Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51075

⸱

13 stycznia 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Streszczenie

Głównym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie molekularnych podstaw obwodów neuronowych, które rządzą określonym zachowaniem. Po zidentyfikowaniu konkretnych mechanizmów molekularnych można opracować nowe strategie terapeutyczne w celu leczenia nieprawidłowości w określonych zachowaniach spowodowanych chorobami zwyrodnieniowymi lub starzeniem się układu nerwowego. Ślimak morski Aplysia californica dobrze nadaje się do badań komórkowych i molekularnych podstaw zachowania, ponieważ obwody neuronalne leżące u podstaw określonego zachowania można łatwo określić, a poszczególnymi elementami obwodów można łatwo manipulować. Te zalety Aplysia doprowadziły do kilku fundamentalnych odkryć w dziedzinie neurobiologii uczenia się i pamięci. W tym artykule opisano przygotowanie układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych poszczególnych neuronów. Krótko mówiąc, ganglion wypreparowany z układu nerwowego jest wystawiany na działanie proteazy w celu usunięcia osłonki zwojowej tak, że neurony są odsłonięte, ale zachowują aktywność neuronalną, jak u nienaruszonego zwierzęcia. Preparat ten służy do przeprowadzania pomiarów elektrofizjologicznych pojedynczych lub mnogich neuronów. Co ważne, po zarejestrowaniu przy użyciu prostej metodologii, neurony można było wyizolować bezpośrednio ze zwojów w celu analizy ekspresji genów. Protokoły te wykorzystano do przeprowadzenia jednoczesnych zapisów elektrofizjologicznych z neuronów L7 i R15, zbadania ich odpowiedzi na acetylocholinę i ilościowego określenia ekspresji genu CREB1 w izolowanych pojedynczych neuronach L7, L11, R15 i R2 Aplysia.

Wprowadzenie

Ludzki mózg jest niezwykle złożony, z prawie 100 miliardami neuronów i bilionami połączeń synaptycznych. Istnieje prawie taka sama liczba komórek nieneuronalnych, które oddziałują z neuronami i regulują ich funkcję w mózgu. Neurony są zorganizowane w obwody, które regulują określone zachowania. Pomimo postępów w naszym zrozumieniu funkcji mózgu i obwodów neuronalnych, niewiele wiadomo na temat tożsamości elementów obwodów, które kontrolują określone zachowanie. Wiedza na temat tożsamości różnych składników obwodu znacznie ułatwi nam zrozumienie zarówno komórkowych, jak i molekularnych podstaw zachowania oraz pomoże w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych dla zaburzeń neuropsychiatrycznych.

Ślimak morski Aplysia californica był koniem pociągowym do określania obwodów neuronalnych leżących u podstaw określonych zachowań1-14. Układ nerwowy Aplysia zawiera około 20 000 neuronów, które są zorganizowane w 9 różnych zwojów. Neurony Aplysia są duże i można je łatwo zidentyfikować na podstawie ich wielkości, właściwości elektrycznych i położenia w zwojach. Aplysia ma bogaty repertuar zachowań, które można badać. Jednym z dobrze zbadanych zachowań jest odruch wycofania skrzeli (GWR). Centralne elementy tego odruchu znajdują się w zwojach brzusznych. Zmapowano składowe obwodów GWR i określono udział różnych komponentów. Co ważne, obwody GWR podlegają uczeniu asocjacyjnemu i nieasocjacyjnemu5,6,15-19. Dziesięciolecia badań nad tym odruchem zidentyfikowały również kilka szlaków sygnałowych, które odgrywają kluczową rolę w uczeniu się i zapamiętywaniu20-24.

