Artykuł metodologiczny

Metoda badania wpływu chemicznie wywołanej niewydolności jajników na wydolność wysiłkową i adaptację serca u myszy

16.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51083

⸱

7 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

Dwa paradygmaty ćwiczeń zostały przetestowane na nowo opracowanym chemicznie indukowanym modelu myszy menopauzalnej, aby zbadać wpływ menopauzy na zdolność do ćwiczeń i adaptację serca do ćwiczeń.

Streszczenie

Ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD) wzrasta u kobiet po menopauzie, jednak rola ćwiczeń jako środka zapobiegawczego dla ryzyka chorób sercowo-naczyniowych u kobiet po menopauzie nie została odpowiednio zbadana. W związku z tym zbadaliśmy wpływ dobrowolnych ćwiczeń na kółkach klatkowych i wymuszonych ćwiczeń na bieżni na adaptację serca u myszy w okresie menopauzy. Najczęściej stosowanym indukowalnym modelem naśladowania menopauzy u kobiet jest gryzoń po owariektomii (OVX). Jednak model OVX ma kilka różnic w stosunku do menopauzy u ludzi. W tym badaniu podaliśmy samicom myszy ditlenek 4-winylocykloheksenu (VCD), który przyspiesza niewydolność jajników jako alternatywny model menopauzy do badania wpływu ćwiczeń na myszy w okresie menopauzy. VCD selektywnie przyspiesza utratę pęcherzyków pierwotnych i pierwotnych, co skutkuje stanem endokrynologicznym, który ściśle naśladuje naturalny postęp od okresu przed menopauzą, przez okres okołomenopauzalny, aż do okresu po menopauzie. Aby określić wpływ ćwiczeń na wydolność wysiłkową i adaptację serca u samic myszy leczonych VCD, zastosowano dwie metody. Po pierwsze, wystawiliśmy grupę myszy leczonych VCD i nieleczonych na dobrowolne koło klatkowe. Po drugie, użyliśmy wymuszonych ćwiczeń na bieżni, aby określić wydolność wysiłkową w oddzielnej grupie myszy leczonych VCD i nieleczonych, mierzonych jako tolerancja na intensywność i wytrzymałość ćwiczeń.

Wprowadzenie

Naturalny początek menopauzy charakteryzuje się wyczerpaniem pierwotnych pęcherzyków jajnikowych poprzez atrezję, co ostatecznie prowadzi do starzenia się jajników. W Stanach Zjednoczonych ponad 30% życia kobiety spędza po menopauzie. W odpowiedzi na pogorszenie funkcji jajników może wystąpić kilka konsekwencji fizjologicznych i psychologicznych, w tym zwiększona otyłość, niestabilność naczyń krwionośnych oraz zaburzenia nastroju lub snu. Ze względu na zwiększoną otyłość/otyłość w porównaniu z odpowiednikami przed menopauzą1,2, kobiety po menopauzie są szczególnie podatne na zespół metaboliczny i związane z nim choroby współistniejące, w tym choroby sercowo-naczyniowe (CVD)3. Co więcej, staje się coraz bardziej oczywiste, że skuteczna rehabilitacja kardiologiczna u pacjentek z chorobami układu krążenia obejmuje regularne ćwiczenia aerobowe, a ćwiczenia zmniejszają zachorowalność i śmiertelność z przyczyn sercowo-naczyniowych u tych osób4,5. Jednak to, jak zmienia się wydolność wysiłkowa podczas przejścia przed menopauzą i po menopauzie, nie zostało dobrze zbadane. Co ważniejsze, rola ćwiczeń fizycznych jako środka zapobiegawczego ryzyka chorób sercowo-naczyniowych u kobiet po menopauzie pozostaje niezwykle słabo zbadana.

Najczęściej używanym indukowalnym modelem do naśladowania menopauzy u kobiet jest gryzoń po owariektomii (OVX). Ostatnio wykazano, że zawodowy związek chemiczny 4-winylocykloheksenu diepoxide (VCD) jest specyficznie ukierunkowany na małe pierwotne i pierwotne pęcherzyki jajnikowe poprzez przyspieszenie naturalnego procesu atrezji, co ostatecznie prowadzi do niewydolności jajników bez oczywistej toksyczności występującej w innych tkankach6. Cykl rujowy myszy leczonych VCD, który jest analogiczny do ludzkiego cyklu miesiączkowego, ustaje w ciągu 2-3 miesięcy po zakończeniu wstrzyknięć VCD, co z kolei powoduje stopniowe wycofywanie estrogenu, naśladując przejście od okresu okołomenopauzalnego do pomenopauzalnego. W ten sposób zwierzę z nienaruszonymi jajnikami jest bardzo zbliżone do naturalnego postępu człowieka przez okres przed menopauzą i po menopauzie7-9. Co więcej, stanowi niechirurgiczną alternatywę dla modelu OVX, zmniejszając powikłania po operacji, takie jak infekcje. W tym badaniu wykorzystaliśmy myszy menopauzalne wywołane VCD, aby zbadać wpływ ćwiczeń na adaptację serca u myszy w okresie menopauzy.

