Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Podsumowanie

Przeszczep komórek stanowi strategię leczenia zwyrodnienia siatkówki charakteryzującego się utratą fotoreceptorów. W tym miejscu opisujemy metodę wzbogacania fotoreceptorów do przeszczepiania i ich przeszczepiania podsiatkówkowego dorosłym myszom.

Streszczenie

Upośledzenie wzroku i ślepota spowodowane utratą komórek światłoczułych siatkówki, tj. fotoreceptorów, stanowi główną przyczynę niepełnosprawności w krajach uprzemysłowionych. Zastąpienie zdegenerowanych fotoreceptorów przeszczepem komórek stanowi możliwą opcję leczenia w przyszłych zastosowaniach klinicznych. Rzeczywiście, ostatnie badania przedkliniczne wykazały, że niedojrzałe fotoreceptory, wyizolowane z siatkówki noworodka myszy w 4. dniu po urodzeniu, mają potencjał do integracji z siatkówką dorosłej myszy po przeszczepie podsiatkówkowym. Komórki dawcy wygenerowały dojrzałą morfologię fotoreceptorów, w tym segmenty wewnętrzne i zewnętrzne, okrągłe ciało komórki znajdujące się w zewnętrznej warstwie jądrowej oraz zakończenia synaptyczne w bliskiej odległości od endogennych komórek dwubiegunowych. Rzeczywiście, ostatnie doniesienia wykazały, że fotoreceptory dawcy funkcjonalnie integrują się z obwodami neuronalnymi myszy gospodarzy. W celu przyszłego zastosowania klinicznego takiego podejścia do wymiany komórek, oczyszczone zawiesiny wybranych komórek muszą zostać wygenerowane i umieszczone we właściwej pozycji w celu prawidłowej integracji z okiem. W celu wzbogacenia prekursorów fotoreceptorów sortowanie powinno opierać się na specyficznych antygenach powierzchniowych komórek, aby uniknąć genetycznej modyfikacji reporterowej komórek dawcy. Tutaj pokazujemy sortowanie komórek związanych z magnesem (MACS) - wzbogacanie prekursorów fotoreceptorów pałeczkowych do przeszczepu wyizolowanych z siatkówki noworodka myszy reporterowych specyficznych dla fotoreceptorów na podstawie markera powierzchni komórki CD73. Inkubacja z przeciwciałami anty-CD73, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z mikrokulkami pozwoliła na wzbogacenie prekursorów fotoreceptorów pręcików przez MACS do około 90%. W porównaniu z cytometrią przepływową, MACS ma tę zaletę, że można ją łatwiej zastosować do standardów GMP i że duże ilości komórek można sortować w stosunkowo krótkich odstępach czasu. Wstrzyknięcie wzbogaconych zawiesin komórkowych do przestrzeni podsiatkówkowej dorosłych myszy typu dzikiego spowodowało 3-krotnie wyższy współczynnik integracji w porównaniu z niesortowanymi zawiesinami komórek.