Kilka różnych preparatów Aplysia zostało użytych do badania komórkowych i molekularnych podstaw przechowywania pamięci. Należą do nich nienaruszonyzwierzęcy 2,3, półnienaruszony preparat1,7,13,14,16 i odtworzenie głównych składników obwodów nerwowych25-29. Poniżej opisano zmniejszone przygotowanie do badania zwojów Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych zidentyfikowanych obwodów neuronalnych. Badaniom poddano następujące cztery zidentyfikowane neurony. Badano R15, neuron pękający, L7 i L11, dwa różne neurony ruchowe oraz R2, neuron cholinergiczny. R2 jest największym neuronem opisanym w układzie nerwowym bezkręgowców. Krótko mówiąc, metodologia ta obejmuje leczenie zwojów proteazą, pomiary elektrofizjologiczne przed i po leczeniu farmakologicznym oraz izolację pojedynczych neuronów w celu ilościowej analizy ekspresji genów. Metodologia ta pozwala nam łączyć analizy molekularne z jednoczesnym zapisem z wielu neuronów. Metodologia ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania odpowiedzi neuronów R15 i L7 na acetylocholinę (Ach) za pomocą sparowanych zapisów wewnątrzkomórkowych. Po pomiarach elektrofizjologicznych R15 i L7 oraz inne zidentyfikowane neurony, takie jak L11 i R2, wyizolowano w celu ilościowej analizy ekspresji CREB1 (qPCR) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie zwojów brzusznych, pomiary elektrofizjologiczne i izolacja pojedynczych zidentyfikowanych neuronów ze zwoju brzusznego Aplysia californica

  1. Utrzymuj Aplysia w akwarium laboratoryjnym z krążącą sztuczną wodą morską (ASW) o temperaturze 16 °C w warunkach 12:12 światło: ciemność.
  2. Izolacja zwoju brzusznego.
    1. Znieczulenie zwierząt poprzez wstrzyknięcie 380 mM roztworu MgCl2 przez 5-10 minut (co odpowiada 30-35% masy ciała zwierzęcia).
    2. Zidentyfikuj zwój brzuszny na podstawie jego położenia w ośrodkowym układzie nerwowym24,28.
    3. Usunąć zwoje jaj chirurgicznie i natychmiast przechowywać w sztucznej wodzie morskiej składającej się z 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3 i 10 mM HEPES (pH 7,4).
  3. Leczenie proteazą.
    1. Inkubować ganglion brzuszny przez 30 minut w temperaturze 34 °C±0,5 na szalce Petriego z 0,1% proteazą (dypazą) rozcieńczoną w ASW opisanym powyżej.
      UWAGA: Ilość użytej proteazy musi być znormalizowana z wiekiem i wagą zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, starsze i większe zwierzęta wymagałyby więcej proteazy.
  4. Usunięcie pochewki zwojowej.
    1. Po poddaniu działaniu enzymów przypiąć zwoje nerwowe do silikonowej podstawy komory komórkowej Sylgard (Ø= 1 cm; obj. = 0,3 ml) i przeprowadzić perfuzję za pomocą ASW (natężenie przepływu: 150 μl/min) w temperaturze pokojowej (18 °C±2 ).
      UWAGA: Aby zwiększyć widoczność zidentyfikowanych neuronów, umieść ganglion na górze cylindra ze szkła poliwęglanowego (ryc. 1) (średnica Ø = 2 mm zmodyfikowana komora komórkowa), który można łatwo oświetlić od dołu za pomocą dwuokularowego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 20X i 40X.
    2. Ostrożnie usuń osłonkę z ganglionu za pomocą kleszczy i mikronożyczek.
  5. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z dwóch neuronów.
    1. Zidentyfikuj neuron będący przedmiotem zainteresowania.
    2. Przebić neuron pojedynczą wewnątrzkomórkową ostrą mikroelektrodą o rezystancji 10-15 MΩ wypełnioną 3 M roztworem KCl.
    3. Rejestruj aktywność neuronalną (przepust pasma 10 kHz) za pomocą wewnątrzkomórkowego systemu zapisu.
    4. Przetwarzanie danych rejestracyjnych za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii, takiego jak Axograph.
      UWAGA: Można łatwo przeprowadzić zapis z wielu neuronów. Neurony L7, L11 lub R15 i R2 można łatwo zidentyfikować na podstawie ich położenia. Dwa wzmacniacze i dwa mikromanipulatory są potrzebne do jednoczesnego nagrywania z dwóch neuronów L7 i R15 (ilustracja 2).
  6. Stosowanie leków.
    1. Nałóż wybrany lek do komory komórkowej poprzez delikatne pipetowanie lub wstrzyknij bezpośrednio do neuronów.
    2. Wykonaj pomiary elektrofizjologiczne.
      UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, można mierzyć różne parametry elektrofizjologiczne neuronów, takie jak zmiany potencjału błonowego (MP) lub potencjału czynnościowego (AP) przed, w trakcie i po zastosowaniu leku.
  7. Izolacja pojedynczych neuronów.
    1. Na zakończenie eksperymentów elektrofizjologicznych zatrzymaj perfuzję ASW i umyj ganglion 100% etanolem. Ekspozycja na etanol skamienieje neurony i przy użyciu cienkich kleszczy ułatwi usunięcie pojedynczych neuronów bez uszkadzania innych neuronów ze zwoju.
    2. Usuń pojedyncze neurony pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do małej probówki Eppendorfa zawierającej lodowaty odczynnik do ekstrakcji RNA o pojemności 500 μl. Wyizolowane pojedyncze neurony mogą być przechowywane w odczynniku do ekstrakcji RNA w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.

