Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Podsumowanie

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium

rozwojowym.

Streszczenie

Obrazowanie na żywo jest ważną techniką do badania procesów biologicznych komórek, jednak może to być trudne u żywych zwierząt. Półprzezroczysty naskórek larwy Drosophila sprawia, że jest ona atrakcyjnym organizmem modelowym do badań obrazowych na żywo. Jednak ważnym wyzwaniem dla technik obrazowania na żywo jest nieinwazyjne unieruchomienie i ustawienie zwierzęcia pod mikroskopem. Protokół ten przedstawia prostą i łatwą w użyciu metodę unieruchamiania i obrazowania larw Drosophila na urządzeniu mikroprzepływowym z polidimetylosiloksanu (PDMS), które nazywamy "chipem larwowym". Chip larwy składa się z dobrze dopasowanej mikrokomory PDMS, która jest przymocowana do cienkiego szklanego szkiełka nakrywkowego, które po zastosowaniu próżni za pomocą strzykawki unieruchamia zwierzę i zbliża struktury brzuszne, takie jak rdzeń nerwowy, nerwy segmentowe i mięśnie ściany ciała, w bliską odległość od szkiełka nakrywkowego. Pozwala to na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, a co ważne, pozwala uniknąć stosowania środków znieczulających i chemicznych, co ułatwia badanie szerokiego zakresu procesów fizjologicznych. Ponieważ larwy łatwo wracają do zdrowia po unieruchomieniu, można je łatwo poddać wielokrotnym sesjom obrazowania. Pozwala to na prowadzenie badań podłużnych w czasie w czasie w zakresie od godzin do dni. Protokół ten opisuje krok po kroku, jak przygotować chip i jak wykorzystać go do obrazowania na żywo zdarzeń neuronalnych u larw w 3^. stadium rozwojowym. Zdarzenia te obejmują szybki transport organelli w aksonach, reakcje wapnia na uszkodzenia oraz badania poklatkowe transportu białek konwertowalnych na duże odległości i w różnych skalach czasowych. Innym zastosowaniem chipa jest badanie regeneracyjnych i zwyrodnieniowych reakcji na uszkodzenie aksonów, dlatego druga część tego protokołu opisuje nową i prostą procedurę uszkadzania aksonów w nerwach obwodowych przez zmiażdżenie nerwu segmentowego.

Wprowadzenie

Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, była wykorzystywana jako organizm modelowy przez ponad 100 lat i okazała się pomocna w definiowaniu podstawowych szlaków sygnałowych i rozwojowych, które są zachowane od bezkręgowców do człowieka. Obrazowanie na żywo jest ważnym podejściem do badania mechanizmów komórkowych, a prosty plan ciała i półprzezroczysty naskórek larwy Drosophila sprawiają, że jest to atrakcyjny system do obrazowania na żywo, zwłaszcza że dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek w określonych typach komórek.

Ważnym wyzwaniem dla technik obrazowania na żywo jest nieinwazyjne unieruchomienie i ustawienie zwierzęcia do mikroskopii. Konwencjonalne metody unieruchomienia obejmują sekcję^1,2 lub użycie chloroformu, które zabijają zwierzę. Zastosowano również środki znieczulające eter⁴ i izofluoran^5-8. Chociaż środki znieczulające mają wiele zalet, hamują również aktywność neuronalną i ważną fizjologię (w tym bicie serca)^9-11, a zatem mogą wpływać na badany proces i powodować stres u zwierzęcia. Istnieją również obawy dotyczące bezpieczeństwa ludzi podczas pracy z eterem i izofluoranem.

Opracowaliśmy metodę unieruchamiania larw Drosophila bez użycia leków w jednowarstwowym urządzeniu mikroprzepływowym PDMS, które nazywamy 'chipem larwowym'12. Ten protokół opisuje, jak uzyskać lub zrobić chip larwy i jak go wykorzystać do obrazowania na żywo u larw we wczesnym stadium 3^stadium rozwojowym. Chip składa się z dobrze dopasowanej mikrokomory, która po zastosowaniu podciśnienia za pomocą strzykawki unieruchamia zwierzę za pomocą delikatnej siły mechanicznej. Metoda unieruchomienia sprawia, że struktury brzuszne, takie jak rdzeń nerwowy, nerwy segmentowe i mięśnie ścian ciała, znajdują się w bliskim sąsiedztwie szklanego szkiełka nakrywkowego. Pozwala to na obrazowanie takich struktur w wysokiej rozdzielczości przy obiektywach o dużej aperturze numerycznej (dużym powiększeniu).

Zalety chipa larwowego w porównaniu z innymi konwencjonalnymi technikami obejmują: (i) Użycie chipa larwowego zastępuje użycie chemikaliów, umożliwiając obrazowanie in vivo nieznieczulonych zwierząt. (ii) Larwy regenerują się natychmiast po uwolnieniu z chipa (w przeciwieństwie do 2-godzinnego okresu rekonwalescencji w przypadku izofluoranu^8,13). Pozwala to na obrazowanie w szerokich skalach czasowych, od milisekund przez minuty, po godziny i dni. (iii) Zastosowanie PDMS, który jest materiałem przepuszczalnym dla gazów, umożliwia ciągłą dyfuzję tlenu/powietrza z otoczenia do ciała larwy. (iv) Czip jest łatwy i bezpieczny w użyciu oraz (v) nadaje się do wielokrotnego użytku i może być wyprodukowany przy minimalnych kosztach.

Oprócz instrukcji korzystania z chipa larwowego, ten protokół dostarczy kilka przykładów jego użycia do badania zdarzeń neuronalnych u larw w 3^. stadium rozwojowym. Obejmują one obrazowanie na żywo transportu aksonalnego, reakcji wapnia na uraz oraz badania poklatkowe transportu białek konwertowalnych na duże odległości i w skalach czasowych.

Innym zastosowaniem chipa jest badanie reakcji neuronów na uszkodzenie aksonów. W tym celu opisano dodatkową procedurę (w części 3) w celu uszkodzenia aksonów w nerwach obwodowych przez zmiażdżenie nerwu segmentowego. Ten prosty test można przeprowadzić zarówno szybko, jak i powtarzalnie pod standardowym stereomikroskopem preparacyjnym, co pozwala na przetwarzanie wielu zwierząt w tym samym czasie. Reakcje komórkowe na uraz można badać za pomocą obrazowania na żywo w chipie larwy.

Protokół

1. Tworzenie układu PDMS

Aby utworzyć chip PDMS z formy SU-8, wykonaj kroki 1.1-1.7. Jeśli chip jest pod ręką, ale musi zostać zmontowany do użycia, przejdź do kroku 1.8.