Wprowadzenie

Wzrok jest jednym z podstawowych zmysłów człowieka. Upośledzenie tego zmysłu i ślepota są jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności w krajach uprzemysłowionych. Dominującą przyczyną upośledzenia wzroku lub ślepoty jest zwyrodnienie siatkówki, charakteryzujące się utratą komórek fotoreceptorów, co można zaobserwować w zwyrodnieniu plamki żółtej, barwnikowym zwyrodnieniu siatkówki, dystrofii czopkowo-pręcikowej i innych schorzeniach. Do tej pory skuteczna terapia przywracająca utracony wzrok nie jest dostępna. W 2006 i 2008 roku dwa różne laboratoria poinformowały, niezależnie od siebie, o udanym przeszczepie komórek prekursorowych fotoreceptorów pręcikowych do siatkówki dorosłych myszy typu dzikiego^1,2. W ten sposób pojawia się możliwość przeszczepu komórek prekursorowych fotoreceptorów również do zdegenerowanej siatkówki, w celu zastąpienia zdegenerowanych fotoreceptorów i przywrócenia wzroku. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że takie przeszczepione komórki prekursorowe fotoreceptorów wywołują kryteria morfologiczne dojrzałych fotoreceptorów typu dzikiego, takie jak prawidłowo rozwinięte segmenty zewnętrzne³, zakończenia synaptyczne w bliskim sąsiedztwie endogennych komórek dwubiegunowych i okrągłe ciało komórki znajdujące się w zewnętrznej warstwie jądrowej^2-4, a także zdolność do funkcjonalnej integracji z obwodami neuronalnymi gospodarza^5-7. Jedną z głównych zasad tej strategii jest wykorzystanie siatkówki młodych myszy w 4. dniu po urodzeniu (PN 4, PN0 definiuje się jako dzień urodzenia), w wyniku czego powstaje mieszanina różnych typów komórek do przeszczepu. Na tle przyszłego zastosowania terapeutycznego, mieszanina ta musi zostać oczyszczona pod kątem komórek prekursorowych fotoreceptorów. CD73 został opisany jako pierwszy marker powierzchniowy komórki specyficzny dla młodych fotoreceptorów w siatkówce^8-10. W tym miejscu demonstrujemy metodę oczyszczania komórek prekursorowych fotoreceptorów w oparciu o ten marker powierzchni komórki i z wykorzystaniem techniki sortowania komórek związanych z magnesem (MACS). MACS może mieć zalety w porównaniu z technikami sortowania komórek aktywowanymi fluorescencyjnie, ze względu na krótki czas sortowania i łatwiejsze dostosowanie do warunków GMP. Mogliśmy wykazać ~90% wzbogacenie i do 3-krotnie wyższy współczynnik integracji podczas przeszczepiania wzbogaconej populacji do przestrzeni podsiatkówkowej w dorosłej siatkówce typu dzikiego. W związku z tym wzbogacanie komórek prekursorowych fotoreceptorów w oparciu o MACS i przeszczep podsiatkówkowy są niezawodnymi i obiecującymi technikami opracowywania regeneracyjnej strategii terapeutycznej w leczeniu zwyrodnienia siatkówki.

Protokół

Oświadczenie dotyczące etycznego użytkowania i opieki nad zwierzętami:

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane w ścisłej zgodności z prawem Unii Europejskiej i niemieckim (Tierschutzgesetz) i przestrzegały Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie i Landesdirektion Dresden (numer zgody: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Przed rozpoczęciem dysocjacji komórek i sortowania komórek

1. Oznaczyć trzy probówki reakcyjne o pojemności 15 ml za pomocą: Wash (W), Frakcji dodatniej (+) i Frakcji ujemnej (-).

2. Dysocjacja siatkówki

1. Odetnij głowę PN 4 szczeniakom za pomocą nożyczek.
2. Krótko opłucz głowę szczeniąt w 70% etanolu, a następnie umyj w PBS.
3. Przenieś głowę do zimnego HBSS i wyłuszczej oko (powtórz ten krok dla wszystkich głów). Aby wyłuszczyć, otwórz powieki i przymocuj oko zakrzywionymi kleszczami w okolicy nerwu wzrokowego. Następnie ostrożnie wyciągnij oko z orbity.
4. Po wyłuszczeniu wszystkich oczu wyizoluj siatkówkę: wprowadź zamknięte nożyczki do nerwu wzrokowego i otwórz ostrza. Wyrzuć RPE/chorid. Usuń soczewki i naczynia krwionośne za pomocą zakrzywionych kleszczy.
5. Przenieś izolowane siatkówki do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór papainy (dostarczany przez zestaw do dysocjacji papainy).
6. Inkubować siatkówki w roztworze papainy przez 30-60 minut w łaźni wodnej lub wytrząsarce (400 obr./min) w temperaturze 37 °C.
   1. Podczas inkubacji siatkówki w roztworze papainy, należy pobrać pipetą 1 ml roztworu ovomukoid do 15 ml probówki reakcyjnej (etykieta "1").
   2. Dodać 60 μl DNazy I (10 mg/ml) + 60 μl roztworu ovomukoid (dostarczonego przez zestaw) + 520 μl EBSS do 15 ml probówki reakcyjnej (etykieta "2").
7. Po inkubacji papainy przenieść roztwór papainy zawierający częściowo strawione siatkówki do probówki reakcyjnej "2".
8. Za pomocą wypolerowanej pipety wykonaj dysocjację mechaniczną (10x w górę iw dół).
9. Odpipetować zawiesinę pojedynczej komórki do probówki reakcyjnej "1". Spróbuj wygenerować 2 warstwy, delikatnie nakładając zawiesinę komórkową na roztwór ovomukoid.
10. Wirować przez 5 minut przy 300 x g (około 1 300 obr./min).
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu MACS.

