Choroba, uraz głowy, modyfikacje genetyczne i leczenie myszy lekami mogą mieć głęboki wpływ na zachowanie. Wykorzystując dobrze scharakteryzowane i zweryfikowane podejścia, takie jak zakopywanie marmuru i rozdrabnianie gniazd, zachowania podobne do kompulsywnych można dokładnie udokumentować u myszy jako modele ludzkiego zaburzenia obsesyjno-kompulsywnego i zaburzenia ze spektrum autyzmu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zakopywanie marmuru i rozdrabnianie gniazd jako testy powtarzających się, kompulsywnych zachowań u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaburzenia obsesyjno-kompulsywne (OCD) i zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) są poważnymi i wyniszczającymi schorzeniami psychicznymi, a każde z nich stanowi poważny problem zdrowia publicznego, szczególnie u dzieci. Oba te stany są uwypuklone przez powtarzające się wyrażanie bezsensownych zachowań. Osoby z OCD często wykazują sprawdzanie, częste mycie rąk i liczenie. Dzieci z ASD angażują się również w powtarzające się stukanie, trzepotanie ramionami lub dłońmi oraz kołysanie. Zachowania te mogą się znacznie różnić pod względem intensywności i częstotliwości ekspresji. Bardziej intensywne formy powtarzających się zachowań mogą nawet prowadzić do kontuzji (np. nadmierna pielęgnacja, mycie rąk i samostymulacja). Zachowania te są zatem bardzo destrukcyjne i utrudniają normalny dyskurs społeczny. Możliwości leczenia powtarzających się zachowań w OCD i ASD są nieco ograniczone i istnieje duże zainteresowanie opracowaniem skuteczniejszych terapii dla każdego schorzenia. W ciągu ostatnich trzech dekad opracowano liczne modele zwierzęce do oceny zachowań podobnych do kompulsywnych. Być może modelami zwierzęcymi o największej trafności i łatwości użycia są test zakopywania marmuru i test rozdrabniania gniazda. Oba testy wykorzystują fakt, że zachowania docelowe występują spontanicznie u myszy. W teście zakopywania marmuru 20 kulek jest ułożonych na powierzchni czystej ściółki. Liczba kulek zakopanych podczas 30-minutowej sesji jest oceniana przez badaczy ślepych na leczenie lub status badanych. W teście rozdrabniania gniazda gniazdo składające się z rozdrobnionego włókna bawełnianego jest wstępnie ważone i umieszczane na wierzchu ściółki klatki, a następnie określa się ilość gniazda pozostałą nienaruszoną po 30-minutowej sesji badawczej. Obecnie opisujemy protokoły i pokazujemy dokumentację filmową z zakopywania marmuru i rozdrabniania gniazd. Oba testy są łatwe i dokładne i każdy z nich jest wrażliwy na niewielkie zmiany w ekspresji zachowań kompulsywnych, które wynikają z manipulacji genetycznych, choroby lub urazu głowy.
Wprowadzenie
Mysie modele ludzkich zachowań, a w szczególności zaburzeń psychicznych, stanowią ważne i niezbędne eksperymentalne podejścia do badania mechanizmów chorobowych i opracowywania nowych terapii. Wiele chorób psychicznych pozostaje niezwykle trudnych do modelowania u zwierząt (np. schizofrenia). Jednak zwierzęta wykazują dużą liczbę naturalnych i charakterystycznych zachowań, które można łatwo powiązać z podobnymi zachowaniami u ludzi. Ruch lub aktywność lokomotoryczna to jeden z przykładów zachowania u zwierząt, które ma odpowiednik u ludzi. Gryzonie często angażują się w różne powtarzające się zachowania, a przykładami są pielęgnacja lub kopanie. Jednym ze stanów psychicznych, który wiąże się z przejawianiem nawracających i niepożądanych zachowań u ludzi, jest zaburzenie obsesyjno-kompulsywne (OCD). Zachowania, które są bardzo charakterystyczne dla OCD, obejmują sprawdzanie, liczenie i nadmierne mycie lub pielęgnację. OCD jest bardzo rozpowszechnionym (dotyka 1-3% populacji) i wyniszczającym zaburzeniem psychicznym1. W leczeniu OCD zastosowano wiele podejść farmakologicznych i behawioralnych. Wiele z nich nie zapewnia długotrwałej ulgi, a nawroty są powszechne pod koniec schematu leczenia2,3. Innym stanem psychicznym, który wiąże się z wyrażaniem powtarzających się zachowań, jest zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD). ASD charakteryzują się deficytami w komunikacji i interakcjach społecznych oraz powtarzającymi się, stereotypowymi zachowaniami, takimi jak kręcenie się, kołysanie, machanie palcami lub trzepotanie oraz złożone ruchy ciała. Centers for Disease Control and Prevention szacuje, że u około 1 na 88 dzieci diagnozuje się ASD. Możliwości leczenia tego zaburzenia są bardzo ograniczone pod względem liczby i skuteczności4,5. Intensywność i częstotliwość występowania powtarzających się zachowań w OCD i ASD może stać się na tyle duża, że wyprze większość innych normalnych zachowań i interakcji społecznych u pacjentów z tymi schorzeniami. W świetle rozpowszechnienia i wyniszczającego charakteru schorzeń psychicznych charakteryzujących się powtarzającymi się zachowaniami oraz biorąc pod uwagę słabe zrozumienie ich przyczyn i ograniczone możliwości leczenia, wykorzystanie modeli zwierzęcych do badania tych zachowań nabiera dodatkowej pilności.