Istnieje kilka przypadków, które sugerują związek między estrogenem a ćwiczeniami na kółkach klatkowych u gryzoni obu płci10-13. Wyczerpanie estrogenów przez chirurgiczny OVX zmniejsza dobrowolną aktywność fizyczną u myszy i szczurów14,15. W tym badaniu zastosowano dwie metody ćwiczeń w celu przetestowania zdolności wysiłkowej myszy menopauzalnych wywołanych VCD. Bieganie po klatce jest ogólnie uważane za rodzaj dobrowolnego ćwiczenia na modelach zwierzęcych i wykonywane, przypuszczalnie, w mniej stresujących warunkach. Jednak bieganie w klatce nie wskazuje na względną zdolność wysiłkową zwierząt, która wymaga od zwierząt ćwiczeń na znacznie wyższym poziomie. Wymuszone ćwiczenia na bieżni zastosowano do określenia wydolności wysiłkowej, mierzonej jako tolerancja na intensywność i wytrzymałość ćwiczeń. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że ćwiczenia w klatce stanowią bodziec do przerostu mięśnia sercowego, a ten przerostowy wzrost jest zależny od płci16. Dlatego zmierzyliśmy również adaptację serca do ćwiczeń w klatce u myszy menopauzalnych wywołanych VCD.

Protokół

Wszystkie eksperymenty, trzymanie i opieka nad zwierzętami były przeprowadzane przy użyciu protokołów, które były zgodne z wytycznymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Arizony, oraz do wytycznych NIH z 2011 roku dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Leczenie dwusydoksydem 4-winylocykloheksenu

  1. Protokół dozowania VCD: W dygestorii chemicznej dodać 0,587 ml VCD do czystej kolby, doprowadzić końcową objętość do 10 ml olejem sezamowym, a następnie wymieszać delikatnie odwracając, przykryć i uszczelnić Parafilmem. Przenieść roztwór do fiolki dozującej, zamknąć ją Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 7 dni. Upewnij się, że wszystkie odczynniki są sterylne.
    1. Użyj oleju sezamowego jako sterownika pojazdu, ponieważ VCD rozpuszcza się w oleju sezamowym. Przechowywać VCD (MW=140,2 g/mol, gęstość=1,09 g/ml) w temperaturze -20 °C.
    2. Protokół wstrzykiwania VCD: W wieku 2 miesięcy ważyć i podawać codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe VCD w temperaturze pokojowej w dawce 160 mg/kg przez 20 kolejnych dni. Myszy kontrolne należy wstrzykiwać w podobny sposób roztwór do przewozu – olej sezamowy o objętości 2,5 ml/kg.
      nuta: W okresie wstrzykiwania należy starać się zmieniać miejsca wstrzyknięć, aby zmniejszyć ryzyko miejscowego zakażenia. Aby obliczyć objętość potrzebną do wstrzyknięcia, należy użyć następującego równania: Masa ciała (g) x kg/1 000 g x 2,5 ml/kg = objętość (ml) roztworu do wstrzyknięcia, co daje około 50 ml/wstrzyknięcie przy użyciu igły 27 G. Ze względu na wielkość igły znieczulenie miejscowe nie jest potrzebne.
    3. Monitorowanie cyklu rujowego: Po zakończeniu okresu wstrzyknięcia należy codziennie monitorować cykle rujowe, pobierając wymazy z pochwy. Unieruchomaj myszy metodą grzbietu. Wprowadzić zakraplacz z 0,2 ml sterylnej soli fizjologicznej do otworu pochwy na głębokość 0,5 cm. Rozetrzyj sól fizjologiczną (3x) i umieść 1 kroplę na czystym szkiełku. Natychmiast oceń próbki pod mikroskopem za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego o jasności 100x.
      nuta: Cytologia pochwy jest określana w celu zapewnienia utraty cykli rowerowych, a tym samym walidacji niewydolności jajników. Rycina 2A ilustruje typową cytologię pochwy w różnych fazach cyklu rujowego u myszy, a mianowicie proestrus, estrus, metestrus, diestrus17-19. Podczas rui komórki obejmują jądrzaste komórki nabłonkowe (ryc. 2A, strzałki wskazują komórki jądrzaste); Podczas rui komórki są głównie zrogowaciałymi komórkami nabłonka płaskonabłonkowego; Metestrus charakteryzuje się mieszanką typów komórek, z przewagą leukocytów; Diestrus jest zdominowany przez leukocyty. Regulacja płaszczyzny ogniskowej może być wymagana w celu wizualizacji komórek i jąder w całej próbce. Jak pokazano na rysunku 2B, typowy cykl rui myszy trwa 4-5 dni. Myszy są uważane za acykliczne po 15 kolejnych dniach w trwałym diestrus. Ciągłe monitorowanie cykli rujowych przez cały okres badania, aby potwierdzić brak cykli rujowych u myszy leczonych VCD.

2. Dobrowolne ćwiczenie na klatce


Wsobne samice myszy C57BL/6 i B6C3F1 w wieku 7 miesięcy są narażone na dobrowolne bieganie w klatce. Trzymanie zwierząt w klatce (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) z nieskrępowanym dostępem do koła klatkowego przez 28 dni.

