Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Podsumowanie

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Streszczenie

Techniki Western blot, które zostały pierwotnie wprowadzone pod koniec lat siedemdziesiątych, są nadal aktywnie wykorzystywane. Jednak ta tradycyjna metoda Western blotting ma kilka wad, do których należą niska rozdzielczość, fałszywe prążki, zmniejszona czułość i słaba integralność białka. Ostatnie postępy drastycznie poprawiły wiele aspektów standardowego protokołu Western blot w celu uzyskania wyższych danych jakościowych i ilościowych. System żelowy Bis-Tris, alternatywa dla konwencjonalnego systemu Laemmli, generuje lepszą separację i rozdzielczość białek, utrzymuje integralność białek i skraca czas trwania elektroforezy do 35 minut. Co więcej, system suchego blottingu iBlot znacznie poprawia skuteczność i szybkość transferu białka do błony w ciągu 7 minut, co kontrastuje z tradycyjnymi metodami transferu białka, które są często mniej efektywne przy długim czasie transferu. W połączeniu z tymi wysoce innowacyjnymi modyfikacjami, detekcja białek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w podczerwieni skutkuje wyższą jakością, dokładniejszymi i spójniejszymi danymi w porównaniu ze standardową techniką chemiluminescencji Western blot. Technologia ta może jednocześnie wykrywać dwa różne antygeny na tej samej membranie, wykorzystując dwukolorowe barwniki bliskiej podczerwieni, które są wizualizowane w różnych kanałach fluorescencyjnych. Co więcej, liniowość i szeroki zakres dynamiki obrazowania fluorescencyjnego pozwalają na precyzyjne określenie ilościowe zarówno silnych, jak i słabych prążków białkowych. W związku z tym protokół ten opisuje kluczowe ulepszenia klasycznej metody Western blot, w której te postępy znacznie zwiększają jakość danych, jednocześnie znacznie skracając czas wykonania tego eksperymentu.

Wprowadzenie

Technika Western blotting została po raz pierwszy opracowana w latach 1977-1979 w celu stworzenia lepszej metody wykrywania białek za pomocą przeciwciał^1-3. Procedura ta wykorzystywała elektroforetyczny transfer białek do błon z żeli SDS-PAGE z białkami docelowymi uwidocznionymi za pomocą przeciwciał drugorzędowych i wykrytymi za pomocą autoradiografii, światła UV lub produktu reakcji peroksydazy³. Tak więc, te same podstawowe zasady są nadal szeroko stosowane w dzisiejszych protokołach Western blot. Jednak ta klasyczna technika Western blot ma wiele wad, takich jak długi czas trwania elektroforezy, niska rozdzielczość i sztuczne pasma białkowe, podatność na degradację białek i ograniczona czułość, a także słaba jakość danych⁴. W związku z tym protokół ten opisuje znaczące postępy i ulepszenia standardowej procedury Western blot, która generuje dokładniejsze dane jakościowe i ilościowe.

System Laemmliego do rozdzielania szerokiej gamy białek za pomocą SDS-PAGE jest najczęściej używanym systemem żelowym do Western blotting⁵. Pomimo popularności tego zachodniego systemu blottingu, metoda ta może powodować zniekształcenia pasma, utratę rozdzielczości i fałszywe pasma⁴. Może to być konsekwencja deaminacji i alkilacji białek spowodowanej wysokim pH (9,5) żelu rozdzielającego, reoksydacji zredukowanych wiązań dwusiarczkowych spowodowanej zmiennym stopniem redoks żelu oraz rozszczepienia wiązań peptydowych aspartylo-prolilu w wyniku ogrzewania białka w buforze Laemmli (pH 5,2)^4,6. System żelowy Bis-Tris, który działa przy neutralnym pH (7,0), zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z systemem Lamemmli. System ten poprawia stabilność białek, minimalizuje modyfikacje białek, utrzymuje białka w ich zredukowanych stanach, zapobiega rozszczepieniu aspartylo-prolilu podczas elektroforezy, a co ważniejsze, czas trwania elektroforezy wynosi 35 min^4,6,7. Ponadto system żelowy Bis-Tris zapewnia również ostrzejsze pasma, wyższą rozdzielczość i separację oraz zwiększoną czułość, co skutkuje bardziej wiarygodnymi danymi⁴.

W połączeniu z systemem żelowym Bis-Tris, system suchego blottingu iBlot wykorzystuje wysokie natężenie pola i prądy, aby znacznie skrócić czas transferu białek z żeli na błony w ciągu 7 minut⁸. Ten system przenoszenia opiera się na metodzie suchego blottingu, która generuje bardziej wydajny i niezawodny transfer białek⁸. Szczegółowe porównanie skuteczności systemu transferowego iBlot z konwencjonalnymi systemami transferowymi można znaleźć na następującej stronie internetowej: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html. Wykorzystuje stos anody i katody, które składają się z matrycy żelowej zawierającej odpowiednie transferowe, które działają jak zbiorniki jonów⁸. Podczas transferu elektroliza wody pomaga zapobiegać wytwarzaniu tlenu z anody miedzianej, co skutkuje bardziej spójnym transferem białka bez powodowania zniekształceń pasma⁸. Co więcej, ten system transferu zwiększa również prędkość transferu poprzez zmniejszenie odległości między elektrodami⁸.

Chociaż chemiluminescencja jest najpowszechniejszą i najbardziej tradycyjną techniką wykrywania białek w analizach Western blot, dwukolorowa detekcja fluorescencyjna w podczerwieni znacznie poprawia czułość, jakość i dokładność danych Western blot. Ta metoda detekcji wykorzystuje wzbudzenie laserem w podczerwieni na dwóch optymalnych długościach fal, 700 nm i 800 nm, w celu wygenerowania wyraźnego obrazu danych o największym stosunku sygnału do szumu i najwyższej czułości⁹. W ten sposób dwa białka docelowe mogą być wizualizowane jednocześnie na tej samej błonie za pomocą fluorescencyjnych kanałów detekcyjnych 700 nm i 800 nm. Co ważniejsze, liniowość i dynamiczny zakres fluorescencji w podczerwieni pozwala na precyzyjną analizę ilościową zarówno silnych, jak i słabych prążków białkowych⁹. Co więcej, protokół ten zapewnia ogromne korzyści i ulepszenia w porównaniu z klasyczną techniką Western blotting poprzez skrócenie czasu elektroforezy i transferu w tym eksperymencie bez uszczerbku dla skuteczności tych procesów i wykorzystanie wykrywania białek fluorescencyjnych w podczerwieni w celu uzyskania lepszych jakościowych i ilościowych danych Western blot.

Protokół

1. Przygotowanie lizatów całych komórek z hodowli komórkowej

1. Umieścić szalki do hodowli komórkowych na lodzie i dodać zimny PBS z 5 mM EDTA (np. 5 ml PBS z 5 mM EDTA/10^cm2 płytka). Usunąć przylegające komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórek do zimnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
Zawiesiny komórek osadzać przez
2. wirowanie z niską prędkością przy 1 000 obr./min (230 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umieścić stożkowe rurki na lodzie i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
3. Przepłukać osad 1 ml PBS z 5 mM EDTA i przenieść zawiesinę komórek do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zawieszenie szybkoobrotowe przy 13 000 obr./min (13 226 x g) przez 10 sekund do ogniw pelletu. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu i umieścić probówki na lodzie.
4. Zawiesić osad w 25-200 μl (w zależności od wielkości osadu; tj. dla 3 x 10⁶ komórek dodać ~150 μl buforu RIPA ) w buforze RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% deoksycholanu sodu, 1% NP-40) zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy i fosfatazy w 2x końcowym stężeniu. Krótko zwiruj każdą probówkę i inkubuj zawiesinę przez 20-30 minut na lodzie. Uwaga: istnieje kilka do lizy, które można wykorzystać do ekstrakcji białek, które różnią się zdolnością do rozpuszczania białek i siłą detergentu denaturującego (np. SDS, Triton X-100 lub NP-40). Bufor RIPA jest przydatny do przygotowywania lizatów całokomórkowych i zakłócania interakcji białko-białko.
5. Aby wytworzyć frakcję pojądrową, odwirować lizaty z prędkością 14 000 obr./min (15 339 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki bez naruszania osadu wzbogaconego jądrowo i umieścić probówki na lodzie. Uwaga: osad wzbogacony jądrowo może również odłączyć się od probówki podczas ekstrakcji supernatantu. Aby uniknąć gromadzenia się osadu wzbogaconego jądrowo, należy umieścić końcówkę pipety bezpośrednio w lepkiej osadzie wzbogaconej jądrowo i wyciągnąć ją wraz z pipetą w celu wyrzucenia.
6. Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z takich testów kwantyfikacji białka, jak BCA lub Bradford.

2. Przygotowanie próbki i elektroforeza

1. Przygotuj każdą próbkę zgodnie z poniższą tabelą przedstawioną poniżej. Alternatywnie można również stosować β-merkaptoetanol w stężeniu końcowym 2,5%. Jednak środek redukujący należy dodać do każdej próbki do godziny przed załadowaniem żelu. Całkowita objętość odpowiada wariacjom pipetowania, przy czym do jednego dołka załadowano tylko 20 μl każdej przygotowanej próbki. Odczynnik ZREDUKOWANA PRÓBKA Próbka białka X μl 4x Bufor do próbek LDS 6 μl Środek redukujący 500 nM DTT 2,4 μl Dejonizowana Do 15,6 μl Całkowita objętość 24 μl
2. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Podczas podgrzewania próbek przygotuj 1 000 ml 1x MES lub MOPS Running Buffer (50 ml 20x MES lub MOPS Running Buffer plus 950 ml wody dejonizowanej). MOPS Running Buffer rozwiązuje białka średniej wielkości w zakresie 14-200 kDa, podczas gdy MES Running Buffer rozwiązuje białka o mniejszej masie cząsteczkowej w zakresie 2-200 kDa o niższym pKa, co pozwala MES Running Buffer działać szybciej niż MOPS⁴. Tak więc te dwa mają kontrastujący wpływ na migrację jonów w żelu do układania w stos, co prowadzi do różnic w separacji prążków białkowych⁴. Odłóż na bok i połącz 200 ml 1x buforu do biegania MES lub MOPS z 500 μl przeciwutleniacza, który zostanie użyty do wypełnienia górnej komory buforowej jednostki elektroforezy Mini-Cell.
3. Po zakończeniu podgrzewania próbek należy je szybko odwirować przed umieszczeniem ich na lodzie.
4. W przypadku montażu prefabrykowanych żeli Bis-Tris w jednostce Mini-Cell do elektroforezy należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: upewnij się, że każdy żel jest zorientowany w taki sposób, że krótsza (mniejsza) kaseta każdego żelu jest skierowana do wewnątrz w kierunku rdzenia buforowego, a żele są wypoziomowane i mocno dociśnięte do rdzenia buforowego, aby uniknąć wycieku z górnej komory buforowej.
5. Napełnij górną komorę buforową 200 ml 1x buforu do pracy MES lub MOPS zawierającego przeciwutleniacz, a dolną komorę buforową jednostki Mini-Cell około 600 ml 1x buforu do pracy MES lub MOPS. Dodatkowe 200-300 ml buforu do biegania można zachować do późniejszego wykorzystania. Nie zaleca się jednak recyklingu buforu używanego podczas elektroforezy, ponieważ pH i jakość buforu mogą ulec zmianie.
6. Załaduj 20 μl każdej próbki białka do każdej studzienki. W przypadku dzielenia błony na różne paski w celu sondowania wielu przeciwciał (tj. więcej niż 2), zdecydowanie zaleca się załadowanie 2-5 μl wstępnie wybarwionego wzorca białka do pierwszego i ostatniego dołka każdego żelu, ponieważ posłuży to jako prowadnice tnące do oddzielania różnych odcinków błony bez wpływu na obrazowanie prążków białkowych.
7. Uruchom żele przy stałym napięciu 200 V przez 35 minut z oczekiwanym prądem 110-125 mA/żel na początku i 70-80 mA na żel na końcu. Elektroforeza jest zakończona, gdy barwnik śledzący migruje do drutu platynowego wzdłuż rdzenia buforowego.

3. Transfer białka za pomocą systemu iBlot Dry Blotting

1. Całkowicie oddziel mini-żele, łamiąc połączone boki kasety (może to powodować trzaski). Wyrzuć krótszą (mniejszą) płytkę i ostrożnie przenieś żel z dłuższej (szczelinowej) płytki do pojemnika z wodą dejonizowaną i usuń grubą część żelu znajdującą się na dole. Uwaga: w rzadkich przypadkach żel może przyczepić się do krótszej płytki zamiast do dłuższej, szczelinowej płytki. W takim przypadku Wyrzuć dłuższą, szczelinową płytkę i usuń grubą część żelu znajdującą się na dole. Następnie ostrożnie przenieś żel z krótszej płytki do wody dejonizowanej.
2. Zmontuj stosy transferowe anody i katody zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: zarówno membrany nitrocelulozowe, jak i PVDF zapewniają wysokiej jakości i wydajny transfer białek i są kompatybilne z detekcją fluorescencyjną⁸. Jednak membrana PVDF ma wyższą zdolność wiązania (240 μg/^cm3) niż nitroceluloza (200 μg/^cm3)⁸.
3. Ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki lub powietrze uwięzione między żelem a membraną, ponieważ zapobiegnie to zniekształceniu prążków białkowych podczas przenoszenia. Uwaga: nie przycinaj membrany ani stosu transferowego tak, aby pasowały do rozmiaru żelu, ponieważ spowoduje to bezpośredni kontakt między stosami anod i katod.
4. Po prawidłowym zmontowaniu stosów transferowych na urządzeniu do bibułowania na sucho należy wybrać odpowiedni program napięciowy (tj. Program 3: 20 V przez 7 min) i rozpocząć transfer. Uwaga: białka o masie większej niż 150 kDa mają tendencję do wolniejszej migracji i mogą wymagać dłuższego czasu transferu wynoszącego 8-10 minut. Ponadto wcześniejsza inkubacja żelu w 20% etanolu przez 5-10 minut również pomoże poprawić wydajność przenoszenia tych dużych białek. Po zakończeniu programu przesyłania urządzenie automatycznie wyłączy prąd. Najlepiej jest natychmiast usunąć membranę i kontynuować procedurę blokowania, aby zapewnić lepsze wykrywanie białka i uniknąć wysuszenia membrany.

4. Wykrywanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni

1. Umieść membranę (błony) w co najmniej 0,8 ml/^cm2 buforu blokującego Odyssey (nie dodawaj Tween-20) na 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C. Membrana (membrany) może być również zablokowana przez beztłuszczowe mleko w proszku, jednak może to powodować wyższe tło i zakłócać wykrywanie białek.
2. Inkubować błonę (błony) w pierwotnym przeciwciałie o pożądanym stężeniu w buforze blokującym Odyssey z 0,1% Tween-20 przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku detekcji dwukolorowej, w której dwa różne antygeny są wizualizowane na tej samej plamie, dwa pierwszorzędowe przeciwciała muszą pochodzić od różnych gatunków gospodarzy i zostać dodane jednocześnie do błony (błon). Uwaga: przed inkubacją błony (błon) w przeciwciałie pierwotnym, błonę (błony) można podzielić na różne części w celu zbadania wielu przeciwciał (tj. więcej niż 2) na tej samej błonie.
3. Pierz membranę (membrany) 3x przez 10 minut w TBS plus 0,1% Tween-20 delikatnie wstrząsając.
4. Inkubować błonę (błony) z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniu 1:20 000 dla kanału 700 nm i 1:6 000-1:10 000 dla kanału 800 nm w buforze blokującym Odyssey z 0,1% Tween-20 przez 30-60 min (inkubacja błony (błon) dłużej niż 1 godzina może zwiększyć tło). Chronić membranę (błony) przed światłem. Uwaga: przeciwciała drugorzędowe muszą pochodzić od tego samego gatunku gospodarza, co każde z przeciwciał pierwszorzędowych i być znakowane różnymi fluoroforami.
5. Pierz membranę (membrany) 3x przez 10 minut w TBS plus 0,1% Tween-20 delikatnie wstrząsając. Chronić membranę (membrany) przed światłem.
6. Membrana (membrany) może być suszona lub przechowywana w TBS lub PBS bez Tween-20 w temperaturze 4 °C do czasu zeskanowania i zobrazowania za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni. Sygnał fluorescencyjny pozostanie stabilny przez kilka miesięcy, jeśli będzie odpowiednio chroniony przed światłem.

Wyniki

Dwukolorowa fluorescencja w podczerwieni pozwala na wykrycie zarówno silnych, jak i słabych prążków na tej samej membranie z zwiększoną czułością i najwyższym stosunkiem sygnału do szumu, co pozwala uzyskać wyraźne obrazy Western blot. Typowe wyniki generowane przez dwukolorową detekcję Western blot wizualizowane w kanałach fluorescencyjnych 700 nm i 800 nm przedstawiono na Ryc. 1 i 2. Górny Western blot na Ryc. 1 pokazuje jednoczesną detekcję (nałożenie) całkowitego bia...

Dyskusja

Kluczowe etapy generowania wysokiej jakości, ilościowych Western blot zgodnie z tym protokołem są następujące: 1) pomiar stężeń białka; 2) przygotowanie próbki; 3) blokowanie membrany i; 4) jakość i kaliber przeciwciała pierwszorzędowego.

Dokładność pomiaru całkowitych stężeń białek może mieć duży wpływ na ilościowe określanie prążków białkowych, ponieważ wyjątkowa czułość detekcji fluorescencyjnej w podczerwieni wzmocni wszelkie niewielkie różnice stwierdzone w stężeniu białka w próbkach. Aby...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Bufor do próbek	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x Środek redukujący próbki NuPAGE	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Bufor do biegania	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE	Antioxidant Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,5 mm, 10-dołkowy	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,5 mm, 15-dołkowy	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
Stos transferowy iBlot, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
Stos transferowy iBlot, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
Stos transferowy iBlot, Nitroceluloza	Regularna Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
Stos transferowy iBlot, nitroceluloza Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
Urządzenie do transferu żelu iBlot	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Technologia sygnalizacji komórkowej	4370
technologia sygnalizacji komórkowej	ERK1/2	9107
Bufor blokujący Odyseję	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Koza anty-mysia IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Zachodnia skrzynka inkubacyjna, średnia	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Klasyczny system obrazowania	LI-COR Biosciences	N/A Oprogramowanie
aplikacyjne Odyssey V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A

Całkowita