3. Sortowanie komórek za pomocą magnetycznego sortowania komórek powiązanych (MACS)

1. Dodać X μl szczurzego przeciwciała anty-CD73 do 500 μl w celu uzyskania końcowego stężenia 10 μg/ml.
2. Inkubować 5 minut na lodzie.
3. Napełnić 15 ml probówki reakcyjnej do 10 ml buforem MACS i odwirować ją przez 5 minut z prędkością 300 x g.
4. Usunąć supernatant.
5. Zawiesić osad w 480 μl buforu MACS i dodać 120 μl kozich mikrogranulek IgG przeciwko szczurom.
6. Inkubować 15 minut na lodzie, nie mieszać, nie wstrząsać ani nie mieszać.
7. Napełnić 15 ml probówki reakcyjnej do 5 ml buforem MACS i odwirować ją przez 5 minut przy 300 x g.
8. Podczas odwirowania probówki reakcyjnej:
   1. Dopasuj kolumnę LS do stojaka magnetycznego.
   2. Umieść filtr separacji wstępnej na górze kolumny LS.
   3. Uwodnić filtr wstępnego rozdzielania i kolumnę LS 3 ml buforu MACS i zebrać bufor MACS do probówki do przemywania (W).
9. Usunąć supernatant.
10. Zawiesić osad w buforze MACS o pojemności 500 μl.
11. Załadować zawiesinę komórek o objętości 500 μl do filtra, następnie dodać 1 ml buforu MACS do filtra i zebrać frakcję ujemną do probówki reakcyjnej frakcji ujemnej (-).
12. Następnie dodaj 3 x 3 ml buforu MACS do kolumny, aby zmyć komórki, które nie są związane z kolumną
13. Gdy te 9 ml przejdzie przez kolumnę LS, wyjmij kolumnę ze stojaka magnetycznego i zainstaluj ją na górze probówki reakcyjnej frakcji dodatniej (+).
14. Szybko załaduj 5 ml buforu MACS do kolumny LS i umieść tłok w kolumnie LS i dociśnij go, aż cały bufor przejdzie przez kolumnę.
15. Odwirować probówkę reakcyjną zawierającą frakcję dodatnią przez 5 minut przy 300 x g.
16. Usunąć supernatant, zawiesić ponownie w 500 μl buforu MACS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
17. Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą zwykłego urządzenia do liczenia komórek.
18. Przygotować zawiesinę komórek z frakcji sortowanej dodatnio, zawierającej 2 x^10,5 komórek/μl w buforze MACS i przechowywać w temperaturze 4 °C

4. Przeszczepienie komórek prekursorowych fotoreceptorów posortowanych przez MAC do siatkówki myszy

1. Upewnij się, że masz przygotowane wszystkie następujące roztwory: 1 ml sterylnego PBS lub HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml sterylnego dejonizowanego_H2O, podwielokrotności frakcji zawiesiny komórek w temperaturze 4 °C.
2. Znieczulenie dorosłej myszy (tj. w wieku 2-4 miesięcy) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia chlorowodorku medetomidyny (0,01 mg/10 g masy ciała), ketaminy (0,75 mg/10 g masy ciała). Następnie należy wykonać podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg masy ciała) w celu złagodzenia bólu.
3. Rozszerz źrenice kroplą Fenylefryny 2,5%-Tropicamidu 0,5%.
4. Zamocuj mysz w uchwycie na głowę myszy i umieść pod mikroskopem stereoskopowym.
5. Nałóż kroplę żelu Visidic, aby zapobiec wysuszeniu oka.
6. Zrób mały otwór na granicy między twardówką a rogówką (odpowiednio lub serrata) za pomocą sterylnej igły 30 G 1/2 cala.
7. Pokrój zwykły szkiełko okładki na małe (około 5 mm x 5 mm) kawałki za pomocą pisaka diamentowego, umieść jeden z tych kawałków na rogówce, umożliwiając bezpośrednią wizualizację siatkówki.
8. Przepłucz kilkakrotnie wstępnie wysterylizowaną strzykawkę mikrolitrową wodą dejonizowaną.
9. Załadować strzykawkę mikrolitrową 1 μl zawiesiny komórek, skierować igłę stycznie przez spojówkę i twardówkę i umieścić pod kontrolą wzrokową w nosowej połowie siatkówki.
10. Delikatnie przebij otwór w siatkówce, aż dotrze do przestrzeni podsiatkówkowej, wstrzyknij zawiesinę komórkową do przestrzeni podsiatkówkowej.
11. Obserwuj pęcherzowe odwarstwienie siatkówki, które powinno być jednolite, pokrywające około 1/4 przestrzeni siatkówki bez krwawienia.
12. Delikatnie wyjmij strzykawkę, otwór siatkówki zamknie się automatycznie.
13. Przepłukać strzykawkę z mikrolitrami kilkakrotnie wodą dejonizowaną.
14. Odłącz mysz od uchwytu na głowę.
15. Obudź mysz, wstrzykując chlorowodorek atipamozolu w celu odwrócenia działania chlorowodorku medetomidyny.
16. Umieść mysz na czas budzenia w ciepłej, ciemnej komorze (około 25 °C).
17. Następne 2 dni po przeszczepieniu buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym rano i po południu w celu złagodzenia bólu.