  1. Konfiguracja wyposażenia: Urządzenie z kołem klatkowym składa się z koła o średnicy 11,5 cm z powierzchnią bieżną o szerokości 5,0 cm, wyposażonego w cyfrowy licznik magnetyczny, który jest aktywowany przez obrót koła. Przed każdym testem jazdy koła należy skalibrować koło klatkowe zgodnie z wytycznymi producenta. Zmierz średnicę wewnętrzną koła jezdnego, oblicz obwód i wprowadź tę wartość do licznika cyfrowego jako rozmiar koła.
    1. Przymocuj komputerową część cyfrowego licznika magnetycznego do stojaka na kółkach za pomocą taśmy.
    2. Przymocuj komputerową część cyfrowego licznika magnetycznego do stojaka na kółkach za pomocą taśmy.
    3. Przymocuj wolny magnes cyfrowego licznika magnetycznego do środkowego pręta po tej samej stronie, co magnes podłączony do komputera, ponownie przyklejając taśmę na tyle, aby chronić magnes przed uszkodzeniem podczas żucia. Magnesy powinny być ustawione w taki sposób, aby każdy obrót koła był rejestrowany przez komputer bez żadnych zakłóceń lub oporu przy pełnym obrocie koła.
      Uwaga: Taśma klejąca została z powodzeniem użyta do przymocowania elementów cyfrowego licznika magnetycznego do koła jezdnego. Oklejanie taśmą powinno być wystarczające, aby całkowicie zakryć magnes i zapobiec uszkodzeniom spowodowanym żuciem przez zwierzę. Magnes powinien być umieszczony jak najbliżej koła, nie utrudniając jego ruchu. Jednak konfiguracja powinna być codziennie monitorowana pod kątem uszkodzeń spowodowanych żuciem i naprawiana w razie potrzeby.
    4. Zamontuj koło do klatki, przesuwając stojak na kółkach przez górne okablowanie klatki dla zwierząt. Przymocuj stojak na kółkach do okablowania klatki za pomocą zacisków do segregatorów.
      Uwaga: Klips powinien znajdować się na górze okablowania, z dala od zwierzęcia. Przeprowadź część komputera i dodatkowy przez okablowanie klatki. Umieść komputer i nadmiar poza zasięgiem zwierzęcia. Można to osiągnąć, umieszczając średniej wielkości plastikową szalkę wagową na okablowaniu klatki, aby przytrzymać komputer i nadmiar.
  2. Ćwiczenie: Dla danego miotu losowo przypisz myszy do siedzącego trybu kontroli lub schematu ćwiczeń. Daj wszystkim zwierzętom wodę i standardową twardą karmę dla gryzoni ad libitum.
    1. Ręcznie rejestruj dzienne wartości przebiegniętego dystansu (km/dzień) i całkowitego czasu spędzonego na biegu (godzina/dzień), podawane przez licznik magnetyczny. Rejestruj wartości odległości i czasu w tym samym 1-godzinnym przedziale czasowym każdego dnia, aby uzyskać dokładne i spójne wartości przez cały 28-dniowy okres ćwiczeń. Wyczyść (wyzeruj) licznik magnetyczny po nagraniu każdego dnia, aby zapewnić dokładne odczyty następnego dnia.
    2. Oblicz średnie wartości odległości i prędkości dla każdej grupy. Obliczaj prędkość na podstawie podanych wartości odległości i czasu każdego dnia dla każdej myszy. Dane mogą być wyświetlane jako średnie dzienne lub tygodniowe dla każdego mierzonego parametru.
  3. Pobieranie tkanek: Pod koniec określonego okresu ćwiczeń należy poddać eutanazji zwierzęta ćwiczące i prowadzące siedzący tryb życia w ciągu 30 minut od wyjęcia z klatek przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu wziewnym. Zważ masę ciała i szybko wytnij serca, mięśnie szkieletowe i jajniki.
    1. W czasie pobierania tkanek należy zamontować i wybarwić pobrane jajniki hemotoksyliną i eozyną (H&E; Rysunek 2C). W powiększeniu policz i sklasyfikuj pęcherzyki jako pierwotne, pierwotne, wtórne lub antralne dla każdego zwierzęcia poddanego VCD i kontrolnego20. Pęcherzyk pierwotny zawiera mały pierwotny oocyt, pojedynczą warstwę spłaszczonych lub płaskonabłonkowych komórek ziarnistych ściśle przeciwnych do oocytu oraz blaszkę podstawną. Pęcherzyk pierwotny definiuje się przez obecność jednej lub więcej prostopadłościennych komórek ziarnistych, które są ułożone w jednej warstwie otaczającej oocyt. Pęcherzyk wtórny zawiera komórki ziarniste, które tworzą wiele warstw wokół oocytu i osłonki. Pęcherzyk antralny charakteryzuje się jamą lub "antrum" zawierającym płyn.
    2. Aby wyciąć serce, wykonaj przyśrodkowe nacięcie po stronie brzusznej i uwidocznij serce po otwarciu przepony. Szybko wyciąć serce u podstawy i umieścić w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby wystarczająco wypłukać resztki krwi komorowej. Odetnij serce z nadmiaru tkanki, zważ całe serce i zamroź w ciekłym azocie.
    3. Umyć wszystkie inne wycięte tkanki zmodyfikowanym lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i zamrozić błyskawicznie w izopentanie schłodzonym ciekłym azocie.