1. Wymieszaj 45 g bazy PDMS i 4,5 g utwardzacza (w proporcji 10:1) z zestawu PDMS w małym jednorazowym plastikowym pojemniku i dokładnie wymieszaj je za pomocą plastikowego patyczka.
2. Umieść pojemnik w pojemniku próżniowym (np. eksykatorze) na 10 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
3. Umieść formę SU-8 na dnie plastikowego naczynia o średnicy 150 mm i powoli wlej mieszaninę PDMS na formę. Uważaj, aby nie generować bąbelków podczas nalewania PDMS.
4. Utwardzać PDMS w piecu (lub inkubatorze) w temperaturze 650 °C przez 4 godziny.
5. Wyjmij utwardzoną formę PDMS/SU-8 z piekarnika i pozwól jej ostygnąć przez kilka minut.
6. Za pomocą żyletki przetnij utwardzony PDMS wzdłuż krawędzi formy SU-8 i odłącz ją od formy SU-8.
7. Podziel płytę PDMS na pojedyncze chipy PDMS za pomocą żyletki.
8. Za pomocą igły dozującej 21 G przebij otwór w porcie próżniowym (przedstawionym na rysunku 1A) chipa PDMS.
9. Weź igłę dozującą o pojemności 23 G i kilkakrotnie przekręć końcówkę igły od podstawy, aby oderwać końcówkę igły od piasty zamka.
10. Włóż końcówkę igły 23 G do małego kawałka rurki z polietylenu tak, aby rurka zakrywała co najmniej milimetr igły. Następnie użyj żyletki, aby odciąć nadmiar rurki od igły. W ten sposób powstaje plastikowy pierścień wokół jednego końca igły, który po włożeniu do portu wlotu podciśnienia utworzy uszczelnienie.
11. Do użytku z mikroskopem odwróconym (rysunki 1B i 2A-B): włożyć końcówkę igły 23 G do otworu w porcie próżniowym. Do użytku z mikroskopem pionowym (rysunki 1C i 2C-D): przebić drugi otwór z boku chipa PDMS igłą dozującą 21 G; Ten otwór zapewni dostęp do pierwszego otworu z boku. Następnie włożyć końcówkę igły 23 G z pierścieniem rurki do bocznego otworu. Umieść kawałek taśmy dwustronnej na górze chipa PDMS, aby uszczelnić górny otwór (Rysunek 1C).
12. Weź kawałek rurki polietylenowej o długości około 20 cm. Podłącz jedną stronę rurki do końcówki igły, która jest włożona do portu próżniowego.
13. Podłącz drugą stronę rurki do jednego z portów zaworu 3-drogowego (patrz "Kran 3-drogowy" na liście materiałów)
14. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do jednego z dwóch pozostałych portów. Ostatni port jest otwarty dla środowiska.

2. Używanie chipa larwy do obrazowania na żywo

1. Wyczyść chip PDMS przezroczystą taśmą klejącą. Przymocuj kawałek taśmy do dolnej części chipa. Upewnij się, że taśma dotyka całej powierzchni PDMS, a następnie odklej taśmę.
2. Powtórz powyższy krok 2-3 razy, aby upewnić się, że na powierzchni chipa PDMS nie ma cząstek ani oleju (zachowanych z poprzednich eksperymentów). Ponieważ chip PDMS jest wielokrotnego użytku, bardzo ważne jest usunięcie pozostałości oleju, ponieważ może to wpłynąć na przyczepność PDMS do szkła i spowodować nieodpowiednie uszczelnienie.
3. Przenieś wczesne (tj. żerujące) larwy 3. stadium rozwojowe na szalkę Petriego zawierającą wodę. (Larwy żerujące w 3.^stadium rozwojowym znajdują się w pożywieniu, a nie z boku fiolki z kulturą). Kąp larwy w wodzie, aby usunąć pożywkę hodowlaną.
4. Weź czyste szklane szkiełko nakrywkowe i umieść małą kroplę oleju Halocarbon 700 na jego środku.
5. Za pomocą kleszczy delikatnie podnieś z wody czystą, wcześnie wyhodowaną larwę w trzecim stadium rozwojowym (larwa powinna mieć ~3,5-4 mm długości). Połóż zwierzę na krótko na lekkiej chusteczce lub ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar wody, a następnie umieść je na kropli oleju. Kropla powinna być na tyle mała, aby tchawica larw nie była pokryta. Pozwól larwie pozostać na kropli oleju przez 10 sekund.
6. Usuń larwę z kropli oleju, a następnie umieść ją na czystym szklanym szkiełku nakrywkowym.
7. Przenieś larwę na inne czyste szklane szkiełko nakrywkowe. Ten krok usuwa nadmiar oleju.
8. Zwróć uwagę na orientację larwy. W celu zobrazowania rdzenia nerwowego i nerwów segmentowych, brzuszna strona larwy powinna znajdować się na szkiełku nakrywkowym. Jego grzbietowa strona, charakteryzująca się dwoma podłużnymi rurkami tchawiczy, powinna być skierowana do góry. Uwaga: jest to orientacja, którą larwa preferuje naturalnie.
9. Delikatnie umieść chip PDMS na larwie. Larwa powinna być ustawiona w środkowej części mikrokomory, z ogonem skierowanym w stronę portu próżniowego. Uważaj, aby larwa nie dotykała krawędzi komory. Jest to szczególnie ważne w przypadku przednich i tylnych zakończeń tchawicy. Uwaga: ten krok najlepiej wykonać pod mikroskopem stereoskopowym.
10. Dociśnij chip PDMS do szklanego szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Upewnij się, że larwa jest całkowicie zamknięta w mikrokomorze, gdy chip PDMS dotyka szklanego szkiełka nakrywkowego.
11. Włączyć zawór 3-drogowy w taki sposób, aby strzykawka mogła pobierać powietrze z mikrokomory PDMS (przez rurkę) w celu wytworzenia podciśnienia.
12. Jedną ręką mocno chwyć chip/szklane szkiełko nakrywkowe PDMS. Drugą ręką pociągnąć za tłok strzykawki. Pobrać 2-2,5 ml powietrza, aż do wyczucia oporu w uchwycie strzykawki, aby wytworzyć podciśnienie. Próżnia zapewnia szczelne uszczelnienie między interfejsami chipa PDMS, oleju i szkiełka nakrywkowego oraz ogranicza ruchliwość larwy.
13. Wyłączyć zawór w taki sposób, aby chip PDMS był odizolowany od strzykawki i od otoczenia. W rezultacie, w mikrokomorze utrzymywany jest względnie stabilny poziom podciśnienia bez konieczności trzymania tłoka strzykawki.
14. Sprawdź larwę pod stereoskopem, aby upewnić się, że całe ciało zwierzęcia jest umieszczone w mikrokomorze i że zwierzę jest nieruchome. Tchawica powinna być widoczna. Reszta chipa PDMS powinna stykać się ze szkiełkiem nakrywkowym. Uwaga: Na rysunkach 2E i 2F przedstawiono przykłady zwierząt prawidłowo unieruchomionych w chipie. Niektóre nieprawidłowe orientacje są pokazane na rysunkach 2G i 2H.
15. Umieść chip larwy (chip PDMS + szklane szkiełko nakrywkowe) na mikroskopie. Z chipem larwy, rurką i strzykawką należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć oderwania się chipa PDMS od szkiełka nakrywkowego. W przypadku mikroskopu pionowego przymocuj "górną" stronę chipa do stolika mikroskopu za pomocą taśmy dwustronnej (Rysunek 1C).
16. Użyj obiektywu o dużym powiększeniu (zalecane jest zanurzenie w olejku, 40-63X), aby zlokalizować interesujące zwierzę i wykonać obrazowanie. W niektórych przypadkach może być potrzebne mniejsze powiększenie, aby zidentyfikować żądany obszar do obrazowania przed przełączeniem na większe powiększenie.
17. Po zakończeniu obrazowania zwolnij podciśnienie, przełączając zawór w pozycję otwartą na otoczenie.
18. Odłącz chip PDMS od szkiełka nakrywkowego. Larwa powinna być natychmiast ruchliwa.
19. Użyj kleszczy, aby usunąć larwę z mikrokomory i delikatnie umieść larwę na talerzu z sokiem winogronowym w celu odzyskania.

