozrodu opisane w tym protokole są zoptymalizowane dla standardowych szczepów myszy używanych do eksperymentów mikroiniekcyjnych, takich jak C57Bl/6J lub B6D2F1. Myszy różnego pochodzenia, takie jak szczepy niekrewniacze, mogą być w zasadzie wykorzystywane do metod edycji genomu i mogą stanowić bardziej odpowiednie tło genetyczne dla konkretnych pytań badawczych. Skuteczność technik wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, można przewidzieć dla wielu szczepów^34-36 , ale może wymagać dalszej optymalizacji w przypadku szczepów niestandardowych w celu uzyskania wystarczającej liczby zarodków do mikroiniekcji nukleazy.

Oprócz ZFN i TALEN, wprowadzono nowe nukleazy projektowe, takie jak sterowany RNA system CRISPR/Cas9^9,37,38 do zastosowań w edycji genomu. Wszystkie opisane tutaj metody mikroiniekcji i analizy zwierząt założycielskich mają również zastosowanie do CRISPR/Cas9 i przyszłych trybów edycji genomu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsaI	NEB	R0535S lub L
Esp3I	Thermo Scientific	ER0451
T4 Ligaza	NEB	M0202S lub L
Spectinomycin	Sigma	S0692-1ML
Ampicylina	Sigma	A0166
X-Gal	Sigma	B4252
IPTG	Sigma	I6758
Epicentrum nukleazy bezpieczne dla plazmidu		E3101K
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAGEN Zestaw Midi Plasmid	Qiagen	12143
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit	Invitrogen	AM1345
NucAway Spin Columns	Invitrogen	AM10070
RNaseZAP	Sigma	R2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load Dye	Invitrogen	AM8552
RNA Markery Millennium	Invitrogen	AM7150
10x TBE bufor:	Thermo Scientific	B52
T7 endonukleaza	NEB	M0302S lub L
pGEM-T EasyVector System I	Promega	A3600
SYBR Green I Soap Acid Gel Stain	Invitrogen	S-7563
klacz ciężarna' s gonadotropina surowicy (PMSG)	Sigma	G4877
ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)	Sigma	CG5
M2 pożywka do hodowli zarodków	Sigma	M7167
M16 pożywka do hodowli zarodków	Sigma	M7292
Olej mineralny, testowany na zarodkach	Sigma	M8410
Ketamina	CentraVet	Ket 201
Xylazine	Sigma Aldrich	46995
Equipment/Tools
Mikroskop odwrócony z optyką Nomarski DIC (na przykład Nikon Eclipse TE200)	Mikromanipulatory firmy Nikon
(na przykład Narishige, NT88NF)	Narishige
Naczynia włosowate do przechowywania zarodków	Sutter Instruments	B100-75-10
Naczynie włosowate do iniekcji zarodków	Narishige	GD-1
Ściągacz do naczyń włosowatych (na przykład Sutter P97)	Sutter Instruments
Microforge (na przykład Narishige MF-900)	do skóry Narishige
Walton	FST	14077-10
Nożyczki chirurgiczne	FST	14041-10
Sonda chirurgiczna	FST	10140-03
System odruchowych klipsów do ran (9 mm)	FST	12031-09
Odruchowe klipsy do ran (9 mm)	FST	12032-09
Kleszcze precyzyjne Dumont 5	FST	11254-20
Kleszcze zakrzywione Moria	FST	11370-31
Kleszcze precyzyjne Moria	FST	11399-80
Zacisk Dietrich bulldog	FST	18038-45
C57BL/6J myszy	Jackson Labs	kod szczepu 000664
myszy CD-1	kod szczepu	Charles River