Wyniki

Aby ocenić zdolność fotoreceptorów pręcikowych do integracji z siatkówką myszy, wykorzystano linię reporterową myszy, w której ekspresja GFP jest sterowana przez promotor białka Nrl (neural retina leucine zipper; Nrl-GFP)¹¹. Nrl jest najwcześniejszym markerem fotoreceptorów pręcikowych, którego ekspresja rozpoczyna się w dniu E12.5 i trwa przez cały okres dorosłości, co umożliwia specyficzne znakowanie komórek fotoreceptorów pręcikowych dawcy.

Szczenięta PN 4 Nrl-GFP poddano dekapit...

Dyskusja

Przeszczepienie podsiatkówkowe komórek prekursorowych fotoreceptorów stanowi niezawodne narzędzie do osiągnięcia integracji tych wrażliwych na światło komórek z siatkówkami gospodarza w znacznej liczbie^1,2. Może to pozwolić na opracowanie terapii komórkowej do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki^{w przyszłości 6}. Populacja komórek dawcy, obecnie izolowana z siatkówki PN 4, jest mieszaniną różnych typów komórek, z których integrują się tylko komórki prekursorowe fotoreceptorów po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Dzięk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System dysocjacji papainy	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	dostarczony DNaza I nie jest stosowana w metodzie
Oczyszczony szczur anty-mysz CD73, klon TY/23	BD Pharmingen	550738	Stężenie podstawowe 0,5 mg / ml
Kozie mikrokulki anty-szczurze	IgG Miltenyi	130-048-501	Całkowita objętość 2 ml
PBS	Gibco	10010-015	Służy do zliczania całkowitej liczby komórek
DNase I	Sigma	D5025-150KU
HBSS	Gibco	14025050	Służy do dysocjacji siatkówki
Trypan blue	Sigma	Fluka93595	Służy do liczenia całkowitej liczby komórek
Vidisic	Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor	Pfizer	76579
Ketamina 10%	Ratiopharm	7538843
Antisedan	Pfizer	76590
Fenylefryna 2,5%-Tropicamid 0,5%	Kliniki uniwersyteckie Drezno Apteka
Filtry do wstępnej separacji	Miltenyi	130-041-407
Kolumny LS	Miltenyi	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303
Separator QuadroMACS	Miltenyi	130-090-976
Szkło ogniopolskie Pipeta Pasteura	Marka	74777 20	Pipeta" Końcówki muszą być polerowane ogniowo i sterylizowane w autoklawie.
Stojak na probówki MACS 15 ml	Miltenyi	130-091-052
Komora do zliczania komórek	Carl Roth	T728.1
Sterylne probówki 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Leica M651 MSD	Leica	M651 MSD	może być używany zamiast Olympus SZX10
Olympus SZX10	Olympus	SZX10	może być używany zamiast Leica M651 MSD
Odwrócony mikroskop stereoskopowy Olympus CKX41	Olympus	CKX41
Kaptur do hodowli komórkowych Thermo Scientific MSC-Advance	Thermo Scientific	51025411
1,5 ml Probówka reakcyjna	Sarstedt	727706400
2 ml Probówka reakcyjna	Sarstedt	72695
Eppendorf Wirówka 5702	VWR (Eppendorf)	521-0733
Uchwyt na głowę myszy	myNeurolab	471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 cala	BD Pharmingen	304000
Strzykawka mikrolitrowa Hamilton 5 i mikro; l, 75RN	Hamilton	065-7634-01	dostarczany bez igieł
Igła specjalna Hamilton RN 34 G	Hamilton	065-207434	Blunt, długość 12 mm
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen - Ostrza 5 mm Proste	narzędzia do nauki	15003-08
Kleszcze Dumont #7 - Titanium Biologie	Fine Science Tools	11272-40
Pióro diamentowe	Tools-tech
15 mm x 15 mm Szkiełka nakrywkowe	Iskry	MIC3366