3. Wywoływanie uszkodzenia nerwów segmentowych larw

1. Wykonaj krok 2.3 powyżej, aby wyizolować wcześnie stadiowane larwy w trzecim stadium rozwojowym o pożądanym genotypie. Jak opisano w kroku 2.3, wykąp larwy w wodzie, aby usunąć pokarm.
2. Użyj standardowej stacji anestezjologicznej CO₂ much, z podkładką CO₂ przechowywaną pod stereomikroskopem preparacyjnym, aby ujarzmić larwy. Larwy powinny stać się nieruchome po umieszczeniu na podkładce CO₂ na 1-2 min.
3. Teraz umieść pojedynczą znieczuloną larwę na talerzu z sokiem winogronowym pod mikroskopem stereoskopowym. Odwróć brzuszną stronę zwierzęcia do góry, aby uwidocznić brzuszny rdzeń nerwowy i nerwy segmentowe przez naskórek (ryc. 3). Upewnij się, że larwa jest całkowicie nieruchoma.
4. Za pomocą kleszczyków Dumostar numer 5 mocno ściśnij nerwy segmentowe przez naskórek przez 5-10 sekund. Gdy zostanie to wykonane prawidłowo, naskórek pozostaje nienaruszony, a ściana ciała nie jest przekłuwana. Uwaga: Uraz może być prowadzony w różnych pozycjach wzdłuż przednio-tylnej osi ciała, o ile brzuszny rdzeń nerwowy, gruczoły ślinowe i jelita nie są uszkodzone. Najbardziej efektywna lokalizacja urazu znajduje się pod koniec 3.^{segmentu brzucha}, jak pokazano na rysunku 3D. Uraz w tym miejscu uszkadza najwięcej nerwów i jest najłatwiejszy do odtworzenia bez zabijania zwierzęcia.
5. Po urazie obróć zwierzę tak, aby jego brzuszną stroną do dołu leżało na talerzu winogronowym. Powinien być w stanie poruszać głową i jeść. Jeśli uraz się powiódł, tylna połowa larwy zostanie sparaliżowana.
6. Trzymać zranione zwierzęta na talerzu z sokiem winogronowym w temperaturze 25 °C przez żądany czas, zgodnie z celem doświadczenia. W przypadku motoneuronów kikut proksymalny zaczyna kiełkować w ciągu 8-10 godzin od urazu¹⁴, a kikut dystalny zaczyna się degenerować w ciągu 6-8 godzin¹⁵. W przypadku neuronów czuciowych klasy IV da kikut proksymalny zaczyna kiełkować w ciągu 4-6 godzin, a kikut dystalny zaczyna się degenerować w ciągu 3-4 godzin po urazie. Uwaga: przy odpowiednich sterownikach Gal4 i reporterach fluorescencyjnych można zaobserwować kiełkowanie i degenerację w chipie larwy (na przykład patrz rysunek 6).

Wyniki

Chip larwy składa się z jednowarstwowego bloku PDMS (chipa PDMS), którego konstrukcja jest opisana na schemacie na rysunku 1. (Zobacz również dodatkowy plik DXF do projektowania własnej formy). Mikrokomora larw, port próżniowy i kanały graniczne (rysunek 1A) to wgłębienia o wielkości 140 μm w chipie PDMS. Chip umieszcza się na wcześnie wyhodowanej larwie w trzecim stadium rozwojowym, która spoczywa na szkiełku nakrywkowym z olejem (ryc. 1B i 1C). Interfejs olejowo-szklany między szkiełkiem nakrywkowym a chipem PDMS pozwala na utworzenie uszczelnienia po zastosowaniu łagodnej próżni. Ta foka więzi larwy w komorze, a ponieważ wcześnie stadia larwy w trzecim stadium rozwojowym jest nieco grubsza niż komora, uszczelnienie komory powoduje pewne fizyczne zwężenie zwierzęcia, skutecznie unieruchamiając i ograniczając jego ruch. W tym stanie unieruchomienia niektóre brzuszne struktury ciała, takie jak brzuszny rdzeń nerwowy i segmentowy, są popychane w pobliże szkiełka nakrywkowego. Jest to korzystne dla obrazowania, ponieważ w stanie unieruchomionym struktury te mogą leżeć w odległości roboczej obiektywów 40X i 63X. Po uwolnieniu próżni larwę można łatwo usunąć z mikrokomory, co pozwala na przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów. To czysto mechaniczne podejście do unieruchomienia może utrzymać przy życiu 90% larw po ciągłych okresach unieruchomienia trwających do 1 godziny¹².

Próżnia jest wytwarzana przez prostą strzykawkę o pojemności 20 ml, stąd całe urządzenie jest łatwe do przetransportowania z mikroskopu stereoskopowego, gdzie odbywa się pozycjonowanie w komorze, do mikroskopu konfokalnego lub epifluorescencyjnego, gdzie wykonywane jest obrazowanie na żywo. Strzykawkę podłącza się do portu próżniowego za pomocą rurki polietylenowej i igieł dozujących 23 G (z usuniętymi piastami blokującymi), jak opisano w krokach 1.6-1.14. W przypadku mikroskopów odwróconych rurka i strzykawka są połączone za pomocą górnej części chipa (rysunki 1B, 2A i 2B). W przypadku mikroskopów pionowych są one podłączane przez port z boku chipa (rysunki 1C, 2C i 2D). Konfiguracja dla mikroskopów odwróconych jest nieco łatwiejsza w użyciu. Strzykawka jest ciągnięta w celu wytworzenia delikatnego podciśnienia (około 10 psi), które wiąże granicę faz olej-szkło-PDMS, tworząc szczelne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a urządzeniem PDMS, zatrzymując i unieruchamiając larwę w komorze.

Umieszczenie larwy w mikrokomorze (kroki 2.7-2.10 w protokole) jest kluczowe dla skutecznego unieruchomienia i przeżycia (Rysunki 2E-H). Jeśli zwierzę jest zbyt duże w stosunku do komory (ryc. 2G) lub jeśli jego głowa lub tchawica zostaną uwięzione między krawędzią komory a szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1H), jest mało prawdopodobne, aby przeżyło procedurę.

Poniżej znajduje się kilka przykładów użycia chipa larwalnego do badania różnych reakcji komórkowych w neuronach (Ryc. 4-7, Film S1 i Film S2).

Obrazowanie szybkiego transportu aksonalnego: Chip larwy został użyty do zobrazowania transportu pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem kinezyny w obrębie poszczególnych aksonów obwodowych (Rysunek 4 i Film S1). Ruch następczy (~1,0 μm/s) i wsteczny (~0,8 μm/s) tych pęcherzyków można łatwo zbadać na podstawie filmów zebranych pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem.

Ustawianie zwierzęcia do mikrochirurgii laserowej: Dendryt neuronu czuciowego został przecięty za pomocą pulsacyjnego lasera barwnikowego UV (Rysunek 5 i Film S2). Protokoły stosowania tej metody w mikrochirurgii można znaleźć gdzie^{indziej 16,17}. Skuteczna technika immobilizacji pozwala na wykrycie i zmierzenie szybkich zmian w uszkodzonym neuronie w skali czasu, takich jak zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia (wykrywane przez genetycznie kodowany wskaźnik Ca^{2 +} GCamp3.0¹⁸) (ryc. 5).