3. Wymuszone ćwiczenie na bieżni

  1. Stosując paradygmat ćwiczeń wymuszonych do pomiaru wydolności wysiłkowej, użyj bieżni i ustaw w następujący sposób:
    1. Umieść siatkę przeciwwstrząsową u podstawy rampy bieżni. Ten generowany szok służy jako bodziec do ćwiczeń. Natężenie i częstotliwość bodźców elektrycznych są kontrolowane ręcznie przez użytkowników. Siatki można włączać i wyłączać indywidualnie dla każdego toru. Całe zbieranie danych odbywa się ręcznie.
    2. Okresowo kalibruj bieżnię zgodnie z wytycznymi producenta.
      1. Upewnij się, że przełącznik na panelu przednim kontrolera bieżni jest ustawiony w pozycji "STOP".
      2. Umieść czujnik prędkości na pasie pasa bieżni1 i bezpiecznie przymocuj nakrętką śrubową w pozycji pokazanej poniżej.
      3. Za pomocą pokrętła na panelu przednim kontrolera bieżni ustaw prędkość na 88.7 m/min Następnie ustaw częstotliwość bodźca elektrycznego na 2 Hz na panelu przednim kontrolera bieżni.
      4. Naciśnij przycisk "ODOMETER RESET", aby zainicjować procedurę kalibracji.
        nuta: W projekcie eksperymentalnym należy uwzględnić grupy kontrolne prowadzące siedzący tryb życia lub niewykonujące ćwiczeń. Grupa prowadząca siedzący tryb życia jest dopasowana wiekowo do grupy ćwiczącej. Wcześniej wykazaliśmy, że trzymanie myszy prowadzących siedzący tryb życia indywidualnie w klatkach o takiej samej wielkości jak myszy ćwiczone nie wpływało na interesujące parametry w porównaniu z myszami prowadzącymi siedzący tryb życia trzymanymi z rodzeństwem. Dlatego myszy prowadzące siedzący tryb życia trzymano z rodzeństwem w tym samym pomieszczeniu, co myszy ćwiczone.
  2. Aklimatyzacja: Codziennie aklimatyzuj myszy na bieżni 3-7 dni przed eksperymentem. Aby to zrobić, umieść myszy w bieżni z nieruchomym paskiem i wyłączonymi kratkami amortyzującymi, ale z włączonym silnikiem paska (hałas). Pozostaw myszy w spokoju na co najmniej 15 minut.
  3. Rozgrzewka: Kroki rozgrzewki używane w tym protokole są następujące:
    1. Umieść każdą mysz na bieżni. Wyłącz siatkę przeciwwstrząsową i zwiększ prędkość taśmy do 4 m/min na 15 minut.
    2. Włącz siatkę przeciwwstrząsową i utrzymuj prędkość taśmy na poziomie 4 m/min przez dodatkowe 10 minut.
  4. Schematy treningu fizycznego
    1. Po rozgrzaniu pozostaw założone kratki amortyzujące i zwiększ prędkość taśmy do 5 m/min przez 15 minut.
    2. Zwiększ prędkość taśmy do 15 m/min na dodatkowe 15 minut.
    3. Po treningu przenieś myszy z powrotem do klatek.
      Uwaga: W tym badaniu trening fizyczny był wykonywany codziennie przez 1 tydzień.
    4. Schemat ćwiczeń ostrych: Schemat ćwiczeń ostrych ma na celu określenie krótko- i długoterminowych skutków ekstremalnego stresu związanego z ćwiczeniami.
      1. Po rozgrzaniu zwiększ prędkość taśmy z 5 m/min do 10, 15, 20, 25 i 30 m/min w odstępach 10-minutowych.
        Uwaga: Przerwij ćwiczenia, jeśli myszy nie są w stanie kontynuować biegu lub wykazują oznaki wyczerpania lub niepokoju. W naszym badaniu większość zwierząt została zatrzymana przy prędkości 25 m/min i żadne zwierzę nie przekroczyło etapu 30 m/min.
      2. Przetestuj każdą mysz trzy razy, pozostawiając 2-3 dni między każdym testem. Obliczanie średnich wartości ze wszystkich sesji ćwiczeń dla każdej myszy.
    5. Schemat ćwiczeń wytrzymałościowych: Protokół ćwiczeń wytrzymałościowych ma na celu trenowanie myszy w celu przedłużonej ekspozycji na bodziec ćwiczeń na bieżni. Ten rodzaj protokołu testuje zdolność do tolerowania długoterminowych skutków umiarkowanego stresu związanego z ćwiczeniami.
      1. Zacznij od prędkości taśmy określonej w okresie nagrzewania, 4 m/min.
      2. Stopniowo zwiększaj prędkość taśmy o 1 m/min, aż do osiągnięcia końcowej prędkości 20 m/min. Całkowity czas trwania typowego protokołu badania wynosi 50 minut.
      3. Po zakończeniu ćwiczeń przenieś myszy z powrotem do klatek.
        Uwaga: Unika się biegania myszy do wyczerpania. Jeśli w dowolnym momencie eksperymentu mysz wykazuje oznaki wyczerpania, wyłącz siatkę uderzeniową i pozwól myszy odpocząć i dojść do siebie.

4. Dane i analiza statystyczna

  1. Przedstaw wyniki jako średnią ± SEM i użyj dwukierunkowej ANOVA (grupa terapeutyczna i ćwiczenia jako główne czynniki), a następnie test post hoc Studenta-Newmana-Keulsa lub test t studenta w celu porównania różnic między średnimi wartościami.
  2. Określ procentową zmianę masy serca podczas ćwiczeń, porównując masę każdego ćwiczonego zwierzęcia ze średnią masą serca w grupie prowadzącej siedzący tryb życia. Różnica w masie serca jest następnie wyrażona jako procentowa zmiana w stosunku do zwierząt prowadzących siedzący tryb życia dla każdego zwierzęcia. Wartości p wynoszące <0,05 są uważane za statystycznie istotne.

Wyniki

Typowy protokół eksperymentalny, taki jak zastosowany w niniejszym badaniu, przedstawiono na Rysunku 1. Po 20 kolejnych dniach leczenia VCD wykonano cytologię pochwy, aby określić obecność lub brak cykliczności u myszy wstrzykniętych VCD; monitorowano również myszy wstrzyknięte placebo. Stadium cyklu rujowego określano na podstawie proporcji komórek nabłonka, zrogowaciałych komórek nabłonka oraz leukocytów w rozmazie z pochwy (Rysunek 2A). Obecność wyłącznie zrogowaciałych komórek nabłonka wskazywała, że mysz znajduje się w rui, a zatem nadal zachowuje cykliczność. Cykl rujowy u myszy trwa zazwyczaj 4 dni, dlatego zwierzęta po wstrzyknięciu VCD uznawano za acykliczne po 15 dniach utrzymującego się diestrusu, w którym cytologia pochwy wykazała przewagę leukocytów (Rysunek 2A). Cykl rujowy myszy traktowanych VCD stał się nieregularny, a następnie ustał w ciągu 2-3 miesięcy od rozpoczęcia iniekcji VCD (Rysunek 2B). Tkanka jajnika po podaniu VCD wykazała znaczną atrofię w porównaniu z grupą kontrolną. Przy dużym powiększeniu widoczne jest całkowite wyczerpanie mieszyków pierwotnych i pierwotnych-prymordialnych (Rysunek 2C).

Aby przetestować wpływ niewydolności jajników indukowanej VCD na wydolność wysiłkową, myszy w wieku 7 miesięcy, traktowane VCD lub wehikułem (dwie linie: C57BL/6 i B6C3F1), przydzielono losowo do grup siedzących lub grup ćwiczących na kołowrotku klatkowym od 4 do 6 tygodni po zakończeniu cyklu podawania preparatu (Rysunek 1). W ciągu 4-tygodniowego okresu ćwiczeń codziennie rejestrowano czas i dystans dla każdego ćwiczącego zwierzęcia. Średnie tygodniowe wartości dziennego biegania dla dystansu, czasu i prędkości przedstawiono na Rysunku 3 dla myszy C57BL/6 traktowanych wehikułem lub VCD. Nie zaobserwowano istotnych różnic w wydolności wysiłkowej, mierzonej średnim dziennym czasem, dystansem i prędkością na kołowrotku klatkowym, pomiędzy grupami traktowanymi VCD a grupami traktowanymi wehikułem w żadnej z linii myszy (C57BL/6 lub B6C3F1) (Rysunek 4A). Obliczone prędkości biegania na kołowrotku stopniowo wzrastały w ciągu 4-tygodniowego okresu biegania, co wykazano wcześniej16, lecz nie różniły się one istotnie pomiędzy grupami eksperymentalnymi. Badania te wskazują, że wpływ niewydolności jajników indukowanej VCD na dobrowolne ćwiczenia na kołowrotku klatkowym utrzymuje się co najmniej w dwóch liniach myszy.

Po zakończeniu protokołu dobrowolnego wysiłku fizycznego na kołowrotku w klatce zarejestrowano morfometrię ciała, a następnie szybko wycięto i zważono serca. Wykazaliśmy wcześniej, że dobrowolny wysiłek na kołowrotku w klatce indukuje wzrost masy serca16. W niniejszej pracy wykazujemy również przerost serca w odpowiedzi na wysiłek na kołowrotku, mierzony jako bezwzględna masa serca (HW) oraz masa serca znormalizowana do długości piszczeli (TL) (Tabela 1). Bezwzględna masa serca oraz stosunek HW/TL były istotnie większe u myszy traktowanych nośnikiem oraz VCD w porównaniu z grupą osiadłą. Jednakże, po dobrowolnym wysiłku na kołowrotku w klatce nie stwierdzono mierzalnych różnic w przerostie serca pomiędzy myszami kontrolnymi a myszami z indukowaną przez VCD niewydolnością jajników.

Następnie wykorzystano przymusowe bieganie na bieżni w celu określenia wydolności wysiłkowej. Najpierw poddano myszy protokołowi o wysokiej intensywności, w którym średnia prędkość była zwiększana stopniowo co 10 min aż do wyczerpania. Średnio maksymalna prędkość myszy traktowanych nośnikiem wynosiła 26.7± 0.95 m/min, a maksymalna prędkość myszy traktowanych VCD wynosiła 28±1.4 m/min przed wystąpieniem wyczerpania. Do oceny wytrzymałości zastosowano bieganie o niższej intensywności z prędkością 20 m/min (około 80% prędkości maksymalnej). Jak pokazano na Rysunku 4B, nie stwierdzono istotnych różnic w wydolności wysiłkowej o wysokiej lub niskiej intensywności między grupą traktowaną nośnikiem a grupą traktowaną VCD, co wskazuje, że niewydolność jajników wywołana przez VCD nie miała wpływu na wydolność wysiłkową myszy.

Podsumowując, menopauza wywołana leczeniem VCD nie wpływa ani na zdolność do dobrowolnego lub wymuszonego biegania, ani na adaptacyjną odpowiedź serca na wysiłek fizyczny.

Schemat czasowy niewydolności jajników wywołanej VCD w miesiącach wraz ze szczegółami protokołu ćwiczeń.
Rysunek 1. Podawanie VCD i protokół eksperymentalny. Myszy otrzymywały VCD (160 mg/kg) lub olej sezamowy (kontrola nośnika) począwszy od 2. miesiąca życia przez 20 kolejnych dni. Po iniekcjach VCD lub nośnika monitorowano cykle rujowe i określano cykliczność zgodnie z opisem w sekcji Metody. Utrata funkcji jajników nastąpiła w ciągu 60-90 dni i została potwierdzona za pomocą cytologii pochwy. W 7. miesiącu życia myszy poddano dobrowolnym ćwiczeniom na kołowrotku w klatce przez 4 tygodnie lub zastosowano protokół ćwiczeń na bieżni.

Fazy cyklu rujowego: proestrus, estrus, metestrus, diestrus z mikroskopią komórkową; wykres długości cyklu.
Rysunek 2. Niewydolność jajników indukowana VCD u myszy. A: Cytologia niebarwionego wymazu z pochwy myszy po wstrzyknięciu nośnika, przedstawiająca cztery fazy cyklu rujowego: 1) proestrus, składający się głównie z jądrowych komórek nabłonkowych; 2) estrus, charakteryzujący się obecnością bezjądrowych komórek rogowatych; 3) metestrus, składający się z jądrowych komórek nabłonkowych (strzałki), bezjądrowych rogowatych komórek nabłonkowych (strzałki) oraz leukocytów; 4) diestrus, składający się głównie z leukocytów. B: Średnia długość (dni) cyklu rujowego w grupach po wstrzyknięciu nośnika i VCD. Jeden cykl mierzono od pierwszego dnia estrusu do pierwszego dnia kolejnego okresu estrusu. Cytologię pochwy rozpoczęto około 6 tygodni po rozpoczęciu iniekcji. Cykle rujowe zwierząt po wstrzyknięciu VCD stały się nieregularne w porównaniu z zwierzętami po wstrzyknięciu nośnika, a po 12 cyklach estrusu cytologia wszystkich zwierząt po wstrzyknięciu VCD nie wskazywała już na cykliczność. C: Barwienie H&E tkanki jajnika w wieku 8 miesięcy. Przekroje o grubości 5μm wykonane dla myszy traktowanych nośnikiem (panel lewy) i VCD (panel prawy) przy powiększeniu 20X (panel górny) i 200X (panel dolny). Tkanka jajnika przy powiększeniu 200X  wykazuje większą liczbę pęcherzyków u myszy traktowanych nośnikiem w porównaniu do myszy traktowanych VCD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres równowagi statycznej; wykres danych dotyczących dystansu, czasu i prędkości; analiza tygodniowa; badanie pojazdu vs VCD.
Rycina 3. Wyniki aktywności dobrowolnej na kołowrotku u samic myszy C57Bl/6J traktowanych pojazdem lub VCD. Panel lewy: Średni dystans biegu (km/day) dla każdego 1-tygodniowego okresu w ciągu 4-tygodniowego okresu badania. Panel środkowy: Średni czas biegu (hr/day) dla każdego 1-tygodniowego okresu w ciągu 4-tygodniowego okresu badania. Panel prawy: Średnia prędkość biegu (km/hr) dla każdego 1-tygodniowego okresu w ciągu 4-tygodniowego okresu badania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe danych behawioralnych; dystans, czas, prędkość; C57Bl/6J, B6C3F1; pojazd vs. leczenie VCD.
Rycina 4. Wyniki aktywności na dobrowolnym kole w klatce i bieżni u myszy traktowanych pojazdem oraz VCD. A: (Panel górny) Średni dystans przebiegnięty (km/dobę) i czas spędzony na kole (godz/dobę) dla każdego 24 h w ciągu 4-tygodniowego okresu badania dla myszy C57BL/6. (Panel dolny) Średni dystans przebiegnięty (km/dobę) i czas spędzony na kole (godz/dobę) dla każdego 24 h w ciągu 4-tygodniowego okresu badania dla myszy B6C3F1. B: Parametry biegu na bieżni dla myszy C57BL/6. Maksymalny czas (Panel górny) i maksymalna prędkość (Panel dolny) przy zastosowaniu protokołów szczegółowo opisanych w sekcji metod.

Dyskusja

Zarówno ćwiczenia na kole w klatce, jak i ćwiczenia na bieżni były stosowane w naszych poprzednich badaniach16,21,22. Wszystkie zwierzęta są trzymane w dedykowanych salach do ćwiczeń, aby zminimalizować zakłócenia środowiskowe lub ludzkie. Każde zaburzenie rytmu biologicznego zwierząt może znacząco wpłynąć na wydajność wysiłkową zwierząt. W związku z tym cała opieka nad zwierzętami, monitorowanie i rejestrowanie wydajności oraz ćwiczenia powinny być wykonywane w tych samych codziennych ramach czasowych. Badacze powinni dążyć do uniknięcia dodatkowego stresu u zwierząt poprzez stosowanie środków ostrożności, takich jak ograniczanie czasu ekspozycji na stres i przykrywanie klatek, gdy jest to właściwe.

Ćwiczenie z kołem klatkowym

Podczas przygotowywania urządzenia z kołem klatkowym, koło powinno być łatwo dostępne, aby mysz mogła je zamontować i wyjąć. Na dnie klatki powinna być minimalna ściółka, aby myszy nie zagnieżdżały się wokół koła i nie utrudniały swobodnego ruchu koła. Czujnik magnetyczny umieszczono na nieruchomej części koła, a magnes przymocowano do wolnego koła, tak aby zliczać każdy obrót koła podczas ćwiczeń myszy. Urządzenie rejestrujące przymocowane do czujnika magnetycznego powinno być umieszczone nad drucianą pokrywą klatki, a wszystkie odsłonięte przewody muszą być zaklejone taśmą lub trzymane w miejscu niedostępnym dla myszy, aby zapewnić barierę przed uszkodzeniami spowodowanymi żuciem. Magnes i czujnik magnetyczny zostały również przyklejone taśmą do odpowiednich konstrukcji, aby zapobiec zarówno uszkodzeniom, jak i niepożądanemu ruchowi. Podczas codziennego zbierania danych wszystkie zaklejone taśmą przewody muszą być dokładnie sprawdzone, aby upewnić się, że przewody pozostają nienaruszone i powinny być w razie potrzeby przetarte. Ponieważ myszy mogą potrzebować kilku dni, aby zaaklimatyzować się w nowym środowisku i zacząć regularnie ćwiczyć, rejestrowanie danych powinno być dostosowane do każdego zwierzęcia z osobna. Chociaż zwierzęta mają tendencję do spędzania wielu godzin na kierownicy, większość biegania odbywa się w nocy. Dlatego niektóre zwierzęta mogą wykazywać wysoką wydajność, nawet jeśli wydają się uśpione w ciągu dnia. Co więcej, nierzadko zdarza się, że niektóre zwierzęta wykazują ograniczone bieganie po klatce. Zazwyczaj aktywność kół klatkowych, która wynosi średnio 1 km/dzień lub mniej, jest wynikiem losowej aktywności klatki i nie jest związana z żadnym znaczącym bodźcem biegowym. W związku z tym zwierzęta, których parametry biegu wynoszą 1 km/dzień lub 1 godzinę/dzień lub mniej, powinny być wyłączone z końcowej analizy danych, które nie wybiegają.

W zależności od konkretnych celów indywidualnego badania i szczepów zaangażowanych myszy, długość ćwiczeń może być modyfikowana. Nasze poprzednie badanie wykazało, że w przypadku obu szczepów myszy biorących udział w badaniu, średnia prędkość biegania po kole i czas trwania ćwiczeń na kole klatkowym stopniowo zwiększały się w czasie i ustabilizowały się przez 4 tygodnie.

Bieganie po klatce to rodzaj dobrowolnego ćwiczenia na modelach zwierzęcych, które jest ogólnie uważane za wykonywane w mniej stresujących warunkach. W przeciwieństwie do ćwiczeń na bieżni, w których można ustawić pewne parametry, całe bieganie w klatce testowej jest dobrowolne i łatwo ulega wpływom wskazówek środowiskowych lub behawioralnych. W związku z tym zazwyczaj unika się porównań między różnymi ustawieniami eksperymentalnymi, chyba że używa się dużej liczby grup eksperymentalnych. Inne potencjalne obszary badań, które mogą skorzystać z tego typu paradygmatu ćwiczeń, to badania, które obejmują reakcje behawioralne z konsekwencjami fizjologicznymi, takie jak neuronauka poznawcza. W przypadku badań wykorzystujących paradygmat dobrowolnego koła klatkowego, najbardziej krytycznymi krokami są ustawienie klatki i monitorowanie czynności ćwiczeniowych.

Ćwiczenia na bieżni

Kroki aklimatyzacyjne są niezbędne, aby przygotować zwierzęta do protokołu ćwiczeń na bieżni. W zależności od konkretnego celu danego badania, czas trwania okresu aklimatyzacji może się różnić. W tym badaniu wybrano okres jednego tygodnia, aby umożliwić zwierzętom zaaklimatyzowanie się do aparatu bieżni i hałasu motorycznego w klatce, okresy rozgrzewki są ważnym krokiem w schemacie treningu fizycznego. Podobnie jak w przypadku ludzkich odpowiedników, myszy muszą zostać rozgrzane przed rozpoczęciem intensywnych ćwiczeń, aby uniknąć obrażeń i potencjalnych artefaktów danych. W tym badaniu uruchomiliśmy taśmę przy najniższej możliwej prędkości (4 m/min) przy wyłączonych kratkach amortyzatorów na 15 minut. Wszystkie myszy biorące udział w tym procederze zaczęły biegać po taśmie i z niej schodzić. Następnie włączono siatki uderzeniowe, a prędkość taśmy utrzymano na poziomie 4 m/min. Aby uniknąć nadmiernego stresu myszy, ustawiamy porażenie prądem na łagodnym poziomie (1 Hz). W ciągu kilku dni wszystkie myszy przystosowały się do pasa bieżni.

Czas trwania biegu, jak również przyspieszenie mogą być również dostosowane do każdego projektu eksperymentalnego. Zalecane przyspieszenie początkowe wynosi 1 m/min. Pasy bieżni myszy wykazujących oznaki wyczerpania należy natychmiast wyłączyć. Zazwyczaj oznaki wyczerpania wykazywane przez myszy na bieżni są następujące:

  1. Ciągła ekspozycja na siatkę uderzeniową przez >5-10 sekund,
  2. Utrata zdolności biegowej skutkująca narażeniem na prąd >5x podczas jednego schematu ćwiczeń oraz
  3. Utrata zdolności biegowej skutkująca narażeniem na wstrząsy w siatce >2 sekundy co najmniej 3 razy podczas jednego schematu ćwiczeń.

Podane powyżej wartości należy traktować przede wszystkim jako wytyczne dla konkretnego eksperymentu. Parametry te należy określić dla każdego protokołu ćwiczeń, ponieważ różnią się one w zależności od szczepu myszy, eksperymentu i badacza.

W przeciwieństwie do ćwiczeń na kole klatkowym, badania na bieżni muszą być powtarzane kilka razy, aby wyeliminować wpływ czynników środowiskowych i biologicznych na wydajność biegu. Nierzadko można zaobserwować wahania wydajności biegowej między testami nawet w przypadku tego samego zwierzęcia. Ponieważ każdy schemat ćwiczeń naraża biegające myszy na stres, konieczne jest odpowiednie odstępy między testami. Z naszego doświadczenia wynika, że 2-3 dni odpoczynku między każdym testem były wystarczające, aby myszy mogły dojść do siebie.

