Artykuł metodologiczny

Zwężenie aorty wstępującej u szczurów w celu stworzenia modelu przerostu mięśnia sercowego spowodowanego przeciążeniem ciśnieniem

DOI:

10.3791/50983

⸱

29 czerwca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Cardio Vascular Disease Biology, Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology, 2Animal Research Facility, Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology, 3Cardiology Department, Sree Chitra Tirunal Institute for Medical Sciences & Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy stopniową procedurę tworzenia przeciążenia ciśnieniowego i przerostu lewej komory u szczurów Wistar poprzez zwężenie aorty wstępującej za pomocą małego metalowego klipsa. Model ten jest szeroko stosowany do badania zmian przebudowy podczas przerostu mięśnia sercowego oraz do identyfikacji i oceny strategii regresji takich zmian.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwężenie aorty wstępującej jest najczęstszym i najbardziej udanym modelem chirurgicznym do wywoływania przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca. Tutaj opisujemy szczegółową procedurę chirurgiczną mającą na celu wywołanie przeciążenia ciśnieniowego i przerostu serca u szczurów poprzez zwężenie aorty wstępującej za pomocą małego metalowego klipsa. Po znieczuleniu tchawica jest intubowana poprzez wprowadzenie kaniuli przez nacięcie w połowie wykonane między dwoma pierścieniami chrząstki tchawicy. Następnie wykonuje się nacięcie skóry na poziomie drugiej przestrzeni międzyżebrowej na lewej ścianie klatki piersiowej i oczyszcza warstwy mięśni w celu zlokalizowania wstępującej części aorty. Aorta wstępująca jest zwężana do 50–60% swojej pierwotnej średnicy poprzez zastosowanie małego tytanowego klipsa. Po zwężeniu aorty drugie i trzecie żebro są aproksymowane szwami prolenowymi. Kaniula tchawicy jest usuwana po przywróceniu spontanicznego oddychania. Zwierzę może dojść do siebie na poduszce grzewczej poprzez stopniowe obniżanie znieczulenia. Intensywność przeciążenia ciśnieniowego powstałego w wyniku zwężenia aorty wstępującej określa się poprzez rejestrację gradientu ciśnienia za pomocą dwuwymiarowej echokardiografii dopplerowskiej przez-klatki piersiowej. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten jest przydatny do badania zdarzeń przebudowy i właściwości kurczliwych serca podczas stopniowego początku i progresji od wyrównanego przerostu serca do etapu niewydolności serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe modele zwierzęce są najbardziej preferowanymi narzędziami do badania przewlekłych zmian w rozwoju przerostu mięśnia sercowego i jego progresji do niewydolności serca. Modele niewydolności serca metodami chirurgicznymi zostały pierwotnie opracowane na szczurach, ponieważ zwierzęta te są najbardziej odpowiednie do zabiegów chirurgicznych na otwartej klatce piersiowej, echokardiografii i oceny parametrów hemodynamicznych. Dostarczają również odpowiednie próbki pośmiertne do badań na poziomie tkankowym, komórkowym i molekularnym1. Zwężenie aorty wstępującej jest jednym z najczęstszych i najbardziej skutecznych modeli chirurgicznych powodujących przeciążeniową niewydolność serca 2,3. Model ten doskonale nadaje się do badania zdarzeń przebudowy komórkowej i subkomórkowej oraz właściwości kurczliwych serca podczas przejścia od hipertrofii do niewydolności serca4.

Główną zaletą tego modelu jest stopniowe narastanie przeciążenia ciśnienia na serce 5,6. Model ten jest klinicznie istotny ze względu na jego powolny, ale stały postęp od wyrównanego przerostu serca do fazy niewyrównanej, a ostatecznie do etapu niewydolności serca. Na czas progresji przerostu mięśnia sercowego do niewydolności serca i związanych z nim zmian fizjologicznych wpływa głównie stopień wytworzonego zwężenia7. Zwężenie aorty wstępującej można wykonać na dwa sposoby, albo za pomocą szwów, albo za pomocą metalowych klipsów 8,9. Główną zaletą stosowania metalowego klipsa do zwężenia aorty jest to, że zabiegi chirurgiczne są mniej skomplikowane. W tej metodzie należy zlokalizować aortę nadzastawkową wstępującą i założyć klips wokół aorty, aby uzyskać pożądany poziom zwężenia. W tej procedurze nie jest konieczny retraktor klatki piersiowej. Opaska aorty przez szycie wymaga więcej manipulacji chirurgicznych w celu umieszczenia igły miernika obok aorty wstępującej i zszycia wokół niej, aby uzyskać pożądany poziom zwężenia aorty. Ta ostatnia technika jest bardziej czasochłonna w porównaniu z użyciem metalowych klipsów do zwężenia aorty. Metoda opisana w tym filmie demonstruje procedurę chirurgiczną zwężenia aorty wstępującej u szczurów, która umożliwia stworzenie modelu przeciążonej ciśnieniem przerostu lewej komory.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt. Szczury Wistar były trzymane w 12-godzinnym cyklu od ciemnego do jasnego, w stałej temperaturze pokojowej (24 ± 2 °C) z jedzeniem i wodą ad libitum (zgodnie z wytycznymi CPCSEA).