Badanie regeneracyjnych i zwyrodnieniowych reakcji na uraz: Jeśli zwierzęciu pozwoli się odpocząć między sesjami obrazowania, chip larwy zostanie wykorzystany do badania zdarzeń komórkowych, które występują w szerokim zakresie skal czasowych. Na przykład zarówno "regeneracyjne", jak i zwyrodnieniowe reakcje na uszkodzenie aksonów, które zachodzą w skali 15 godzin, można zobrazować w chipie larwy (ryc. 6). W tym przykładzie aksony oktopaminergicznych neuronów ruchowych zostały uszkodzone przez segmentowe zmiażdżenie nerwu (ryc. 3), opisane w części 3 protokołu. Kikut aksonu proksymalnego, który ulega nowemu kiełkowaniu, oraz aksony dystalne, które tworzą żylaki, a następnie ulegają fragmentacji w procesie zwyrodnienia Wallera, można obrazować i badać w różnych odstępach czasu po urazie.

Śledzenie fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych w czasie in vivo: Rozwój fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych, których fluorescencja zmienia się nieodwracalnie po ekspozycji na światło UV) pozwala na specyficzne znakowanie podzbioru białek w komórce i śledzenie losu znakowanych białek w czasie^19,20. Technika ta jest najczęściej przeprowadzana w hodowli komórkowej, jednak za pomocą chipa larwy można śledzić genetycznie kodowane białka fotokonwertowalne w określonych komórkach in vivo. Jako przykład pokazujemy, że białko fuzyjne Denda2-α-tubuliny, wyrażane w neuronach czuciowych klasy IV da, może być fotokonwertowane w ciałach komórkowych (ryc. 7A i 7B). Transport fotoprzekształconych białek można następnie śledzić w czasie: w ciągu dwóch dni możemy wykryć znaczną ilość fotoprzekształconego białka w zakończeniach aksonów neuronów czuciowych, które leżą ~ 1 mm od pierwotnego miejsca w ciele komórki (ryc. 7A i 7C).

Wszystkie opisane przykłady (Rysunki 4-7 oraz Filmy S1 i S2) zostały zobrazowane za pomocą systemu konfokalnego z wirującym dyskiem, składającego się ze skanera Nipkow CSU10 i kamery C9100-50 EMCCD, zamontowanego na Axio Observer z obiektywem olejowym 63X (1.5 NA) i sterowanego za pomocą oprogramowania do akwizycji Volocity.

Rysunek 1. Schematyczne kreskówki do korzystania z chipa larwy.
(A) Chip larwy składa się z chipa PDMS, oznaczonego kolorem jasnoniebieskim, przyklejonego do szkiełka nakrywkowego. Chip zawiera kanały mikroprzepływowe o grubości 140 μm, oznaczone kolorem białym. Centralna mikrokomora została zaprojektowana tak, aby ściśle pasowała do wczesnej larwy Drosophila w 3^. stadium rozwojowym (w kreskówce w kolorze jasnozielonym). Plik DXF zawierający dokładne wymiary, które można wykorzystać do zaprojektowania formy, jest dostarczany jako dane uzupełniające. Podziałka = 1,5 mm. (B-C) Widoki z boku schematów ładowania larwy do chipa larwy. Larwa siedzi brzusznie do dołu na szkiełku nakrywkowym, a jej ciało leży w mikrokomorze o głębokości 140 μm. Strzykawka o pojemności 20 ml jest podłączona do portu wlotu podciśnienia i służy do wywoływania delikatnego podciśnienia. Granica faz olej halowęglowy-PDMS-szkło jest wiązana przez próżnię w szczelne uszczelnienie, które ogranicza larwę w mikrokomorze. Uszczelnienie to można łatwo odwrócić poprzez zwolnienie nacisku ze strzykawki, po czym zwierzę natychmiast odzyskuje ruchliwość. W przypadku mikroskopów pionowych (B) próżnia strzykawki jest podłączona za pomocą rurki z polietylenu-50 od góry chipa. W przypadku mikroskopów odwróconych (C) połączenia te są wykonywane od strony chipa, podczas gdy "góra" chipa jest przymocowana do stolika mikroskopu za pomocą taśmy dwustronnej.

Rysunek 2. Obrazy chipów PDMS i prawidłowe ustawienie larwy.
(A-D). Fotografie przedstawiające chipy PDMS do mikroskopów odwróconych i pionowych. Końcówka igły dozującej 23 G została włożona do portu próżniowego, co umożliwia podłączenie za pomocą rurki do odkurzacza (strzykawki). Podziałka = 1,5 mm. (E-H). Obrazy w jasnym polu unieruchomionych larw Drosophila. E i F pokazują przykłady prawidłowo unieruchomionych zwierząt. Mniejsze zwierzę w F jest preferowane, jeśli zostanie przeprowadzonych wiele obrazów w długich skalach czasowych (>12 godzin). G pokazuje zwierzę, które jest zbyt duże, a H pokazuje małe zwierzę, które jest nieprawidłowo ustawione. Podziałka = 1,5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 3. Uszkodzenie nerwów segmentowych u larw Drosophila.
(A) Karykatura testu zmiażdżenia nerwu. Nerwy segmentowe w larwie w 3.^stadium rozwojowym są miażdżone przez ściskanie naskórka brzusznego kleszczami numer 5. (B) Widok larwalnego układu nerwowego zwierzęcia poddanego sekcji zwłok 20 godzin po zmiażdżeniu nerwu. Barwienie immunologiczne błon neuronalnych za pomocą przeciwciał anty-HRP (kolor czerwony) uwydatnia płaty mózgu, brzuszny rdzeń nerwowy i długie nerwy segmentowe, które zawierają aksony neuronów ruchowych i czuciowych. Podzbiór poszczególnych motoneuronów jest oznaczony przez sterowanie wyrażeniem UAS-mCD8-GFP (zielonym) ze sterownikiem m12-Gal4. Ciała komórkowe i dendryty z tych neuronów leżą w brzusznym rdzeniu nerwowym, podczas gdy ich aksony rzutują do mięśni ścian ciała przez nerwy segmentowe. (Ten czynnik napędza również ekspresję GFP w mięśniach 12 dla każdego półsegmentu larwy, które razem można zobaczyć jako pręgi przednie i tylne po obu stronach zwierzęcia). Obszar uszkodzony przez zgniatanie jest podświetlony niebieskimi przerywanymi liniami. Podziałka = 70 μm. (C) Zbliżenie uszkodzonych aksonów, 20 godzin po urazie. Po lewej: akson proksymalny uległ wykiełkowaniu i nowemu wzrostowi. Po prawej: dystalny akson jest fragmentaryczny, z niewielką ilością GFP, z powodu zwyrodnienia Wallera i usuwania gruzu. Pasek skali = 10 μm. (D) Obrazy zmiażdżenia nerwu u wczesnej larwy w 3^{. stadium} rozwojowym. Czerwona strzałka wskazuje na brzuszny rdzeń nerwowy. Lokalizacja zgniatania znajduje się w dolnej części 3. segmentu, zgodnie z opisem w tekście Protokołu (Protokół 3). Obrazy w D zostały pierwotnie opublikowane w J. Cell Biol. 191, 211-223, doi: 10.1083 (2010). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Obrazowanie poklatkowe transportu aksonalnego peptydergicznych pęcherzyków synaptycznych.Szczurzy przedsionkowy peptyd natriuretyczny ANF znakowany GFP, UAS-ANF-GFP²¹, ulegał ekspresji w określonych motoneuronach przy użyciu sterownika eve-RRa-Gal4²². Obrazowanie na żywo nerwów segmentowych ujawnia szybki transport pęcherzyków peptydygicznych znakowanych ANF-GFP w aksonach. Zobacz także Film S1. (A) Pojedyncze klatki aksonów neuronów ruchowych z obrazowania poklatkowego na żywo. Zielone, czerwone i niebieskie strzałki wskazują odpowiednio przykłady pęcherzyków następczych, stacjonarnych i wstecznych. Podziałka liniowa = 5 μm. (A') Poszczególne klatki czasowe z filmu zostały scalone za pomocą ImageJ. (B) Kimograf wygenerowany na podstawie obrazowania poklatkowego transportu ANF-GFP został wygenerowany ze zbioru pojedynczych klatek obejmujących jedną minutę czasu obrazowania przy użyciu wtyczki "Multiple Kymograph" dla ImageJ²³. (C) Kwantyfikacja uśrednionych prędkości segmentowych, które obliczono na podstawie nachyleń segmentowanych śladów na kimografach. Zielony słupek przedstawia następczą prędkość odcinkową (n = 543), a niebieski słupek przedstawia wsteczną prędkość segmentową (n = 548) pęcherzyków z 10 kymogramów. (D) Kwantyfikacja gęstości cząstek. Gęstość cząstek mierzono liczbą cząstek następczych (pokazanych na zielonym pasku), stacjonarnych (pokazanych na czerwonym pasku) i wstecznych (pokazanych na niebieskim pasku) na 100 μm długości aksonu z 10 kymogramów. Dane na tym rysunku zostały również opublikowane wcześniej w Ghannad-Rezaie et al., PLoS One 7(1), e29869, doi:0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

