Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.
Artykuł metodologiczny
Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.
Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości na próbkach komórkowych poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego. Przedstawiono dwa podstawowe podejścia: nieinterferometryczną ilościową mikroskopię fazową (NIQPM) do wykonywania pomiarów całkowitej masy komórki i rozkładu gęstości subkomórkowej oraz mikroskopię kontrastową z interferencją różnicową Hilberta (HTDIC) do określania objętości. NIQPM opiera się na uproszczonym modelu rozchodzenia się fal, zwanym przybliżeniem paraosiowym, z trzema podstawowymi założeniami: niskim oświetleniem apertury numerycznej (NA), słabym rozpraszaniem i słabą absorpcją światła przez próbkę. Na szczęście niebarwione próbki komórkowe spełniają te założenia, a niskie oświetlenie NA można łatwo osiągnąć w komercyjnych mikroskopach. HTDIC służy do uzyskiwania informacji wolumetrycznych ze zobrazowań DIC w warunkach silnego oświetlenia NA. Wysokie oświetlenie NA umożliwia lepsze przekrojenie próbki wzdłuż osi optycznej. Przetwarzanie transformacji Hilberta na stosach obrazów DIC znacznie usprawnia algorytmy wykrywania krawędzi do lokalizacji granic próbki w trzech wymiarach, oddzielając wartości szarości intensywności próbki od wartości tła. Podstawowe zalety NIQPM i HTDIC polegały na ich dostępności technologicznej przy użyciu "dostępnych" mikroskopów. Istnieją dwa podstawowe ograniczenia tych metod: powolny czas akwizycji z-stack na komercyjnych zakresach obecnie znosi badanie zjawisk szybszych niż 1 klatka/minutę, a po drugie, efekty dyfrakcyjne ograniczają użyteczność NIQPM i HTDIC do obiektów o średnicy odpowiednio od 0,2 do 10 (NIQPM) i 20 (HTDIC) μm. W związku z tym próbka i związana z nią dynamika czasowa będąca przedmiotem zainteresowania muszą spełniać pewne ograniczenia rozmiarowe i czasowe, aby umożliwić zastosowanie tych metod. Co ciekawe, większość utrwalonych próbek komórkowych jest łatwo badana za pomocą tych metod.
Użycie mikroskopii optycznej jest obecnie wszechobecne w badaniu organizmów komórkowych. Ze względu na ich niską endogenną absorbancję i słabe właściwości rozpraszania w widzialnym widmie optycznym, komórki nie wpływają silnie na amplitudę przechodzących przez nie fal optycznych, a tym samym wydają się półprzezroczyste podczas obrazowania za pomocą standardowych mikroskopów jasnego pola. Próbki komórkowe spowalniają jednak fale optyczne przechodzące przez nie w sposób, który jest liniowo związany z ilością lokalnej gęstości masy w określonym obszarze przestrzeni, przez który przechodzi światło. Wykorzystanie tego heterogenicznego opóźnienia czasowego lub profilu "fazowego" fal optycznych przesyłanych przez mikroskopijne próbki zostało po raz pierwszy opisane w 1935 roku przez Fritsa Zernike'a 1 i eksperymentalnie zrealizowane przez Zernike'a w 1942roku. Za to osiągnięcie Zernike otrzymał Nagrodę Nobla w 1953 roku. Zeiss skomercjalizował tę modalność w 1945 roku3. W 1955 roku Smith i Nomarski przedstawili swoje wstępne prace nad zastosowaniem4 i teorią5 mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC), modalności, która wykorzystuje przestrzenny gradient fazy jako mechanizm kontrastu. DIC został skomercjalizowany przez firmę Zeiss w 1965 roku w ścisłej współpracy z Nomarski6. W 1981 r. dwa laboratoria zademonstrowały pierwsze zarejestrowane obrazy DIC na żywo z komórek po włączeniu kamer wideo do układu optycznego mikroskopu DIC 7,8. Narodziła się era obrazowania żywych komórek.
Od tego czasu wykonywanie zarówno kontrastu fazowego, jak i DIC w komercyjnych mikroskopach pozostało w dużej mierze niezmienione. Metody te są głównie wykorzystywane przez biologów do tworzenia obrazów komórek do celów jakościowych: monitorowania morfologii, śledzenia struktur subkomórkowych i badania dynamiki błon9. Techniki te są jakościowe w swojej "gotowej" konfiguracji, ponieważ zarówno obrazy fazowe, jak i DIC są arbitralnymi funkcjami natężenia źródła światła, ustawień optyki oświetlenia oraz ustawień wzmocnienia, gamma i ekspozycji kamery CCD.