2. Izolacja RNA z pojedynczych neuronów i analiza ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

  1. Środki ostrożności w celu zminimalizowania degradacji RNA:
    Rybonukleazy (RNazy) rozkładają RNA i są bardzo stabilnymi i aktywnymi enzymami. Wykonaj następujące kroki podczas obchodzenia się z RNA.
    1. Oczyść obszar roboczy i instrumenty środkami dezaktywującymi RNazy.
    2. Podczas pracy z RNA należy nosić rękawiczki i często zmieniać rękawice.
    3. Do obsługi RNA należy używać wyłącznie tworzyw sztucznych wolnych od RNaz.
  2. Izolowanie całkowitego RNA z pojedynczych neuronów:
    1. Standardowy protokół Trizol do izolacji RNA może być używany do izolowania RNA z pojedynczych neuronów. Na krótko dodać 20% v/v chloroformu do Trizolu, dobrze wymieszać przez krótkie wirowanie.
    2. Umieścić probówki na rotatorze na 10 minut w temperaturze 4 °C. Wirować mieszaninę Trizol-Chloroform w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zebrać fazę wodną i przenieść do świeżej probówki.
    4. Dodać roztwór octanu sodu (pH 5,5) do końcowego stężenia 0,3 M, 100 ng/ml współrecipitantu GlycoBlue i 2,5 objętości 100% etanolu w celu wytrącenia RNA.
    5. Dobrze wymieszać próbki i inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.
    6. Obracać próbki w temperaturze 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a na dnie probówki będzie widoczna mała niebieska osadka.
    7. Usunąć supernatant i przepłukać osad 850 μl 75% lodowatego etanolu o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Ostrożnie usunąć supernatant i suszyć na powietrzu osad RNA przez maksymalnie 7-10 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że RNA nie jest pozostawione na długo do wyschnięcia, ponieważ nadmierne wysuszenie osadu RNA bardzo utrudnia solubilizację.
    9. Po wysuszeniu ponownie zawieś osad RNA w 10 μl wody wolnej od RNAzy i oznacz stężenie RNA.
      UWAGA: Oznaczyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Gdy nie używasz od razu, przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.
  3. Synteza aRNA z pojedynczych neuronów:
    1. Amplifikuj RNA (jedna lub dwie rundy w zależności od celu eksperymentalnego) za pomocą dostępnego na rynku liniowego systemu amplifikacji RNA.
      UWAGA: Całkowite RNA z pojedynczych neuronów wahało się od ~10-60 ng. Oczekiwana wydajność pierwszej rundy amplifikacji wynosi ~100-300 ng, a drugiej rundy amplifikacji to ~0,8-1,5 μg RNA.
  4. Odwrotna transkrypcja RNA:
    1. Aby wygenerować cDNA z aRNA, użyj 1,0 μg aRNA w 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji. W tym celu na rynku dostępnych jest kilka zestawów.