Rysunek 5. Zastosowanie chipa larwowego do mikrochirurgii laserowej i obrazowania wapnia.
Dendryt z neuronu czuciowego klasy IV jest transektowany impulsami laserowymi o dużej mocy z pulsacyjnego lasera barwnikowego UV. Protokoły stosowania tej metody w mikrochirurgii można znaleźć gdzie^{indziej 16}. Skuteczne unieruchomienie w chipie larwy pozwala na szybkie zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia za pomocą obrazowania na żywo. W tym przykładzie genetycznie kodowany wskaźnik wapnia GCaMP3.0 uległ ekspresji w neuronach czuciowych arboryzacji dendrytycznej klasy IV (C4da) przy użyciu sterownika ppk-Gal4. (A) Obrazy poklatkowe o intensywności GCaMP3.0 były fałszywie pokolorowane zgodnie ze skalą intensywności kolorów, aby wskazać zmiany intensywności w czasie. Poszczególne klatki zostały wyodrębnione z filmu poklatkowego (Movie S2) zobrazowanego pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem z prędkością 5 klatek/sek. (B) Kwantyfikacja dynamiki wapnia w odpowiedzi na mikrochirurgię laserową. Znormalizowaną zmianę krotności intensywności fluorescencji somy GCaMP3.0 (ΔF/F0) poszczególnych neuronów wykreślono w funkcji czasu (n = 7, pokazano na szaro). Uśredniona wartość ΔF/F0 została przedstawiona w kolorze pomarańczowym. Szczytowy wzrost intensywności GCaMP3.0 obserwowano między 1-2 sekundami po urazie. Tło zostało odjęte od surowej intensywności fluorescencji G-CaMP3.0. Dane na tym rysunku zostały również opublikowane wcześniej w Ghannad-Rezaie et al., (2012) PLoS One 7(1):e29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869¹².

Rysunek 6. Obrazowanie kiełkowania i zwyrodnienia aksonów za pomocą chipa larwy. Reprezentatywne obrazy konfokalne kikuta bliższego (po lewej) i kikuta dystalnego (po prawej) aksonów oktopaminergicznych neuronów ruchowych w różnych punktach czasowych po zmiażdżeniu nerwu. Zdjęcia zostały wykonane w podobnych miejscach, jak pokazano na rysunku 3C. Neurony te są znakowane przez sterowanie ekspresją transgenu UAS-mCD8-RFP za pomocą sterownika Tdc2-Gal4^24,25. Ciała komórkowe tych neuronów leżą w brzusznym rdzeniu nerwowym²⁴. Trzy pojedyncze aksony można zobaczyć w obrębie jednego nerwu segmentowego i można je łatwo rozdzielić od siebie. Jest to idealna sytuacja do badania pojedynczych zdarzeń komórkowych, takich jak fragmentacja degenerujących się aksonów, która dla tych neuronów kończy się w ciągu 15 godzin. Obrazy uzyskano od żywych zwierząt przy użyciu chipa larwowego przy 63-krotnym powiększeniu na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Podziałka = 10 μm dla lewych paneli (kikuty proksymalne) i 20 μm dla prawych paneli (kikuty dystalne). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 7. Wykorzystanie chipa larwalnego do śledzenia fotoprzekształconych białek fluorescencyjnych przez długi czas i na duże odległości u żywych zwierząt.
W tym przykładzie białko fuzyjne fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego Dendra2¹⁹, połączone z α-tubuliną, ulega ekspresji z transgenu UAS-Dendra2-α-tubuliny w neuronach czuciowych arboryzacji dendrytycznej klasy IV (C4da), przy użyciu sterownika ppk-Gal4²⁶. (A) Schemat eksperymentu z fotokonwersją. Ciała komórkowe neuronów C4da leżą na obrzeżach i rozciągają aksony przez nerwy segmentowe, tworząc zakończenia synaptyczne w rdzeniu nerwowym. Dendra2-α-tubulina w podzbiorze ciał komórkowych w tylnej połowie zwierzęcia poddaje się fotokonwersji przez oświetlenie UV przez 6 sekund przy użyciu standardowego filtra DAPI z lampą Hg (lewy rysunek). Po pewnym czasie fotoprzekształconą Dendra2-α-tubulinę można wykryć na zakończeniach synaptycznych w brzusznym rdzeniu nerwowym. Oznacza to, że białko tubuliny zostało przetransportowane na dużą odległość (~1-2 mm). Pasek skali = 1 mm (B) Przykładowe obrazy Dendra2-α-tubuliny w ciele komórki neuronu czuciowego klasy IV przed i po fotokonwersji. Podziałka = 5 μm. (C) przykładowe obrazy zakończeń synaptycznych dla neuronów czuciowych klasy IV po 0 godzinie lub 48 godzinach po fotokonwersji ciał komórkowych. Specyficzny wygląd fotoprzekształconej Dendra2-α-tubuliny na zakończeniach synaptycznych po czasie sugeruje, że białko przemieszczało się z ciała komórki do końca aksonu. Fotokonwersję i obrazowanie we wszystkich punktach czasowych przeprowadzono w chipie larwy. Podziałka = 15 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Film S1. Mikrochirurgia laserowa i obrazowanie wapnia neuronu C4da. Impulsowy laser UV został użyty do przecięcia pierwotnej gałęzi dendrytycznej. Przekrój laserowy wywołał gwałtowny wzrost intensywności GCaMP, który rozpoczął się w miejscu urazu i przemieścił się do ciała komórki. UAS-GCaMP3.0 ¹⁸ został wyrażony przy użyciu specyficznego dla C4da sterownika ppk-Gal4²⁶. Filmy były fałszywie pokolorowane, aby wskazać względne poziomy intensywności GCaMP3.0. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem przy 5 klatkach/sek.

Film S2. Szybki transport aksonalny ANF-GFP w neuronach ruchowych.
Szczurzy przedsionkowy peptyd natriuretyczny ANF znakowany GFP, UAS-ANF-GFP²¹, ulegał ekspresji w określonych motoneuronach przy użyciu sterownika eve-RRa-Gal4²². Transport tych pęcherzyków peptydergicznych w obrębie nerwów segmentowych larw zobrazowano na chipie larwy z prędkością 300 ms/klatkę za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem.

Rysunek uzupełniający1 (plik DXF)
Plik DXF do produkcji form silikonowych. Pilnik przeznaczony jest do ujemnej maski fotorezystu (ciemna maska piłkowa dla SU-8) na 4-calowej płytce krzemowej. Drugi rząd zawiera 5 form do wytwarzania wiórów larwowych używanych w tym protokole. Każdy z tych wiórów (w rzędzie 2) zawiera komorę o wymiarach ~5,4 mm x 1,5 mm zaprojektowaną tak, aby pasowała do larwy we wczesnym stadium 3.^{stadium rozwojowym}. W pierwszym rzędzie (rząd 1) znajduje się większa komora (~5,4 mm x 2 mm), natomiast w trzecim rzędzie (rząd 3) znajduje się mniejsza komora (~4,4 mm x 1,5 mm). Można je stosować z larwami odpowiednio o większych i mniejszych rozmiarach. Podziałka = 2 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Wytwarzanie lub otrzymywanie chipa larwy:

Chip larwy składa się z bloku PDMS (zwanego "chipem PDMS") przymocowanego do szklanego szkiełka nakrywkowego. Protokół w kroku 1 opisuje procedurę wytwarzania i używania odczipów larw, zakładając, że dostępna jest pleśń SU-8. Forma SU-8 jest mikrofabrykowana przez fotolitograficzne modelowanie warstwy fotorezystu SU-8 o grubości 140 μm na płytce krzemowej (szczegóły patrz Ghannad-Rezaie i wsp.¹²). Ponieważ mikrofabrykacja formy SU-8 wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu, zalecamy zamówienie jej w zakładzie mikrofabrykacji (np. zakład LNF na Uniwersytecie Michigan¹⁴) lub w odlewni poprzez przesłanie projektu chipa, który jest dostarczany jako plik uzupełniający. Jeśli ktoś chce zmienić konstrukcję chipa PDMS (np. do użytku z larwami o różnych rozmiarach), można użyć oprogramowania CAD, które obsługuje pliki DXF (np. Autocad). Forma SU-8 może być również wykonana we własnym zakresie zgodnie z instrukcjami w Mondal i wsp.²⁷ Wielu czytelników może uznać, że wygodnie jest po prostu zaopatrzyć się w próbkę chipa PDMS w celu wypróbowania tej techniki przed wyprodukowaniem własnych chipów. Zostaną one udostępnione bezpłatnie na żądanie.

Zastosowanie mikroprzepływowego "chipa larwowego" do obrazowania na żywo:

Metoda unieruchomienia w chipie larwy pozwala uniknąć stosowania środków znieczulających, a zamiast tego polega na wywieraniu nacisku, poprzez zastosowanie podciśnienia, w celu ograniczenia ruchów zwierzęcia. Podczas gdy zwierzęta mogą przetrwać unieruchomienie w chipie przez wiele godzin¹², zalecany jest krótszy okres unieruchomienia (5-15 min). Jest to wystarczający czas na zobrazowanie wielu interesujących zdarzeń komórkowych, w tym zmian w wewnątrzkomórkowym wapniu lub szybkiego transportu aksonalnego. Jest to również wystarczający czas na pożądane manipulacje na żywych zwierzętach, takie jak mikrochirurgia laserowa, fotowybielanie i fotokonwersja.

Aby badać zdarzenia podłużnie w dłuższym okresie czasu u jednego zwierzęcia, zwierzęta można umieszczać w chipie i obrazować wiele razy, oddzielone okresami spoczynku. Talerze agarowe z sokiem winogronowym są idealne do odpoczynku między sesjami obrazowania, ponieważ zapewniają łatwe źródło pożywienia i wilgotność. Wielokrotne sesje obrazowania wpływają w pewnym stopniu na przeżywalność larw, ponieważ każda sesja niesie ze sobą pewne ryzyko uszkodzenia zwierzęcia (patrz część 2 w rozwiązywaniu problemów poniżej). Zwierzęta mogą być rutynowo obrazowane >5 razy w ciągu dwóch dni z ponad 50% wskaźnikiem przeżycia. Ponieważ zwierzęta nie są znieczulane, są zdrowe i ruchliwe natychmiast po uwolnieniu podciśnienia w chipie. W związku z tym nie ma potrzeby stosowania czasu rekonwalescencji między sesjami obrazowania, więc odstępy czasowe między sesjami są elastyczne i można je dostosować do celów eksperymentu.

Rozwiązywanie problemów:

Najczęstsze problemy techniczne z larwą chipa i zalecane rozwiązania są następujące:

(1) Zwierzę za bardzo się rusza. Zbyt duża mobilność może zakłócać realizację celów obrazowania. Najczęstszymi przyczynami takiego stanu rzeczy w przypadku chipa larwy są: a) zwierzę jest zbyt małe w stosunku do chipa lub b) podciśnienie stosowane na etapie unieruchomienia jest obniżone. Chip larwalny opisany w tym protokole jest przeznaczony dla larw w stadium wczesnym w stadium 3. Optymalna wielkość zwierzęcia to 3,5-4 mm długości (wzdłuż osi przednio-tylnej). Aby upewnić się, że podciśnienie jest wystarczające, pociągnij strzykawkę o 2-2,5 ml lub do momentu, gdy wyczujesz opór w uchwycie. Jedną z oznak, że próżnia działa, jest to, że można zobaczyć małe pęcherzyki w kanale obwodowym poruszające się powoli w kierunku źródła podciśnienia. Inną wskazówką jest to, że szkiełko nakrywkowe powinno zawsze przemieszczać się wraz z wiórem, gdy wiór jest podnoszony od góry (i jest to zalecana metoda transportu komory po umieszczeniu larw i włączeniu próżni). Próżnia może być zagrożona, jeśli w rurce są pęknięcia lub jeśli w rurce znajduje się olej. Można temu łatwo zaradzić, wymieniając końcówkę igły dozującej 23 G i rurkę z polietylenu-50 (z kroków 1.6-1.14).