Podobnie jak ćwiczenia na bieżni dla ludzi, prędkość ćwiczeń wytrzymałościowych najlepiej określa tętno lub nasycenie krwi tlenem, co jest technicznie trudnym wyczynem w badaniach na myszach. Najważniejszym etapem badań na bieżni jest określenie wyczerpania, które zwykle różni się u poszczególnych myszy i zostało ustalone na 80% maksymalnej prędkości. Z naszego własnego doświadczenia wynika, że zapis wyników może się znacznie różnić między poszczególnymi badaczami, ponieważ kryteria wyczerpania są w większości subiektywne. W związku z tym kluczowe znaczenie ma konsekwentne stosowanie tych samych kryteriów podczas nagrywania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NIH (HL 098256), przez National and Mentored Research Science Development Award (K01 AR052840) i Independent Scientist Award (K02 HL105799) od NIH przyznaną J.P. Konhilas oraz Interdisciplinary Training Grant in Cardiovascular Sciences (HL007249). Wsparcie otrzymano od Sarver Heart Center na Uniwersytecie Arizony oraz od Fundacji Stevena M. Goottera.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-winylocykloheksen-diepoxide (VCD)SigmaV-3630
Koło o średnicy 11,5 cm z powierzchnią bieżniczną o szerokości 5,0 cmPetsmartmodel 6208
Cyfrowy licznik magnetycznySigma Sportmodel BC 600
Ćwiczenie na bieżniColumbus Instrumentsmodel 1055SDRM

Bibliografia

  1. Lindheim, S. R., et al. Comparison of estimates of insulin sensitivity in pre- and postmenopausal women using the insulin tolerance test and the frequently sampled intravenous glucose tolerance test. J. Soc. Gynecol. Invest. 1, 150-154 (1994).
  2. Dubnov-Raz, G., Pines, A., Berry, E. M. Diet and lifestyle in managing postmenopausal obesity. Climacteric. 10 Suppl 2, 38-41 (2007).
  3. Grundy, S. M. Metabolic syndrome: connecting and reconciling cardiovascular and diabetes worlds. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1093-1100 (2006).
  4. Sharma, S., Firoozi, S., McKenna, W. J. Value of exercise testing in assessing clinical state and prognosis in hypertrophic cardiomyopathy. Cardiol. Rev. 9, 70-76 (2001).
  5. Guyatt, G. H., Devereaux, P. J. A review of heart failure treatment. Mt. Sinai. J. Med. 71, 47-54 (2004).
  6. Mayer, L. P., et al. Long-term effects of ovarian follicular depletion in rats by 4-vinylcyclohexene diepoxide. Reprod. Toxicol. 16, 775-781 (2002).
  7. Mayer, L. P., Devine, P. J., Dyer, C. A., Hoyer, P. B. The follicle-deplete mouse ovary produces androgen. Biol. Reprod. 71, 130-138 (2004).
  8. Lohff, J. C., Christian, P. J., Marion, S. L., Hoyer, P. B. Effect of duration of dosing on onset of ovarian failure in a chemical-induced mouse model of perimenopause. Menopause. 13, 482-488 (2006).
  9. Wright, L. E., et al. Comparison of skeletal effects of ovariectomy versus chemically induced ovarian failure in mice. J. Bone Miner Res. 23, 1296-1303 (2008).
  10. Ogawa, S., Chan, J., Gustafsson, J. A., Korach, K. S., Pfaff, D. W. Estrogen increases locomotor activity in mice through estrogen receptor alpha: specificity for the type of activity. Endocrinology. 144, 230-239 (2003).
  11. Roy, E. J., Wade, G. N. Role of estrogens in androgen-induced spontaneous activity in male rats. J. Comp. Physiol. Psychol. 89, 573-579 (1975).
  12. Fahrbach, S. E., Meisel, R. L., Pfaff, D. W. Preoptic implants of estradiol increase wheel running but not the open field activity of female rats. Physiol. Behav. 35, 985-992 (1985).
  13. Morgan, M. A., Pfaff, D. W. Effects of estrogen on activity and fear-related behaviors in mice. Horm. Behav. 40, 472-482 (2001).
  14. Gorzek, J. F., et al. Estradiol and tamoxifen reverse ovariectomy-induced physical inactivity in mice. Med. Sci. Sports Exerc. 39, 248-256 (2007).
  15. Kadi, F., et al. The effects of physical activity and estrogen treatment on rat fast and slow skeletal muscles following ovariectomy. J. Muscle Res. Cell Motil. 23, 335-339 (2002).
  16. Konhilas, J. P., et al. Sex modifies exercise and cardiac adaptation in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 2768-2776 (2004).
  17. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 4, (2009).
  18. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Res. B. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
  19. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. , (2012).
  20. McKee, L. A., et al. Sexually dimorphic myofilament function and cardiac troponin I phosphospecies distribution in hypertrophic cardiomyopathy mice. Arch. Biochem. Biophys. 535, 39-48 (2013).
  21. Konhilas, J. P., et al. Exercise can prevent and reverse the severity of hypertrophic cardiomyopathy. Circ. Res. 98, 540-548 (2006).
  22. Perez, N. J., Chen, H., Regan, J. A., Emert, A., Constantopoulos, E., Lynn, M., Konhilas, J. P. The impact of chemically-induced ovarian failure on voluntary cage wheel exercise and cardiac adaptation in mice. Compar. Med. In press, (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

leczenie VCDcytologia pochwyaktywno na ko owrotkuwymuszony wysi ek na bie nicykl rujowyp cherzyki jajnikowemodel menopauzy

Powiązane artykuły