Mały legion fizyków i inżynierów optycznych starał się, aby komercyjne metody obrazowania były ilościowe. Jednym z pierwszych wysiłków były dwa listy do Nature z 1952 i 1953 roku, w których lekarz, który stał się biofizykiem, Robert Barer, zademonstrował zastosowanie mikroskopii fazowej do określenia suchej masy komórkowej komórek poprzez oszacowanie przesunięć fazowych przez te typy komórek za pomocą komercyjnie dostępnego mikroskopu fazowego10,11. W ciągu następnych lat w tej dziedzinie opracowano wiele technik opartych na trzech podstawowych mechanizmach kontrastu bez znaczników: mikroskopia fazowa10,11, mikroskopia DIC12-17 i jasne pole18-22 w celu określenia długości ścieżki optycznej, fazy, gęstości masy, indeksu załamania światła i objętości komórkowej.
Równolegle, od lat 50. rozwijana jest również duża kolekcja niestandardowych instrumentów optycznych, które dokonały daleko idących pomiarów optycznych, począwszy od zastosowań w rozwoju pasożytów23, poprzez dokumentowanie cyklu komórkowego24, aż po badanie dynamiki błony czerwonych krwinek25. W szczególności, ostatnie dziesięć lat przyniosło obfitość bezznacznikowej mikroskopii ilościowej w postaci mikroskopii fazy dyfrakcyjnej26, tomograficzna mikroskopia fazowa27, cyfrowa mikroskopia holograficzna28, fazowa optyczna mikroskopia koherentna29, przestrzenna mikroskopia interferencyjnaświatła 30, mikroskopia fazowa Hilberta31 i ilościowa mikroskopia fazowa32. Pomimo ich zbiorowych sukcesów, instrumenty te nie zostały rozpowszechnione wśród szerszego grona badaczy biologii, głównie ze względu na ich złożone oprzyrządowanie i wymagania obliczeniowe.
Tutaj opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości na próbkach komórkowych poprzez kombinację jasnego pola i obrazów DIC. Przedstawiono dwa podstawowe podejścia: nieinterferometryczną ilościową mikroskopię fazową (NIQPM) do wykonywania pomiarów całkowitej masy komórki i rozkładu gęstości subkomórkowej oraz mikroskopię kontrastową z różnicową interferencją Hilberta (HTDIC) do określania objętości. Podstawowe zalety NIQPM i HTDIC polegały na ich dostępności technologicznej. Warunki obrazowania wymagane do ich pomyślnego wykonania mieszczą się w zakresie normalnej pracy większości dostępnych na rynku mikroskopów. Ponadto algorytmy przetwarzania końcowego są stabilne, szybkie i niezawodne - zostały zaimplementowane w MATLAB przy użyciu algorytmów opartych na szybkiej transformacji Fouriera (FFT), gdy tylko jest to możliwe.
NIQPM to metoda rekonstrukcji fazy i osiowo zintegrowanej gęstości masy próbek komórkowych na podstawie obrazów jasnego pola. Zsumowanie tej osiowo zintegrowanej gęstości masy na powierzchni próbki daje całkowitą zawartość suchej masy próbki. Protokół NIQPM opiera się na podstawach eksperymentalnych położonych przez Paganina i Nugenta 18,19 – w których wykazano, że profil fazowy komórki można zrekonstruować na podstawie obrazów jasnego pola próbki za pomocą ogniskowania – oraz pracach teoretycznych Franka, Altmeyera i Wernickego20 – na rozwiązywaniu modeli fal przyosiowych w efektywny sposób oparty na FFT. Związek fazy z gęstością suchej masy opiera się na pracy Barera 10,11 i Popescu 33.
Informacje wolumetryczne można uzyskać z obrazowania DIC przez ognisko w warunkach wysokiego oświetlenia NA, które umożliwiają optyczne przecięcie próbki wzdłuż osi optycznej. Przetwarzanie transformacji Hilberta na stosach obrazów DIC znacznie usprawnia algorytmy wykrywania krawędzi do lokalizacji granic próbki w trzech wymiarach, oddzielając wartości szarości intensywności próbki od wartości tła. Praca ta pochodzi od Arinsona i wsp. 34 Chociaż wprowadziliśmy zarówno metody filtrowania Fouriera w celu zwiększenia kontrastu, jak i metodę wykrywania krawędzi opartą na Sobelu do automatycznej analizy wolumetrycznej próbki. Wcześniej przeprowadziliśmy również walidację HTDIC na kulkach polistyrenowych o rozmiarach od granicy dyfrakcji do 20 μm o średnicy36.