(2) Zwierzę umiera po zobrazowaniu w chipie. Procedura ma na celu wywołanie minimalnego stresu u zwierzęcia, a zwierzęta o genotypie dzikiego mają >90% wskaźnik przeżycia, nawet po godzinie unieruchomienia na chipie¹². Ponieważ niektóre genotypy mogą być mniej odporne na stres związany z chipem, najpierw sprawdź, czy zwierzęta typu dzikiego (na przykład Canton S) przetrwały technikę unieruchomienia. a) Najczęstszą przyczyną śmiertelności jest nieprawidłowe ułożenie larwy (patrz ryc. 2G-H). Jeśli części naskórka, głowy lub tchawicy nie znajdują się całkowicie w komorze, mogą ulec uszkodzeniu podczas unieruchomienia, a larwa, która jest zbyt duża dla chipa (>4 mm), ma mniejsze szanse na przeżycie. b) Rzadziej występującą przyczyną śmiertelności jest użycie zbyt dużego ciśnienia lub podciśnienia podczas ładowania chipa. Po prawidłowym umieszczeniu w chipie, ciśnienie wytwarzane przez podciśnienie jest dobrze tolerowane. Jednak nadmierny nacisk, zarówno ze strony podciśnienia, jak i w początkowej fazie ustawiania zwierzęcia, może stanowić problem. Stopień nacisku potrzebnego empirycznie najlepiej jest poznać w próbach z larwami typu dzikiego o odpowiedniej wielkości. c) Jeśli zbyt dużo oleju halowęglowego pokrywa tchawicę zwierzęcia, zwierzę może mieć problemy z długoterminowym przeżyciem. Olej odgrywa kilka ważnych ról w chipie: jest ważny dla wytwarzania próżni, optyki podczas obrazowania i przeciwdziała wysuszeniu w chipie. Należy jednak unikać nadmiaru oleju. (Może to również prowadzić do oleju w rurce i strzykawce, pogarszając próżnię). Sugerowany protokół pokrywa olejem tylko brzuszną stronę larwy, a następnie usuwa nadmiar oleju poprzez umieszczenie larwy na czystym szkiełku nakrywkowym przed przeniesieniem do ostatniego szkiełka nakrywkowego w celu obrazowania. d) Fototoksyczność może wystąpić podczas sesji obrazowania. Podobnie jak w przypadku każdej aplikacji do obrazowania na żywo, idealnym rozwiązaniem jest stosowanie krótkich czasów naświetlania przy świetle laserowym o niskiej intensywności, co najlepiej osiągnąć za pomocą bardzo czułej kamery lub detektora. Staraj się zminimalizować oświetlenie światłem UV, w tym światłem o szerokim spektrum wytwarzanym przez źródła światła Hg.

Inne zagadnienia i kierunki na przyszłość:

Ponieważ ta metoda nie wykorzystuje środków znieczulających, serce zwierzęcia nadal bije. Stwarza to pewną nieuniknioną mobilność, która wpływa na obrazowanie w niektórych miejscach bardziej niż w innych. Przedstawione przykłady pokazują, że brzuszny rdzeń nerwowy, nerwy segmentowe i ścianę ciała można łatwo zobrazować bez zakłóceń spowodowanych biciem serca. W przypadkach, gdy bicie serca wpływa na obrazowanie, regularne ruchy można czasami skorygować w oprogramowaniu analitycznym (na przykład wtyczka Image Stabilizer dla ImageJ). Działa to dobrze, gdy pojedyncze obiekty poruszają się w szybkiej skali czasowej (na przykład ~1 μm/s dla szybkiego transportu aksonalnego) lub w bardzo wolnej skali czasowej (od minut do godzin). Jednakże, gdy obiekt (obiekty) zainteresowania porusza się z różnymi prędkościami i kierunkami, może być trudniej skorygować ruchy wywołane biciem serca.

Inną kwestią jest niewielka zmienność optyki między zwierzętami lub między wieloma sesjami obrazowania tego samego zwierzęcia w chipie. Im głębiej obiekt zainteresowania znajduje się w zwierzęciu, tym większa będzie ta różnica. Nerwy segmentowe i brzuszny rdzeń nerwowy są zwykle zbyt głęboko w ciele zwierzęcia, aby można je było zobrazować pod zwykłym mikroskopem. Jednak łagodny nacisk odczuwany w wiórze larwy popycha te struktury bardzo blisko naskórka i szkiełka nakrywkowego. Dokładna odległość tych struktur od szkiełka nakrywkowego będzie się nieznacznie różnić w zależności od próby. Zmienność obiektów zamykających naskórek, takich jak ciała komórkowe neuronów czuciowych, jest mniejsza. Dlatego ważne jest, szczególnie przy dokonywaniu pomiarów intensywności, wykorzystanie dużej liczby zwierząt i niezależnych prób w celu uwzględnienia zmienności optyki.

Podczas gdy przedstawione tutaj przykłady koncentrowały się na procesach zachodzących w neuronach, podejście to powinno być podatne na obrazowanie dowolnej struktury zwierzęcia, którą można umieścić w zakresie ostrości obiektywu mikroskopu. Obejmuje to naskórek, mięśnie ściany ciała i ich NMJ. Można również zobrazować tchawicę po brzusznej stronie zwierzęcia i potencjalnie części przewodu pokarmowego. Zwierzę może być również umieszczone stroną grzbietową w kierunku szkiełka nakrywkowego w celu krótkotrwałego obrazowania struktur w pobliżu powierzchni grzbietowej. Zdolność do obrazowania struktur znajdujących się głęboko w ciele zwierzęcia jest ograniczona przez odległość roboczą zastosowanego obiektywu mikroskopu. Struktury takie jak dyski wyobrażeniowe są niedostępne dla obiektywów o dużym powiększeniu (np . 40X).

Chipy larw opisane w tym protokole są przeznaczone dla larw we wczesnym stadium^{3 stadium} rozwojowym (o wielkości od 3,5 do 4 mm). Jednak wiele interesujących pytań wymaga obrazowania w różnych stadiach larwalnych. Mniejsze wióry, aby pomieścić larwy w 2. stadium lub większe wióry, aby pomieścić późne 3.^{stadium rozwojowe}, można łatwo zaprojektować przy użyciu tej samej zasady. (Rysunek uzupełniający 1 zawiera łatwo modyfikowalny plik DXF do wykonywania form silikonowych o zmienionych rozmiarach komór). Prosta zasada odwracalnego uszczelnienia może być nawet zastosowana do innych organizmów, takich jak C. elegans lub danio pręgowany, przy czym głównym wariantem jest rozmiar komory. Użytecznym kierunkiem na przyszłość jest zaprojektowanie chipa, który może unieruchomić wiele zwierząt jednocześnie, do wykorzystania do celów przesiewowych. Jednak w tym celu projekt musiałby znacznie różnić się od obecnego urządzenia, w którym kwestie ułożenia zwierzęcia w chipie muszą być rozwiązywane dla każdego zwierzęcia niezależnie.

Test zmiażdżenia nerwu do badania reakcji na urazy w nerwach obwodowych larw:

Opisany tutaj test zmiażdżenia nerwów dla larw nerwów segmentowych jest prostą metodą wprowadzania uszkodzenia aksonów obwodowych u Drosophila. Do zalet tej metody należą: a) jest łatwa do przeprowadzenia przy użyciu standardowych narzędzi znalezionych w laboratorium Drosophila (źródło CO₂ stereoskopu i kleszcze); b) można ją szybko przeprowadzić u wielu zwierząt, dzięki czemu możliwa jest analiza biochemiczna sznurów nerwowych po urazie¹⁴; c) Molekularne i komórkowe odpowiedzi na to uszkodzenie są wysoce powtarzalne^14,15,28 i mogą być wykorzystane do odkrywania procesów, które są również ważne w neuronach kręgowców^29,30.

