Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Podsumowanie

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Streszczenie

Monitorowanie komunikacji komórkowej za pomocą mikroskopii wielofotonowej tkanek głębokich jest kluczem do zrozumienia losu komórek odpornościowych w grubych próbkach tkanek i narządach w zdrowiu i chorobie. Kontrolując wzorzec skanowania w mikroskopii wielofotonowej i stosując odpowiednie algorytmy numeryczne, opracowaliśmy podejście oparte na oświetleniu paskowym, które umożliwiło nam osiągnięcie 3-krotnie lepszej rozdzielczości osiowej i lepszego stosunku sygnału do szumu, tj. kontrastu, na głębokości ponad 100 μm w tkance silnie rozpraszającej narządów limfatycznych w porównaniu ze standardową mikroskopią wielofotonową. Szybkość akwizycji, a także efekty fotowybielania i fotouszkodzeń były podobne do standardowej techniki opartej na fotomnożniku, natomiast głębia obrazowania była nieco mniejsza ze względu na zastosowanie detektorów pola. Stosując podejście pasiastego oświetlenia, jesteśmy w stanie zaobserwować dynamikę odkładania się kompleksu immunologicznego na wtórnych pęcherzykowych komórkach dendrytycznych – na poziomie kilku cząsteczek białka w centrach rozrodczych.

Wprowadzenie

Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (TPLSM), z jej zaletami dla obrazowania tkanek głębokich związanych z ultra-krótkim impulsowym wzbudzeniem w podczerwieni¹, zrewolucjonizowała nasze spojrzenie na procesy życiowe na poziomie pojedynczej komórki, ujawniając wzorce ruchliwości i interakcji różnych podzbiorów komórek u żywych zwierząt^2-5. Jednak obecna technologia jest nadal niewystarczająca, aby wyjaśnić mechanizmy funkcji i dysfunkcji narządów jako warunek wstępny do opracowania nowych strategii terapeutycznych, ponieważ dostarcza jedynie skąpych informacji na temat molekularnych podstaw odpowiedzi komórkowej w tkankach w zdrowiu i chorobie. Obecna technologia umożliwia jedynie okno przestrzenne o wielkości kilkuset mikronów ze względu na wpływ rozpraszania i zniekształceń czoła fali na rozdzielczość przestrzenną i stosunek sygnału do szumu⁶, które są szczególnie widoczne w bardzo zwartych tkankach dorosłych zwierząt. Te efekty rozpraszania i zniekształceń czoła fali są spowodowane wysoce niejednorodnym i anizotropowym rozkładem współczynnika załamania światła w tkance, co prowadzi w pierwszym kroku do zależnego od głębokości pogorszenia rozdzielczości przestrzennej 3D, a ostatecznie do całkowitej utraty sygnału pochodzącego z fotonów wzbudzenia balistycznego, tj. utraty stosunku sygnału do szumu. Jeśli chodzi o bionaukowe i biomedyczne zastosowania tkanek głębokich, oznacza to, że obecna technologia nie jest w stanie jednoznacznie ujawnić komunikacji komórkowej, ponieważ słaba rozdzielczość doprowadziłaby do fałszywie dodatnich interakcji, podczas gdy spadek stosunku sygnału do szumu spowodowałby, że system przeoczyłby niektóre interakcje między ciemnymi strukturami.

Aby jednoznacznie wykrywać interakcje komórkowe w dynamiczny sposób, potrzebna jest znacznie lepsza rozdzielczość przestrzenna głęboko w tkance. Wprowadzane obecnie potężne techniki nanoskopowe oparte na specjalnych algorytmach numerycznych, np. podejścia do oświetlania struktury, na zubożeniu pierwszego stanu wzbudzonego, np. STED, RESOLFT, lub na lokalizacji molekuł, np. dSTORM, PALM, znalazły wiele zastosowań w komórkach stałych, jak również w żywych hodowlach komórkowych⁷. Jednak, aby rozszerzyć te zastosowania na skrawki tkanek, żywe tkanki i organizmy, musimy jeszcze pokonać poważne trudności techniczne. Wzbudzenie dwufotonowe STED o różnych długościach fal, a także o pojedynczej długości fali (sw2PE-STED) do wzbudzenia i emisji wymuszonej zostało zastosowane w celu poprawy rozdzielczości bocznej w wycinkach mózgu⁸ lub w sztucznych matrycach z osadzonymi komórkami⁹, odpowiednio, przy tej samej rozdzielczości osiowej co standardowy TPLSM. Korzystając z jednofotonowego STED, można było zobrazować dynamikę kolców dendrytycznych na powierzchni kory mózgowej (do głębokości 10-15 μm) u żywej myszy Thy1 EGFP w rozdzielczości 67 nm¹⁰. Wszechstronnym narzędziem do biologii rozwoju jest wieloogniskowa mikroskopia ze światłem strukturalnym, która zapewnia dwukrotnie lepszą rozdzielczość 2D. Technika ta może być jednak stosowana tylko w organizmach o niskiej skłonności do rozpraszania światła, takich jak zarodki danio pręgowanego¹¹. Żadna z tych technik nie może być jednak zastosowana w tkankach o dużym rozproszeniu dorosłych zwierząt w odległości kilkuset mikrometrów, które są kluczowymi modelami dla badań biomedycznych i klinicznych chorób rozpoczynających się po urodzeniu.

Niezależnie od przybliżenia użytego do obliczenia kształtu czoła fali ograniczonej dyfrakcją, tj. funkcji rozproszenia punktowego (PSF), po ustawieniu ostrości przez soczewkę, szerokość PSF wzdłuż osi optycznej (rozdzielczość osiowa) jest co najmniej trzy razy większa niż szerokość PSF prostopadła do osi optycznej (rozdzielczość boczna)¹². Zniekształcenia czoła fali różnego rzędu mierzone za pomocą współczynników Zernike'a znacznie modyfikują kształt czoła fali skupionej fali elektromagnetycznej w obrazowaniu tkanek głębokich, prowadząc do znacznie większych PSF, zwłaszcza wzdłuż osi optycznej^13-15. W związku z tym zarówno prawa dyfrakcyjne, jak i efekty zniekształceń czoła fali wskazują na rozdzielczość wzdłuż osi optycznej jako czynnik ograniczający w obrazowaniu tkanek głębokich. Podczas gdy techniki nanoskopii koncentrują się wyłącznie na przeciwdziałaniu granicom dyfrakcji, do obrazowania przyżyciowego o wysokiej rozdzielczości potrzebna jest technologia, która poprawia rozdzielczość osiową i kontrast poprzez przeciwdziałanie efektom dyfrakcji i zniekształceń czoła fali. Idealnie byłoby, gdyby technika ta była również wystarczająco szybka, aby umożliwić monitorowanie dynamiki komórkowej.

Korekcja aberracji PSF i utraty kontrastu w czasie rzeczywistym za pomocą optyki adaptatywnej w TPLSM była intensywnie badana i ulepszana w ciągu ostatniej dekady^13,14,16-18 i dlatego jest to obecnie najlepszy dostępny wybór, prowadzący do lepszego zarządzania fotonami wzbudzenia balistycznego¹⁴. Mimo to, ze względu na fakt, że większość podejść do korekcji czoła fali stosowanych w optyce adaptatywnej jest iteracyjna i że muszą być powtarzane dla małych obszarów (kilka 10 x 10^μm2) ze względu na wysoką niejednorodność indeksu załamania światła w tkance, szybkość akwizycji jest znacznie niższa niż jest to konieczne do obrazowania ruchliwości komórek i komunikacji. Co więcej, fizyczna granica TPLSM ulepszonego w optyce adaptywnej jest nadal określana przez dyfrakcję.

Przestrzenna modulacja oświetlenia (SPIN) i modulacja czasowa po stronie detekcji (SPADE) zostały teoretycznie zaproponowane do zastosowania w laserowej mikroskopii skaningowej w celu poprawy rozdzielczości. Ich praktyczne zastosowanie w obrazowaniu przyżyciowym nie zostało jeszcze wykazane¹⁹.

Podsumowując, istnieje duże zapotrzebowanie na rozwój technologii, które poprawiają rozdzielczość obrazowania tkanek głębokich u żyjących dorosłych zwierząt. W niniejszej pracy uzyskujemy przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia poprzez sterowanie procesem skanowania w wielowiązkowej laserowej mikroskopii skaningowej z wielowiązkowym oświetleniem pasiastym (MB-SI-MPLSM)²⁰. W przeciwieństwie do podejść opartych na oświetleniu strukturalnym, w których przekrój poprzeczny wiązki wzbudzenia jest modulowany przestrzennie, w celu uzyskania przestrzennej modulacji wzbudzenia wykorzystujemy wyłącznie proces skanowania. Rozszerzając wzbudzenie do większej długości fali, jesteśmy w stanie poprawić zarówno rozdzielczość przestrzenną, jak i stosunek sygnału do szumu w tkankach głębokich o dużym rozproszeniu (np. węzeł chłonny, ścieżka swobodnego rozpraszania 47 μm6), niezależnie od wykrywanego przez nas optycznego sygnału nieliniowego, np. fluorescencji, generacji drugiej harmonicznej lub innego zjawiska mieszania częstotliwości. Stosując to podejście przy długościach fal wzbudzenia do 900 nm jesteśmy w stanie dynamicznie obrazować komórkowe struktury białkowe w skali kilku cząsteczek w centrach rozrodczych węzłów chłonnych myszy. W ten sposób możemy lepiej zobrazować interakcję między jednostkami przenoszącymi antygen na powierzchni pęcherzykowych komórek dendrytycznych a limfocytami B w procesie sondowania antygenu podczas odpowiedzi immunologicznej w wtórnych narządach limfatycznych.

Protokół

Konfiguracja wielowiązkowej dla oświetlenia pasiastego TPLSM

Konfiguracja używana tutaj to specjalistyczny wielowiązkowy dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy, jak opisano wcześniej^6,20. System jest zilustrowany na rysunku 1. Podejście to można zastosować do innych dwufotonowych laserowych mikroskopów skaningowych, które są w stanie zsynchronizować akwizycję kamery z ruchem luster galvoscannera, nawet jeśli są w stanie wykonywać skanowanie tylko pojedynczą wiązką. W tym przypadku wadą będzie mniejsza szybkość akwizycji, jednak zbliżona do szybkości akwizycji w standardowym TPLSM opartym na PMT. Aby osiągnąć optymalną jakość pod względem rozdzielczości i kontrastu, przy najniższym fotowybielaniu i fotouszkodzeniach oraz najszybszej akwizycji, zaleca się rozważenie następujących kroków regulacji konfiguracji:

1. Sprawdź moc lasera TiSa: sprawdź na 100%, porównaj z oryginalnymi wartościami fabrycznymi i poprzednimi własnymi odczytami i użyj go tak, jak jest, jeśli konieczna jest długość fali wzbudzenia w zakresie 700-1,000 nm.
2. Przetestuj wskazanie pilota zdalnego sterowania dla rozdzielacza wiązki Ti:Sa, tj. sprawdź ustawienia 0% i 100%. Jeśli pozostała wiązka TiSa wynosi 100%, sprawdź i zresetuj pozycję zerową silnika krokowego. Rozdzielacz wiązki Ti:Sa składa się z płytki λ/2 niskiego rzędu i polaryzatora, który rozdziela prostopadle spolaryzowane wiązki laserowe na prostopadłe ścieżki wiązki: jedna jest kierowana do mikroskopu w celu wzbudzenia, druga służy do pompowania optycznego oscylatora parametrycznego (OPO). Dzięki automatycznemu obracaniu płytki λ/2 uzyskuje się ciągłą regulację mocy odpowiednio Ti:Sa i OPO.
3. Dostosuj OPO do żądanej długości fali i zmierz moc wyjściową. Jeśli moc jest zbyt niska (przy laserze Ti:Sa o mocy 4 W przy 800 nm powinno być w stanie uzyskać 0,8-1 W wiązki OPO przy około 1,050-1,100 nm), zoptymalizuj długość fali pompowania i sprawdź ustawienia lustra i wachlowanego kryształu. Wybierz zalecane optymalne wartości, często dostępne w postaci wykresów lub wykresów, a następnie dostosuj je, aż OPO będzie rezonować z żądaną długością fali, a moc wzrośnie.
   1. Jeśli moc jest nadal niska, wyreguluj dwa dostępne lusterka OPO za pomocą czterech dostępnych pokręteł regulacji lusterek. Wykonaj ten krok bardzo powoli i bardzo małymi ruchami, naprzemiennie w lusterku przednim i końcowym.
4. Sprawdź, czy promienie Ti:Sa i/lub OPO uderzają w lusterka wejściowe we właściwym, środkowym położeniu.
   1. Użyj kawałka białego papieru (niezbyt błyszczącego lub odbijającego światło!) i wizjera podczerwieni do obserwacji wiązki OPO i wiązek Ti:Sa o wyższej długości fali.
      1. Podczas pracy z wiązkami NIR Ti:Sa należy nosić okulary ochronne (zwykle do 720-750 nm jest widoczne dla przeciętnego człowieka).
   2. Ustaw moc(e) lasera na jak najniższym poziomie dla procedury wyrównania, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenie oczu.
   3. Zawsze utrzymuj włączone oświetlenie otoczenia w pomieszczeniu, tak aby źrenica oka była zwężona.
   4. Należy pamiętać, że moc lasera jest precyzyjnie kontrolowana przez tłumiki składające się z płytki λ/2 i polaryzatorów, które nie działają jeszcze, gdy wiązka Ti:Sa wchodzi do głowicy skanującej!
5. Sprawdź, czy membrana punktu wejściowego jest uderzona w środku przez wiązkę Ti:Sa i/lub OPO; jeśli nie, wyreguluj dwa ostatnie lustra, zanim wiązka laserowa wejdzie do głowicy skanującej.
   1. Użyj przeglądarki podczerwieni i małego kawałka białego (ale nie błyszczącego/odblaskowego!) papieru.
   2. Zawsze zamykaj membranę przy wejściu do mikroskopu, aby można było dokładniej ocenić położenie wiązki laserowej. Ważne: Nie zapomnij ponownie otworzyć membrany przed przejściem do kroku 6!
6. Dostosuj odpowiednio ścieżkę światła odbitej wiązki laserowej do mikroskopu. Zrób to na małych segmentach i wykonaj iteracyjny chód wiązki.
   1. Sprawdź całą drogę światła, jeśli strumień świetlny z soczewki obiektywu nie jest odpowiedni.
   2. Zawsze sprawdzaj ścieżkę światła przy pierwszym użyciu systemu po długim okresie bezczynności, generalnej naprawie, wymianie elementów optycznych lub jeśli podejrzewa się, że występują problemy z wyjściem.
7. Upewnij się, że wszystkie aktywne powierzchnie optyczne są czyste, zwłaszcza że są wolne od kurzu! Jeśli powierzchnie są pokryte warstwą pyłu, czoło fali jest zniekształcone jeszcze przed wejściem do soczewki obiektywu, a powstała wiązka laserowa nigdy nie dostarczy ostrego obrazu próbki!
   1. W razie potrzeby wyczyść lustra złożonym kawałkiem papieru do soczewek, zwilżonego etanolem lub izopropanolem.
8. Sprawdź, czy wiązka dociera z powrotem do zwierciadła, które znajduje się bezpośrednio nad lustrem wejściowym na końcu kompresora impulsów opartego na pryzmacie, po ustawieniu ścieżki światła. Stąd wiązka jest odbijana do multipleksera wiązki (BM).
9. Sprawdź, czy wiązka laserowa uderza w membranę, która znajduje się na wejściu do multipleksera wiązki, bezpośrednio przed płytką λ/2, zmieniając polaryzację wiązki laserowej tak, aby spełniała wymagania dotyczące szerokopasmowej transmisji 50% i 50% odbicia w obrębie BM.
   1. Najpierw zamknij przysłonę, aby można było dokładniej ocenić położenie wiązki i wykonaj spacer wiązki między dwiema membranami, tj. jedną przy wejściu do mikroskopu, a drugą przy wejściu BM. W przypadku innych jednowiązkowych mikroskopów skaningowych membrana powinna znajdować się przy wejściu do skanera xy.
   2. Jeżeli wiązka nie trafia w środek zamkniętej przysłony, należy wyregulować w/w lusterko, umieszczone bezpośrednio przed membraną wejściową BM. Ważne: Nie zapomnij ponownie otworzyć membrany przed przejściem do kroku 10.
10. Po ponownym otwarciu membrany sprawdź, czy wiązka lasera uderza w lustra BM w ich środkowym punkcie. Użyj wąskiego paska papieru, aby nie blokować innej części skomplikowanych ścieżek światła BM!
11. Sprawdź, czy wiązka trafia w środek lusterek wyjściowych: zwierciadło górne dla polaryzacji równoległej "P", zwierciadło dolne dla polaryzacji prostopadłej "S". Jeśli nie, wyreguluj lusterko wejściowe przed BM.
12. Sprawdź, czy wiązka spolaryzowana "S" i "P" pozwala grupom wejść do kostki polaryzacyjnej i odpowiednio się na siebie nakładać przy wejściu do skanera xy. Pomiń te kroki w przypadku użycia mikroskopu skaningowego z pojedynczą wiązką.
13. Sprawdź, czy światło lasera przechodzi przez centralnie skan i soczewki tubusu i przechodzi przez środek tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki obiektywu. Ważne: ten krok należy wykonać z wiązką lasera w pozycji środkowej, a nie w pozycji parkowania!
    1. Zamień soczewkę obiektywu na przyrząd celowniczy ("oko") i sprawdź, czy wiązka lasera trafia w cel pośrodku i czy oświetlenie jest równomierne.
    2. Jeśli wydaje się, że tak jest, zamknij przysłonę przed BM i sprawdź, czy pojawia się okrągły wzór interferencyjny z czarnym kółkiem pośrodku (minimum zakłóceń).
       1. Wyreguluj lusterko wejściowe, jeśli nastąpi znaczne przesunięcie względem środka tarczy.
14. Teraz zamień strzał w dziesiątkę na soczewkę obiektywową, np. na soczewkę zanurzeniową 20X.
    1. Sprawdź wyjściowe pole świetlne za pomocą kawałka białego papieru. Powinien być jasny, jednolity i umieszczony centralnie.
    2. Zmierz moc wyjściową: przy 100% OPO przy 100% pompowaniu Ti:Sa (4 W), za obiektywem powinno być ok. 100-150 mW przy 1 100 nm (w zastosowanym tu mikroskopie). Niższe moce lasera nie wystarczą do wykonania wielowiązkowego SI-TPLSM. Do skanowania pojedynczą wiązką SI-TPLSM wystarczy 5-10 mW. Wiązka laserowa musi pozostać w pozycji środkowej bez skanowania!
15. W przypadku korzystania z MB-SI-TPLSM należy wyrównać lusterka w BM w następujący sposób:
    1. Umieścić jednorodnie fluoryzującą próbkę, np. czerwony szkiełko fluorescencyjne, na stoliku i skupić wiązkę laserową wewnątrz próbki, ale w pobliżu górnej powierzchni (tj. blisko czoła soczewki obiektywu).
    2. Ustaw mikroskop w tryb wielowiązkowy i wybierz liczbę wiązek, na początku najlepiej tylko jedną wiązkę oraz polaryzację, np. "P".
       1. Znajdź wiązkę laserową, obrazując szkiełko fluorescencyjne: otwórz migawkę "P" i uruchamiaj kamerę CCD w sposób ciągły, jednocześnie skupiając wiązkę.
       2. Upewnij się, że wiązka znajduje się w pozycji środkowej, a skaner jest wyłączony. Upewnij się, że wiązka nie jest skanowana!
       3. Znajdź wiązkę, szukając jasnego punktu w pobliżu środka układu kamery.
       4. Skoncentruj wiązkę, aż plamka będzie najjaśniejsza i najostrzejsza, tj. płaszczyzna obrazu mikroskopu odpowiada położeniu chipa kamery; zmniejsz moc lasera, aby plamka nie była nasycona. Przy dobrze ustawionym systemie oznacza to, że moc lasera musi być bliska minimum podczas pracy w trybie jednowiązkowym (powinna działać moc lasera około 0,6 mW).
       5. Jeśli plamka jest znacznie przesunięta poza środek, przesuń ją bliżej środka, regulując lustro przed BM (lub skanera w przypadku skanowania pojedynczą wiązką).
       6. Przy ustawianiu również drugiej polaryzacji, tj. wiązki "S", przełącz się teraz w tryb 2-wiązkowy, otwórz migawkę "S" i sprawdź położenie wiązki (tylko jedna wiązka może być widoczna, jeśli otwarta jest tylko migawka "S").
       7. Po zakończeniu przełącz się na tryb 4-wiązkowy i użyj trybu polaryzacji "P" (migawka "P" otwarta). Teraz pojawią się dwa beamlety.
       8. Ułóż dwie wiązki tak, aby były idealnie równoległe do dolnej krawędzi widoku kamery i ustaw je tak, aby były oddalone od siebie o 2,8 μm.
          1. Jeśli nie są prawidłowo wyrównane, wyreguluj pierwsze lusterko BM.
          2. Nigdy nie wyrównuj pośrodku, zamiast tego użyj dwóch obwodowych, aby przesunąć lustro, aż dwie wiązki będą oddalone od siebie o 2.8 um i idealnie ułożone
          poziomo.
       9. Teraz przełącz się na tryb 8-wiązkowy w polaryzacji "P" i wyreguluj drugie lustro BM (również bez czerwonej kropki), aż 4 wiązki znajdą się w równej odległości 2,8 um i zostaną ustawione równolegle do dolnej krawędzi obrazu.
       10. Powtórz w trybie 16- i 32-wiązkowym, regulując odpowiednio 3. i 4. lusterko BS. Ważne jest, aby wiązki były w równej odległości, ponieważ algorytmy SI, z których najprostszym jest algorytm min-max (HiLo), opierają się na tym założeniu.
16. Zastąp jednolicie fluorescencyjną próbkę próbką o niejednorodnej strukturze, np. korzeniami Convallaria barwionymi krzyżowo.
    1. Przejdź do pozycji parkowania wiązki wzbudzenia, która zwykle jest umieszczona na dużych wartościach współrzędnych skanera, np. (10 000; 10 000).
    2. Zeskanuj obraz (wielowiązkowy) za pomocą kamery CCD. Sprawdź, czy obraz jest ostry, jednolity i prosty.
    3. Dostosuj aparat, jeśli obraz wydaje się obrócony: ręcznie obróć korpus aparatu osiowo wokół osi pionowej (bądź delikatny!), aż obraz zostanie wyprostowany.
17. Uruchom skaner xy, aby kontrolować proces skanowania w celu wygenerowania wzorca wzbudzenia, tj. obrazu w paski.
    1. W przypadku skanowania wielowiązkowego należy przesunąć lustro skanera y, czyli prostopadle do linii belki, w taki sposób, aby wygenerować kwadratowy obraz w paski.
    2. Jeśli pole widzenia wygenerowane zgodnie z opisem w kroku 17.1 jest zbyt małe, należy rozszerzyć procedurę skanowania, przesuwając lustro skanera rentgenowskiego do pozycji zapewniającej, że linia przepuszczania wiązki jest podwojona, a wiązki znajdują się w równej odległości wzdłuż całej linii. Powtórz dokładny ruch lustra skanera Y po przesunięciu lustra skanera rentgenowskiego, aby wygenerować większy obraz w paski.
    3. W przypadku skanowania pojedynczą wiązką, naprzemiennie ruch lustra skanera y z ruchem lustra skanera rentgenowskiego w jednakowo odległych pozycjach – zdefiniowanych przez naukowca – w celu wygenerowania pożądanego obrazu w paski.
    4. Upewnij się, że dla ruchu lusterka skanera Y jest to polecenie dla stałej prędkości (zmniejszone przyspieszanie/zwalnianie), a dla lusterka skanera rentgenowskiego jedno polecenie dla maksymalnej prędkości (maksymalne przyspieszenie/opóźnienie).
18. Automatycznie rejestruj i zapisuj obraz w paski za pomocą kamery (detektor pola). Dlatego zsynchronizuj aparat ze skanerem i użyj skanera jako głównego wyzwalacza.
19. Powtórz pobieranie obrazów w paski (protokół skanowania opisany w Protokole 17), przesuwając lustro skanera rentgenowskiego w różnych pozycjach w następujący sposób:
    1. Wybierz wystarczającą liczbę kroków powtórzeń i odpowiednią długość kroku między dwoma kolejnymi obrazami w paski, aby pokryć odległość między dwoma kolejnymi belkami (w tym przypadku 2,8 μm i jeden krok lustra skanera równa się 25 nm); wskazane może być pozostawienie niewielkiego nakładania się, tj. dodatkowe 0,3-0,4 μm.
    2. Ustaw przesunięcie x na wartość, która odpowiada limitowi rozdzielczości poprzecznej przy danej długości fali. Na przykład, użycie 10 kroków lustra skanera rentgenowskiego na zmianę i 12 lub 13 przesunięć prowadzi do najlepszych wyników zarówno w zakresie rozdzielczości osiowej, jak i bocznej w tym systemie. Sprawdź za pomocą szkiełka strukturalnego, np. suwaka korzeni Convallaria, które liczby najlepiej sprawdzają się w używanym systemie.
    3. Zoptymalizuj te dwie wartości, aż obraz Convallaria stanie się najostrzejszy: użyj narzędzia profilu liniowego na obliczonych obrazach SI i porównaj szerokość profili linii (która jest sygnałem fluorescencyjnym ze ścian komórkowych Convallaria).
    4. Pobieraj każdy obraz w paski zsynchronizowany z ruchem skanera i zapisuj go osobno, np. jako pliki tiff lub binarne.
20. Otwórz kompletny zestaw obrazów w paski jako macierze, tj. macierz 3D, w procedurze oceny i użyj algorytmu min-max lub algorytmu transformaty Fouriera, aby wygenerować macierz 2D obrazu SI o wysokiej rozdzielczości. Algorytmy zostały wcześniej szczegółowo opisane²⁰.

Uodpornienie myszy i przygotowanie do obrazowania przyżyciowego

Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety krajowe ds. dobrostanu zwierząt (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualnymi wytycznymi i przepisami (licencja na eksperymenty na zwierzętach G0153/08).

21. Indukcję odpowiedzi centrum rozrodczego w węźle chłonnym podkolanowym i przygotowanie pola obrazowania przeprowadzono zgodnie z opisem powyżej⁴. Oczyść immunomagnetycznie limfocyty B ze śledziony z B1-8 ^+/+ Jκ^-/- i limfocytów B B1-8 ^+/+ Jκ^-/- GFP⁺ myszy.
22. Wstrzyknąć dożylnie 3 x 10⁶ limfocytów B specyficznych dla NP o czystości >95% przy użyciu 1/8 B1-8 ^+/+ Jκ^-/- GFP⁺ i 7/8 niefluorescencyjnych B1-8 ^+/+ Jκ^-/- u biorców C57Bl / 6.
23. Jednego dnia po transferze komórek uodpornić biorców 10 μg NP-CGG (globuliny nitrofenylowo-kurzej) zemulgowanej w adiuwantu Freunda Complete (CFA) w prawej tylnej oduszce pokarmowej.
24. Oznaczyć fragmenty Fab przeciwciał anty-CD21/CD35 estrem ATTO590-sukcynimidylu.
    1. Aby podkreślić sieć pęcherzykowych komórek dendrytycznych (FDC) w centrum rozrodczym in vivo, wstrzyknij 10 μg znakowanych fluorochromem fragmentów Fab do prawej tylnej opuszki stopy myszy 12-24 godziny przed wykonaniem analizy przyżyciowej.