W ciągu ostatnich 30 lat opracowano dużą liczbę zwierzęcych modeli powtarzających się zachowań obserwowanych w OCD i ASD iopublikowano wiele doskonałych recenzji opisujących te modele. Ogólnie rzecz biorąc, te uznane modele można sklasyfikować jako genetyczne, farmakologiczne, neurorozwojowe i behawioralne, a większość z nich wykazuje dobrą trafność twarzy, konstrukcji i predykcji6,7. Użyliśmy dwóch modeli behawioralnych - zakopywania marmuru i rozdrabniania gniazd - do oceny powtarzających się zachowań u myszy genetycznie zubożonych w serotoninę15,16. Metody te mają wiele zalet, z których nie mniej ważne to łatwość użycia, dokładność, z jaką można oceniać zachowania, spontaniczne wykazywanie tych zachowań u gryzoni oraz ich zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych genetycznie zmodyfikowanych myszy pod kątem nieprawidłowych fenotypów behawioralnych. Co więcej, każdy test jest przeprowadzany w standardowych i znanych klatkach dla gryzoni, zawierających tę samą ściółkę, która jest używana w klatkach domowych badanych, co minimalizuje potrzebę przyzwyczajania myszy do nowych komór testowych. Ograniczenia dotyczące jedzenia i/lub wody nie są wymagane, aby "zmotywować" myszy do działania. Test zakopywania w marmurze wykorzystuje skłonność myszy do kopania w naturalnych warunkach (np. norach, tunelach ewakuacyjnych) i w standardowej pościeli klatkowej, a test rozdrabniania gniazd wykorzystuje fakt, że myszy są z natury zwierzętami gniazdującymi, które budują gniazda w celu ochrony siebie i swojego potomstwa przed warunkami środowiskowymi (np.dźwięk, światło, temperatura). Wykorzystując niewyspecjalizowane i powszechnie dostępne materiały do trzymania gryzoni, zadania związane z zakopywaniem marmuru i rozdrabnianiem gniazd są prostymi i potężnymi testami behawioralnymi powtarzających się, kompulsywnych zachowań u myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły z wykorzystaniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Care and Use Committee Uniwersytetu Stanowego Wayne (zezwolenie o numerze A3310-01).
1. Przygotowanie klatek do zakopania marmuru i rozdrabniania gniazd
- Do testu zakopywania marmuru należy używać standardowych klatek dla szczurów z poliwęglanu (26 cm x 48 cm x 20 cm) z zamontowanymi pokrywami filtrów. Dodaj świeży, bezzapachowy materiał ściółkowy dla myszy do każdej klatki na głębokość 5 cm i wyrównaj powierzchnię ściółki, wkładając kolejną klatkę tego samego rozmiaru na powierzchnię ściółki. Ma to dodatkową zaletę polegającą na odciśnięciu szablonu równoległych linii na powierzchni podsypki, który można wykorzystać do ułożenia marmuru.
- Umieść standardowe szklane kulki zabawkowe (różne style i kolory, średnica 15 mm, waga 5,2 g) delikatnie na powierzchni pościeli w 5 rzędach po 4 kulki (patrz rysunek 1A). Umyj marmury w łagodnym detergencie laboratoryjnym, dokładnie spłucz w destylowanej wodzie dejonizowanej i wysusz przed każdym użyciem.
- Do testu rozdrabniania gniazda należy używać standardowych klatek dla szczurów z poliwęglanu (19 cm x 29 cm x 13 cm) z zamontowanymi pokrywami filtrującymi. Do każdej klatki na głębokość 0,5 cm dodaj świeży, bezzapachowy materiał ściółkowy dla myszy i zapakuj ściółkę, wkładając inną klatkę tego samego rozmiaru na powierzchnię ściółki.
- Zważyć dostępne w handlu gniazda z włókna bawełnianego (5 cm x 5 cm, 5 mm grubości, ~2,5 g każde) na wadze analitycznej i umieścić jedno gniazdo na wierzchu ściółki w każdej klatce testowej (patrz rysunek 3A).
- Ustaw stopery lub timery dla długości sesji pomiaru czasu (30 minut dla każdego testu).
2. Postępowanie ze zwierzętami przed badaniem
- Myszy domowe pojedynczo lub w grupach w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Zapewnij wszystkim myszom jedzenie i wodę ad libitum. Z myszami należy obchodzić się delikatnie przez trzy do pięciu dni przed badaniem. Do obu testów użyj myszy obu płci.
- Wykonaj testy behawioralne między 9:00 a 16:00 i przetransportuj wszystkie klatki domowe zawierające myszy do pomieszczenia testowego 60 minut przed rozpoczęciem testów.
3. Test zakopania w marmurze
- Umieść jedną mysz w rogu klatki zawierającej kulki, uważając, aby umieścić mysz na pościeli jak najdalej od kulek, i umieść górną pokrywę filtra na klatce. Nie jedz i nie pij podczas testu. Pozwól myszy pozostać w klatce w spokoju przez 30 minut.
- Wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w klatce domowej po zakończeniu testu, zwracając szczególną uwagę, aby nie przesunąć ani nie usunąć kulek w procesie wyjmowania obiektu z klatki.
- Osoby oceniające zadania (2-3) ślepe na warunki leczenia lub genotyp badanej myszy w celu policzenia liczby zakopanych kulek. Naciąć marmur jako zakopany, jeśli dwie trzecie jego powierzchni jest pokryte ściółką. Średnie wyniki dla liczby zakopanych kulek dla każdej myszy.
- Odzyskaj wszystkie 20 kulek z pościeli. Wyrzuć pościel.
4. Test rozdrabniania gniazd
- Umieść jedną mysz w klatce zawierającej pojedyncze, wstępnie zważone gniazdo i umieść górną pokrywę filtra na klatce. Nie jedz i nie pij podczas testu. Pozostaw mysz w spokoju w klatce z gniazdem na 30 minut.
- Wyjmij mysz i wróć do niej do klatki domowej po zakończeniu testu. Usuń pozostały nienaruszony materiał gniazdowy z klatki za pomocą kleszczy i pozostaw do wyschnięcia O/N.
- Zważyć pozostałe nierozdrobnione gniazdo i podzielić tę wagę przez masę początkową, aby obliczyć procent rozdrobnionego gniazda. Jeśli chcesz, oceń formę gniazda wytworzonego przez badaną mysz, używając ostatecznej 5-punktowej skali oceny gniazda17, ale zdając sobie sprawę, że ta skala jest generalnie przeznaczona do punktowania budowania gniazda, a nie obsesyjnego rozdrabniania.