Alternatywną metodą uszkadzania neuronów jest skupienie lasera o dużej mocy, na przykład lasera pulsacyjnego UV lub femtosekundowego, w celu przecięcia aksonu za pomocą mikrochirurgii laserowej^17,31-33. Chip larwowy jest idealną metodą pozycjonowania zwierzęcia do takiej mikrochirurgii. Jednak ze względu na niewielkie różnice w optyce między próbami, omówione powyżej, metoda laserowa może być trudniejsza do odtworzenia u larw, szczególnie w nerwach segmentowych larw. Ponadto laserowe uszkodzenie aksonów wymaga więcej czasu na ustawienie każdego zwierzęcia, dlatego jest trudniejsze do przeprowadzenia na dużą skalę (przy dużej liczbie zwierząt).

Rozwiązywanie problemów:

Najczęstszym problemem technicznym związanym ze zmiażdżeniem nerwu jest śmierć z powodu uszkodzenia narządów wewnętrznych. Podczas przeprowadzania zgniatania ważne jest, aby nie szczypać brzusznego rdzenia nerwowego, gruczołów ślinowych ani jelit. Ważne jest również, aby nie nakłuwać naskórka. Problemów tych najlepiej uniknąć, przykładając kleszcze pod kątem 45° do powierzchni naskórka (patrz ryc. 3).

Jakość kleszczy ma duży wpływ na skuteczność zmiażdżenia i przeżycie po jego zakończeniu. Polecamy kleszcze Dumostar numer 5. Aby zachować ich ostrość, z kleszczami należy obchodzić się ostrożnie, nie używać ich do innych celów i wymieniać, gdy staną się lub zgięte.

Wielkość zwierzęcia może również wpływać na skuteczność zmiażdżenia. Małe zwierzęta (poniżej 3 mm długości) mają znacznie mniejsze szanse na przeżycie urazu. W przypadku dużych zwierząt (wędrujących w 3. stadium) trudniej jest zlokalizować nerwy i uniknąć uszkodzenia większych gruczołów ślinowych i jelit, a także jest mniej czasu na badanie reakcji na uraz przed przepoczwarzeniem. Zmiażdżenie nerwu jest najskuteczniej przeprowadzane we wczesnych larwach 3^rd instar (które mają ~3-4,5 mm długości wzdłuż osi przednio-tylnej).

Źródło pożywienia, na którym zwierzę jest hodowane, może wpływać na wytrzymałość naskórka i przetrwanie po zmiażdżeniu. Zaleca się hodowlę zwierząt w żywności wykonanej ze standardowej receptury drożdżowo-glukozowej.

Najlepszą metodą nauczenia się, jak skutecznie wykonać zauroczenie, jest ćwiczenie na wielu zwierzętach, najpierw z głównym celem osiągnięcia przeżycia (a nie przepoczwarzenia) 24 godziny po zmiażdżeniu. Początkujący zwykle mają niski wskaźnik przeżycia (np. 10%), ale gdy technika zostanie opanowana, wskaźniki przeżycia mogą osiągnąć ~90%.

Inne zagadnienia i kierunki na przyszłość:

Test zgniatania stanowi potężną metodę badania kiełkowania aksonu proksymalnie do miejsca urazu oraz zwyrodnienia aksonów i synaps dystalnie do miejsca urazu. Chociaż tempo degeneracji różni się w zależności od typu neuronu, są one wysoce powtarzalne w obrębie danego typu neuronu, co świadczy o odtwarzalności testu urazu.

W przeciwieństwie do tego, "regeneracyjna" reakcja kiełkowania obserwowana w proksymalnych aksonach jest trudniejsza do zbadania. Wszystkie aksony w nerwie segmentowym inicjują rozległe kiełkowanie w pobliżu miejsca urazu (na przykład patrz ryc. 6 i ryc. 3). Jednak zakres kiełkowania może się różnić w zależności od neuronu i jest trudny do oszacowania. Podobny stopień i zmienność kiełkowania można zaobserwować po bardziej ogniskowych uszkodzeniach pojedynczych neuronów ruchowych w nerwach segmentowych wprowadzonych za pomocą impulsowego lasera barwnikowego UV. Interpretujemy, że niedyskryminująca kierunkowość kiełkowania wynika z braku wskazówek prowadzących w nerwach segmentowych. W przeciwieństwie do tego, aksony neuronów czuciowych uszkodzone przez laser w pobliżu ich ciał komórkowych przechodzą nowy wzrost aksonów w tym samym kierunku, co utracony akson³⁴. Aksony w tym regionie zwierzęcia są prawdopodobnie narażone na bardziej szczegółowe informacje o położeniu w celu kierowania regenerującymi się aksonami. Jest mało prawdopodobne, aby środowisko w nerwach segmentowych miało duże podobieństwo do środowiska, w którym aksony pierwotnie poruszały się podczas prowadzenia w zarodku, dlatego nie oczekuje się, że będzie miało informacje kierujące regenerującymi się aksonami.

Innym ograniczeniem w badaniu regeneracji za pomocą segmentalnego testu zmiażdżenia nerwu jest to, że uszkodzone aksony czuciowe i ruchowe neuronów nadal mają znaczną odległość do pokonania (0,25-1 mm), aby dotrzeć do celu, oraz ograniczony czas (<3 dni), zanim zwierzę przejdzie przepoczwarzenie. Niedawne badania zidentyfikowały manipulację genetyczną receptora hormonu prothoraciotropowego, która trzykrotnie wydłuża czas trwania 3. stadium larwalnego^{w 35}. stadium rozwojowym. Ta manipulacja znacznie wydłuży ramy czasowe badania regeneracji i degeneracji neuronów po urazie, do 9 zamiast 3 dni. Może to być wystarczająco długie, aby zaobserwować nowe zdarzenia, takie jak ponowne połączenie uszkodzonego aksonu z jego celem postsynaptycznym, zwłaszcza jeśli uraz jest wywołany blisko zakończenia synaptycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka polietylenowa 0,5 mm	Fisher Scientific	14-170-11B	Rurka polietylenowa, ID = 0,023 cala OD = 0,038 cala
mm Rurka poliuretanowa	Fisher Scientific	BB521-63	Rurka poliuretanowa, ID = 0,063 cala  OD = 0,125 cala
Złącze kolczasto-kolczaste	Bio Rad	732-8300	Łącznik 0,8 mm z zadziorem
3-drogowy zawór odcinający	Bio Rad	732-8104	Przykręcany zawór do strzykawki
Strzykawka (20 ml)	Fisher Scientific	14-817-33	Przykręcana strzykawka 20 ml do  wytwarzania próżni
Igły dozujące, 23 G (0,4 mm średnica wewnętrzna, 0,6 mm średnica zewnętrzna)	McMaster-Carr	75165A684	Igła do podłączenia wylotu
Igły dozujące, 21 G, (0,6 mm średnica wewnętrzna,  0,8 mm średnica zewnętrzna)	McMaster-Carr	75165A679	Igła do podłączenia wylotu
Olej halowęglowy	Sigma	H8898	Olej halowęglowy 700
Dumostar Kleszcze numer 5	Roboz	RS-498	Do zmiażdżenia nerwów
Zestaw PDMS (baza i utwardzacz)	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Dow Corning Sylgard 184 Silikonowa kapsułka 0,5 kg Zestaw Przezroczyste
szkło Nakrywki	Fisher Scientific	12-544-C	24 mm x 40 mm (grubość zgodnie z zaleceniami dla obiektywu mikroskopu)
Jednorazowy plastikowy kubek (9 uncji)
Plastikowe mieszadełko
Żyletka Talerze
agarowe z sokiem winogronowym			Zobacz przepis http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925