Chociaż zarówno NIQPM, jak i HTDIC są technologicznie dostępne dzięki ich rozwojowi na komercyjnych mikroskopach, metody te są zasadniczo ograniczone przez konfigurację sprzętową samych mikroskopów. Podstawowe ograniczenia tych technik są dwojakie: powolny czas akwizycji z-stack na zakresach komercyjnych, ze względu na translację całego etapu próbki, a nie tylko soczewki obiektywu, obecnie ogranicza badanie zjawisk szybszych niż około 1 klatka na minutę, a po drugie, efekty dyfrakcyjne ograniczają użyteczność NIQPM i HTDIC do obiektów o rozmiarach od 0,2 do 10 i 20 μm średnicy, odpowiednio. W związku z tym próbka i związana z nią dynamika czasowa muszą spełniać pewne ograniczenia rozmiarowe i czasowe, aby umożliwić zastosowanie tych metod na typowych instrumentach "z półki". Co ciekawe, większość utrwalonych próbek komórkowych jest łatwo badana za pomocą tych metod.
Przegląd protokołów NIQPM i HTDIC znajduje się na rysunku 1. Na rysunku 2 ilustrujemy optymalne i nieoptymalne obrazowanie przez ogniskową zarówno w warunkach słabego, jak i wysokiego oświetlenia NA, zarówno dla obrazów jasnego pola, jak i DIC. Rysunki 3 i 4 pokazują zależność od parametrów algorytmu NIQPM, podkreślając udane i nieudane implementacje. Rysunek 5 ilustruje etapy procesu przetwarzania obrazu HTDIC i demonstruje optymalną implementację algorytmu do określania objętości komórkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Specyfikacja mikroskopu
Aby prawidłowo przeprowadzić obrazowanie, mikroskop powinien mieć następujące specyfikacje:
2. Akwizycja różnicowego kontrastu zakłóceń (DIC) Z-stack
3. Akwizycja stosu Z jasnym polem (BF)
4. Eksportowanie obrazów Z-stack
5. Pomiary objętości
6. Pomiary masy
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Prawidłowe oświetlenie próbki podczas akwizycji obrazu przez ostrość jest kluczowe dla pomyślnej implementacji algorytmówNIQPM i HTDIC. Na rysunku 2 ilustrujemy słabe i wysokie oświetlenie NA zarówno przy DIC jak i kontraście jasnego pola dla kuli polistyrenowej i ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka jelita grubego SW620. Rysunki 2A, 2C, 2I i 2K pokazują optymalne obrazowanie dla NIQPM. Rysunki 2F, 2H, 2N i 2P pokazu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ogólnie rzecz biorąc, NIQPM jest techniką ograniczoną dyfrakcją, zwalidowaną na długościach ścieżek optycznych w zakresie od 0,25 do 44,7. Walidację przeprowadzono na kulkach polistyrenowych n = 1,596 o średnicy od 0,11 do 9,8 μm zawieszonych w Fluoromount G (dane nie pokazane). Komórki mają długości ścieżek optycznych, które wahają się od prawie 0 do 7.
Podczas pomiaru rozkładu gęstości próbki może się okazać, że obraz pseudo DIC wygląda dobrze, podczas gdy mapa gęstości zawiera niepożądane w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych w prezentowanej pracy.
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (U54CA143906 dla K.G.P., O.J.T.M. i R01HL101972 dla O.J.T.M.) oraz Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (K.G.P.). O.J.T.M. jest badaczem ustanowionym przez American Heart Association (13EIA12630000). Dziękujemy dr Ericowi Andersonowi z Knight Cancer Institute za przygotowanie próbek komórek wykorzystywanych w tej pracy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop Zeiss Axio Imager 2 | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy | Mikroskop Axio Imager D2 | |
| Zielony filtr (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Zielony filtr |
| Oprogramowanie SlideBook 5.5 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Kolorado | Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów | |
| Polistyren mikrosfery | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Kule polistyrenowe |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Nośniki montażowe |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie