Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Podsumowanie

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Streszczenie

Głównym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie molekularnych podstaw obwodów neuronowych, które rządzą określonym zachowaniem. Po zidentyfikowaniu konkretnych mechanizmów molekularnych można opracować nowe strategie terapeutyczne w celu leczenia nieprawidłowości w określonych zachowaniach spowodowanych chorobami zwyrodnieniowymi lub starzeniem się układu nerwowego. Ślimak morski Aplysia californica dobrze nadaje się do badań komórkowych i molekularnych podstaw zachowania, ponieważ obwody neuronalne leżące u podstaw określonego zachowania można łatwo określić, a poszczególnymi elementami obwodów można łatwo manipulować. Te zalety Aplysia doprowadziły do kilku fundamentalnych odkryć w dziedzinie neurobiologii uczenia się i pamięci. W tym artykule opisano przygotowanie układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych poszczególnych neuronów. Krótko mówiąc, ganglion wypreparowany z układu nerwowego jest wystawiany na działanie proteazy w celu usunięcia osłonki zwojowej tak, że neurony są odsłonięte, ale zachowują aktywność neuronalną, jak u nienaruszonego zwierzęcia. Preparat ten służy do przeprowadzania pomiarów elektrofizjologicznych pojedynczych lub mnogich neuronów. Co ważne, po zarejestrowaniu przy użyciu prostej metodologii, neurony można było wyizolować bezpośrednio ze zwojów w celu analizy ekspresji genów. Protokoły te wykorzystano do przeprowadzenia jednoczesnych zapisów elektrofizjologicznych z neuronów L7 i R15, zbadania ich odpowiedzi na acetylocholinę i ilościowego określenia ekspresji genu CREB1 w izolowanych pojedynczych neuronach L7, L11, R15 i R2 Aplysia.

Wprowadzenie

Ludzki mózg jest niezwykle złożony, z prawie 100 miliardami neuronów i bilionami połączeń synaptycznych. Istnieje prawie taka sama liczba komórek nieneuronalnych, które oddziałują z neuronami i regulują ich funkcję w mózgu. Neurony są zorganizowane w obwody, które regulują określone zachowania. Pomimo postępów w naszym zrozumieniu funkcji mózgu i obwodów neuronalnych, niewiele wiadomo na temat tożsamości elementów obwodów, które kontrolują określone zachowanie. Wiedza na temat tożsamości różnych składników obwodu znacznie ułatwi nam zrozumienie zarówno komórkowych, jak i molekularnych podstaw zachowania oraz pomoże w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych dla za....

Protokół

1. Przygotowanie zwojów brzusznych, pomiary elektrofizjologiczne i izolacja pojedynczych zidentyfikowanych neuronów ze zwoju brzusznego Aplysia californica

1. Utrzymuj Aplysia w akwarium laboratoryjnym z krążącą sztuczną wodą morską (ASW) o temperaturze 16 °C w warunkach 12:12 światło: ciemność.
2. Izolacja zwoju brzusznego.
   1. Znieczulenie zwierząt poprzez wstrzyknięcie 380 mM roztworu MgCl₂ przez 5-10 minut (co odpowiada 30-35% masy ciała zwierzęcia).
   2. Zidentyfikuj zwój brzuszny na podstawie jego położenia w ośrodkowym układzie nerwowym^24,28.
   3. Usunąć zwoje jaj chirurgicznie i natych....

Wyniki

Masa zwierząt wykorzystanych w niniejszym badaniu mieściła się w przedziale 100-200 g. Zgodnie z opisanymi protokołami przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne oraz analizę molekularną neuronów zzwojów brzusznych wyizolowanych od zwierząt o masie od 2-5 g do 200-300 g.

Standaryzacja obróbki proteazą jest istotna dla pomyślnych pomiarów elektrofizjologicznych neuronów w zwojach. Początkowo zastosowano różne stężenia i czasy inkubacji z proteazą (Dispase), rejestrując seryjne potencjały czynn.......

Dyskusja

Neuron R15 bierze udział w regulacji układu sercowo-naczyniowego, pokarmowego, oddechowego i rozrodczego³⁰. Cechą charakterystyczną R15 jest regularna rytmiczna aktywność rozstrzeliwania AP. Jak pokazano w sekcji wyników, sparowany zapis R15 i L7 pokazuje, że preparat zwojów zachował aktywność neuronów R15. Neurony R15 i L7 odpowiednio reagowały na Ach. To przygotowanie zwojów można utrzymać do 8-10 godzin, a aktywność elektrofizjologiczną można stale monitorować. W ten sposób można by badać elektrofizjologicz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aplysia	National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl	SIGMA	S 3014-1KG
KCl	SIGMA	P 9333-500G
CaCl2• 2H2O	SIGMA	C5080- 500G
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP 214-501
NaHCO4	SIGMA	S 6297-250G
HEPES	SIGMA	H 3375-500G
Proteaza	GIBCO	17105-042
Trizol	Ambion	15596-026
Chloroform	MP Biomedicals	2194002
100% etanol	ACROS	64-17-5
GlycoBlue		Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5,5	Ambion	AM9740
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9737
Zestaw do amplifikacji aRNA MessageAmp II	Ambion	AM1751
qScript cDNA SuperMix	Quanta Biosciences	95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
Kleszcze	Narzędzia do nauki	11252-20
Nożyczki	Fine Science Tools	15000-08
Szpilki minutienne ze stali nierdzewnej	Fine Science Tools	26002-10 lub
26002-20
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	Veriti Thermal Cycler
Wirówka 5430R	Eppendorf	5430R Wirówka
7900HT Szybki PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	7900HT Szybki wzmacniacz PCR
	BRAMP-01R	NPI Elektronika
Digidata Converter	Instrutech ITC-18	HEKA ELEKTRONIK
Mikro manipulator	Patch Star	Scientifica

w czasie rzeczywistym