1) Opieka przedoperacyjna i anestezjologia

  1. Szczura (około 200 g masy ciała) należy trzymać pod parasolem antybiotykowym 24 godziny przed zabiegiem, podając doustnie amoksycylinę (dawka: 500 mg/l wody).
  2. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (takie jak nożyczki, kleszcze, aplikator, igły do szycia i uchwyt igły) przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
  3. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia około 37 °C, aby uniknąć gwałtownego spadku tętna.
  4. Należy uważać, aby uniknąć odwodnienia zwierzęcia przed i w trakcie zabiegu.
  5. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej 3% izofluranem zmieszanym z 0,5-1,0 l/min 100% tlenu; utrzymać znieczulenie 1,5% izofluranem.
  6. Sprawdź odruch pedałowania, aby potwierdzić pomyślne znieczulenie.

2) Przygotowanie miejsca operacji

  1. Trzymaj szczura na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze w pozycji leżącej.
  2. Umieść gumową opaskę na przednich zębach szczura, aby utrzymać zwierzę w pozycji, jednocześnie utrzymując znieczulenie za pomocą stożka nosowego.
  3. Usuń sierść z dekoltu i lewej części klatki piersiowej szczura (najlepiej za pomocą golarki elektrycznej).
  4. Zdezynfekować miejsce operacyjne roztworem jodu powidonu, a następnie 70% alkoholem etylowym.
  5. Użyj sterylnej serwety, aby odsłonić tylko pole operacyjne podczas zabiegu operacyjnego.
    Uwaga: Jako dodatkową opcję w pielęgnacji zwierząt, 0,25% bupiwakainy ID (2,5 mg/kg) może być dodane przed nacięciem w każdym miejscu nacięcia w celu znieczulenia miejscowego/znieczulenia.

3) Intubacja tchawicy u szczura

  1. Wykonaj małe nacięcie na skórze równolegle do tchawicy za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego i ostrożnie oddziel leżącą pod spodem tkankę, aby odsłonić tchawicę.
  2. Załóż krawat z jedwabnej nici 4-0 pod tchawicę i delikatnie unieś krawat do góry.
  3. Wykonaj nacięcie w połowie odległości między dwoma pierścieniami chrząstki i włóż kaniulę tchawicy do tchawicy szczura.
  4. Podłącz kaniulę tchawicy do respiratora gryzoni, aby utrzymać częstość oddechów 50 oddechów/min, objętość oddechową 1,70 ml i czas wdechu 0,60 s (dla szczurów o masie ciała 200 g).

4) Zwężenie aorty wstępującej

  1. Po wyczuciu palcami położenia żeber wykonaj nacięcie skóry o długości około 2 cm na lewej ścianie klatki piersiowej między drugim a trzecim żebrem.
  2. Oddziel mięśnie międzyżebrowe warstwa po warstwie i wykonaj nacięcie o długości około 1,5 cm między drugim a trzecim żebrem. (Należy zachować ostrożność, aby uniknąć obrażeń płuc podczas wykonywania nacięcia między żebrami)
  3. Cofnij żebra i zlokalizuj wznoszącą się część aorty.
  4. Umieść mały tytanowy klips wokół wznoszącej się aorty za pomocą aplikatora, zwężając aortę do 50–60% pierwotnej średnicy.
  5. Po zwężeniu aorty przybliżyć drugie i trzecie żebro za pomocą 3,0 prolenu w przerywanym wzorze szwów. Jednocześnie należy wstrzymać pracę respiratora na około 2-4 sekundy w celu ponownego napełnienia płuc.
  6. Połącz warstwy mięśni szwami prolenowymi 3,0 i skórę szwami jedwabnymi 4,0 w przerywanym wzorze szwów. Do szycia skóry można użyć syntetycznych niewchłanialnych szwów zamiast jedwabiu.
  7. Usuń kaniulę tchawicy od szczura po przywróceniu spontanicznego oddychania.
  8. Zamknij otwór tchawicy szwami prolenowymi 3,0, a warstwę skóry szwami jedwabnymi 4,0.
  9. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej, stopniowo zmniejszając znieczulenie i oddychanie wspomagane respiratorem.
  10. U zwierząt kontrolnych pozorowanych w tym samym wieku należy wykonać tracheotomię i torakotomię bez zwężenia aorty wstępującej.

5) Opieka pooperacyjna

  1. Zdezynfekuj obszar operacyjny roztworem jodu powidonu.
  2. Jako znieczulenie pooperacyjne należy wstrzykiwać tramadol dootrzewnowo (10 mg/kg masy ciała/dobę) przez 1 tydzień.
  3. Sterylną sól fizjologiczną należy wstrzykiwać dootrzewnowo, jeśli po zabiegu pojawią się oznaki odwodnienia (około 1 ml).
  4. Amoksycylinę podawać doustnie, zmieszaną z wodą pitną, przez siedem dni (dawka: 500 mg/l wody).
  5. Usuń wszelkie pozostałe jedwabne szwy ze skóry po 10 dniach zabiegu w znieczuleniu wziewnym.

6) Potwierdzenie udanego zwężenia aorty wstępującej

  1. Wykonaj dwuwymiarową echokardiografię dopplerowską przez-klatkę piersiową, aby określić intensywność przeciążenia ciśnieniowego spowodowanego zwężeniem aorty wstępującej.
  2. Znieczulić szczury tydzień po operacji, jak opisano wcześniej (krok 1.5)
  3. Umieść przetwornik ultrasonograficzny w pozycji nadmostkowej, aby zarejestrować gradient ciśnienia w poprzek zwężonej części aorty wstępującej.
    Uwaga: Szczury z gradientem ciśnienia około 60 mm Hg w miejscu zwężenia aorty rozwiną poważny przerost serca około 8-10 tygodni po operacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych eksperymentach jesteśmy w stanie osiągnąć ponad 80% wskaźniki przeżycia. Skuteczność zwężenia aorty potwierdzono wykonując echokardiografię dopplerowską. Szczury (n = 6) z gradientem ciśnienia około 60 mm Hg w miejscu zwężenia aorty obserwowano przez 8 tygodni i uśmiercono w celu analizy rozwoju przerostu serca (ryc. 1). Po 8 tygodniach od operacji ocena echokardiograficzna wykazała istotny wzrost parametrów lewej komory, takich jak grubość przegrody międzykomorowej, grubość tylnej ściany lewej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka modeli chirurgicznych do indukcji przeciążenia ciśnieniem, a także przerostu serca i niewydolności serca. U małych zwierząt Lorell i współpracownicy opracowali model, który opisaliśmy tutaj i opisali występowanie wyrównanego przerostu mięśnia sercowego 8 tygodni po opasce aortalnej5. Zmiany w sercu stopniowo przechodzą w stan niewyrównany, a następnie prowadzą do niewydolności serca. Główną zaletą tego modelu jest stopniowy początek wzrostu ciśnienia w lewej komorze i tym samym zbliżony do sytua...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Departamentowi Biotechnologii Rządu Indii za wsparcie finansowe tego projektu. Ajith Kumar G S otrzymał stypendium naukowe od Rady Badań Naukowych i Przemysłowych rządu Indii, a Binil Raj otrzymał stypendium naukowe od Indyjskiej Rady Badań Medycznych rządu Indii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SzczuryUtrzymywane w ARF, RGCB
Systemy znieczulenia wziewnego VetEquipAB19276
Wentylator dla gryzoniCWE IncSAR- 830/AP 
Kaniula tchawicy szczuraCWE Inc13-21032
System ultrasonograficznyPhilipsHD7
Przetwornik ultradźwiękowyPhilipsS 12
Tytanowy klips (mały)Horizon1204
Aplikator klipsowyWeck137081
Golarka elektrycznaVinverthVBT0817
Ostrze BP (rozmiar: 11)ChirurgREF10111Przygotowanie pola operacyjnego
TramadolOrchidea opieka zdrowotnaOCH043
Chlorowodorek amoksycylinyRanbaxy
IsofluranePiramal opieka zdrowotnaA23M10A
StrzykawkiBD2015-09
4-0 pleciony jedwabDiament
3-0 proleneJohnson& JohnsonNW018
Taśma chirurgicznaRomsonsSH 6301
Povidone jodWin Medicare
Temp. kontrolowana poduszka grzewczaFlamingoHC1003
Wistar

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
  2. Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
  3. Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
  4. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  5. Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
  6. Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
  7. Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
  8. Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
  9. Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
  10. Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
  11. Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Procedura chirurgiczna u szczuraaplikacja klipsa tytanowegointubacja tchawicyechokardiografia Dopplerazbli enie eberrekonwalescencja pooperacyjnabadanie nad niewydolno ci serca

Powiązane artykuły