- Wyrzuć pozostały rozdrobniony materiał gniazdowy i ściółkę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Główną zaletą testów zakopywania kulek oraz niszczenia gniazda jest fakt, że każdy z nich opiera się na naturalnych i spontanicznych zachowaniach myszy, które można ilościowo określić po zakończeniu badania, co pozwala jednemu badaczowi na przygotowanie eksperymentu, a następnie pozostanie poza pomieszczeniem testowym aż do końca sesji. Krytycznym elementem testu zakopywania kulek jest ostrożne usunięcie badanego zwierzęcia z klatki po zakończeniu testu. Myszy zazwyczaj próbują uniknąć przechwycenia i w tym procesie mogą...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Testy zakopywania marmuru i rozdrabniania gniazd są dobrymi przykładami behawioralnych metod badania powtarzających się i kompulsywnych zachowań u myszy. Oba testy wykazują doskonałą trafność twarzy, budowy i predykcji dla zaburzeń u ludzi, które modelują6-11. Te powtarzające się zachowania są naturalne i spontaniczne u gryzoni, a ich częstotliwość i intensywność mogą się zmieniać po modyfikacjach genetycznych, jak pokazano obecnie, lub po urazie głowy i leczeniu pacjentów lekami. Wartość tych dwóch testów wyn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Departamentu Spraw Weteranów i Narodowych Instytutów Zdrowia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szklane kulki zabawkowe | lokalny sklep z zabawkami | Nie dotyczy | różnych stylów, kolorów, przezroczystych i nieprzezroczystych |
| Gniazda | Klatka na myszy Ancare | NES3600 | |
| serii N10 | Ancare | N10 | standardowa klatka dla gryzoni z drucianym wierzchem |
| Klatka dla szczurów serii R20 | Ancare | R20 | standardowa klatka dla gryzoni z drucianym wierzchem |
| Bed-o'Cobs | Andersons | 8B | Standardowa ściółka dla gryzoni, 1/8 cala |
Bibliografia
- Chamberlain, S. R., Blackwell, A. D., Fineberg, N. A., Robbins, T. W., Sahakian, B. J. The neuropsychology of obsessive compulsive disorder: the importance of failures in cognitive and behavioural inhibition as candidate endophenotypic markers. Neurosci. Biobehav. Rev. 29, 399-419 (2005).
- McGuire, J. F., Lewin, A. B., Horng, B., Murphy, T. K., Storch, E. A. The nature, assessment, and treatment of obsessive-compulsive disorder. Postgrad. Med. 124, 152-165 (2012).
- Fineberg, N. A., Brown, A., Reghunandanan, S., Pampaloni, I. Evidence-based pharmacotherapy of obsessive-compulsive disorder. Int. J. Neuropsychopharmacol. 15, 1173-1191 (2012).
- Dove, D., et al. Medications for adolescents and young adults with autism spectrum disorders: a systematic review. Pediatrics. 130, 717-726 (2012).
- Doyle, C. A., McDougle, C. J. Pharmacotherapy to control behavioral symptoms in children with autism. Expert Opin. Pharmacother. 13, 1615-1629 (2012).
- Albelda, N., Joel, D. Current animal models of obsessive compulsive disorder: an update. Neuroscience. 211, 83-106 (2012).
- Albelda, N., Joel, D. Animal models of obsessive-compulsive disorder: Exploring pharmacology and neural substrates. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 47-63 (2012).
- Wang, L., Simpson, H. B., Dulawa, S. C. Assessing the validity of current mouse genetic models of obsessive-compulsive disorder. Behav. Pharmacol. 20, 119-133 (2009).
- Joel, D. Current animal models of obsessive compulsive disorder: a critical review. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 30, 374-388 (2006).
- Witkin, J. M. Animal models of obsessive-compulsive disorder. Curr. Protoc. Neurosci. 30, 1-9 (2008).
- Deacon, R. M. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nat. Protoc. 1, 122-124 (2006).
- Moy, S. S., Nadler, J. J., Magnuson, T. R., Crawley, J. N. Mouse models of autism spectrum disorders: the challenge for behavioral genetics. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 142, 40-51 (2006).
- Crawley, J. N. Mouse behavioral assays relevant to the symptoms of autism. Brain Pathol. 17, 448-459 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nat. Rev. Neurosci. 11, 490-502 (2010).
- Angoa-Perez, M., et al. Genetic depletion of brain 5HT reveals a common molecular pathway mediating compulsivity and impulsivity. J. Neurochem. 121, 974-984 (2012).
- Kane, M. J., et al. Mice genetically depleted of brain serotonin display social impairments, communication deficits and repetitive behaviors: possible relevance to autism. PLoS One. 7, (2012).
- Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat. Protoc. 1, 1117-1119 (2006).
- Thomas, D. M., Angoa Perez,, Francescutti-Verbeem, D. M., Shah, M. M., Kuhn, D. M. The role of endogenous serotonin in methamphetamine-induced neurotoxicity to dopamine nerve endings of the striatum. J. Neurochem. 115, 595-605 (2010).
- Gyertyan, I. Analysis of the marble burying response: marbles serve to measure digging rather than evoke burying. Behav. Pharmacol. 6, 24-31 (1995).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Hayashi, E., Kuratani, K., Kinoshita, M., Hara, H. Pharmacologically distinctive behaviors other than burying marbles during the marble burying test in mice. Pharmacology. 86, 293-296 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