      UWAGA: cDNA zsyntetyzowano zgodnie z protokołem producenta przy użyciu następujących ustawień na termocyklerze.
      5 min przy 25 °C
      30 min przy 42 °C
      5 min przy 85 °C
      Przechowywać w temperaturze 4 °C
    2. Po etapie odwrotnej transkrypcji przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  5. Projektowanie i standaryzacja podkładu:
    Dostępnych jest kilka doskonałych programów do bezpłatnego projektowania podkładów do wzmocnień w czasie rzeczywistym.
    1. Wybierz 18-24 merowe oligonukleotydy, które wytwarzają amplikony 70-110 pz i zsyntetyzuj startery przy użyciu źródeł komercyjnych.
      UWAGA: Dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania należy zaprojektować od dwóch do trzech par starterów. Każdy zestaw starterów musi być standaryzowany metodą qPCR. Pary starterów do przodu i do tyłu, które zostały użyte dla genu CREB1 (Figura 4), są poniżej:

      Zestaw podkładów 1
      Naprzód: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3'
      Rewers: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Zestaw podkładów 2
      Naprzód: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Rewers: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Aby wybrać najlepszy starter do dalszych analiz, należy monitorować wartość Ct i kształt krzywej amplifikacji w qPCR.
      UWAGA: Startery, które dają wartości Ct (próg cyklu) między 10-35 w 40-krotnym amplifikacji i gładkie krzywe podczas fazy wykładniczej PCR, po której następuje gładkie plateau, są optymalne do analiz ekspresji genów.
  6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR):
    Uwaga: Użyj odpowiednich probówek lub płytek, które są kompatybilne z maszyną qPCR.
    1. Rozcieńczyć cDNA do 5x wodą wolną od nukleaz.
    2. Do 2 μl rozcieńczonego cDNA dodać 8 μl głównej mieszaniny qPCR zawierającej 2 μlH2O, 5 μl 2x SYBR Green master mix i 1,0 μl 10 μM (każdy) startera do przodu i do tyłu.
    3. Zamknąć probówki i uszczelnić płytkę po odpipetowaniu cDNA i mieszaniny wzorcowej. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukając i obracając z prędkością 1 500 obr./min przez 30 sekund.
    4. Przejdź do konfiguracji maszyny qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Masa zwierząt wykorzystanych w niniejszym badaniu mieściła się w przedziale 100-200 g. Zgodnie z opisanymi protokołami przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne oraz analizę molekularną neuronów zzwojów brzusznych wyizolowanych od zwierząt o masie od 2-5 g do 200-300 g.

Standaryzacja obróbki proteazą jest istotna dla pomyślnych pomiarów elektrofizjologicznych neuronów w zwojach. Początkowo zastosowano różne stężenia i czasy inkubacji z proteazą (Dispase), rejestrując seryjne potencjały czynn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neuron R15 bierze udział w regulacji układu sercowo-naczyniowego, pokarmowego, oddechowego i rozrodczego30. Cechą charakterystyczną R15 jest regularna rytmiczna aktywność rozstrzeliwania AP. Jak pokazano w sekcji wyników, sparowany zapis R15 i L7 pokazuje, że preparat zwojów zachował aktywność neuronów R15. Neurony R15 i L7 odpowiednio reagowały na Ach. To przygotowanie zwojów można utrzymać do 8-10 godzin, a aktywność elektrofizjologiczną można stale monitorować. W ten sposób można by badać elektrofizjologicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy Fundacji Whitehall za wsparcie finansowe oraz fundusze na rozpoczęcie działalności przez Instytut Badawczy Scripps za przeprowadzenie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2• 2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2• 6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteazaGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% etanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbion AM9515
3 M NaOAc, pH 5,5AmbionAM9740
Woda wolna od nukleazAmbionAM9737
Zestaw do amplifikacji aRNA MessageAmp IIAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
KleszczeNarzędzia do nauki11252-20
NożyczkiFine Science Tools15000-08
Szpilki minutienne ze stali nierdzewnej Fine Science Tools26002-10 lub
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
Wirówka 5430REppendorf5430R Wirówka
7900HT Szybki PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems7900HT Szybki wzmacniacz PCR
BRAMP-01RNPI Elektronika
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Mikro manipulatorPatch StarScientifica
w czasie rzeczywistym

Bibliografia

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza pojedynczego neuronurejestracja elektrofizjologicznaanaliza ekspresji genówtraktowanie proteaząusuwanie osłonki zwojuizolacja RNAilościowa PCRelektrofizjologia wewnątrzkomórkowaizolacja neuronów
Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.