Następujące kroki powinny być brane pod uwagę w celu przygotowania węzła chłonnego podkolanowego do obrazowania przyżyciowego (dzień 8-10 po szczepieniu):

25. Znieczulij myszy przez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy/ksylazyny, ilość zależna od ich wagi.
26. Przetestuj odruchy, aby monitorować głębokość znieczulenia przez cały okres obrazowania.
27. Ogol nogę, plecy i prawy bok myszy rygorystycznie i użyj kremu do depilacji, aby całkowicie usunąć resztki włosów.
28. Napraw prawy krętarz większy: zlokalizuj palcami kostny chip, ustaw małe nacięcie skóry nożyczkami, aż pojawi się mała biała powięź w kształcie trójkąta.
29. Zaciśnij kostny wiór pod tą deską rozdzielczą za pomocą spiczastej pęsety ogranicznika.
30. Przymocuj kręgosłup w okolicy lędźwiowej za pomocą pęsety zębatej.
31. Zamocuj prawą tylną nogę na uchwycie i dokręć.
32. Przyklej ogon, aby utrzymać nogę we właściwej pozycji.
33. Po ogonowej stronie uda wykonaj nacięcie w skórze, w miejscu, w którym wystająca żyła podkolanowa wchodzi do tkanki, oddziel skórę od tkanki leżącej pod spodem pęsetą i podążaj za żyłą podkolanową od proksymalnej do dystalnej.
34. Odsłoń węzeł chłonny za pomocą pęsety, staraj się unikać nacięcia, aby chronić drobne naczynia limfatyczne (podczas odsłaniania trzymaj węzeł chłonny w PBS).
35. Stwórz krąg tłuszczu próżniowego wokół węzła chłonnego, wypełnij tę kałużę PBS.
36. Umieść szkiełko nakrywkowe na swoim miejscu i umieść sondę termometru (utrzymuj temperaturę na poziomie 37 °C, w przeciwnym razie prędkość ogniwa będzie się dramatycznie zmieniać).
37. Wzdłuż górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego dodaj okrąg smaru próżniowego.
38. Umieść wężownicę grzewczą na swoim miejscu na smarze próżniowym, utwórz uszczelkę w podobny sposób jak poprzednio i dodaj wodę/PBS na szklaną szkiełko nakrywkowe, aby zanurzyć w niej obiektyw.
39. Po obrazowaniu mysz jest utrzymywana w znieczuleniu, podczas gdy zwiększa się dawki ketaminy/ksylazyny do dawki śmiertelnej, a następnie następuje zwichnięcie szyjki macicy.

Wyniki

Rozdzielczość przestrzenna w węzłach chłonnych

Wymiary efektywnej funkcji rozproszenia punktu (ePSF) odpowiadają rozdzielczości przestrzennej mikroskopu¹². Zmierzyliśmy tę trójwymiarową funkcję poprzez pozyskanie sygnału generowania drugiej harmonicznej z włókien kolagenowych w węzłach chłonnych za pomocą naszego MB-SI-TPLSM w porównaniu z uznanymi technikami dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, tj. TPLSM z detekcją polową (za pomocą kamer CCD) oraz TPLSM z detekcją...

Dyskusja

Celem przyżyciowego obrazowania optycznego jest dynamiczna i funkcjonalna wizualizacja ruchliwości i interakcji komórkowych w celu zrozumienia funkcji tkanek i narządów w zdrowiu i chorobie⁵. Najpotężniejsza technologia, która to umożliwia, wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa, musi jeszcze pokonać ograniczenia związane ze zniekształceniami czoła fali, rozpraszaniem, powolną akwizycją, fotowybielaniem i fotouszkodzeniami, które ograniczają jej rozdzielczość przestrzenną, kontrast, a także rozdzielczoś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ATTO590 – NSH do sprzęgu	ATTO Tec, Niemcy	AD-590-35
CD21/35 – Fragment Fab – ATTO590	DRFZ, Berlin		Reakcja sprzężenia została przeprowadzona w centralnym laboratorium naszej instytucji.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US		Można go również znaleźć w Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Wzbogacanie komórek B myszy z selekcją negatywną	StemmCell Technologies, Niemcy	19854
Koraliki polistyrenowe (605), 0,2 i mikro; m	Life Technologies, Niemcy	F8803
Equipment
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Niemcy
OPO (wersja manualna)	APE, Berlin, Niemcy
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Niemcy
Soczewka obiektywowa zanurzona w wodzie, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Niemcy