Artykuł metodologiczny

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

DOI:

10.3791/51151

⸱

17 stycznia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Medicine, Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science, University of Melbourne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oznaczanie białek wirusowych białkami fluorescencyjnymi okazało się nieodzownym podejściem do pogłębiania naszego zrozumienia interakcji wirus-gospodarz. Wirus krowianki (VACV), żywa szczepionka stosowana w zwalczaniu ospy prawdziwej, jest szczególnie podatny na fluorescencyjną mikroskopię żywych komórek ze względu na duży rozmiar wirionu i łatwość, z jaką można go zmodyfikować na poziomie genomu. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół generowania rekombinowanych wirusów. Określono minimalne wymagania dotyczące celowanej rekombinacji homologicznej podczas replikacji krowianki, co pozwala na uproszczenie generowania konstruktów. Umożliwiło to połączenie przejściowej selekcji dominującej (TDS) z fluorescencyjnym reporterem i selekcją metaboliczną w celu zapewnienia szybkiego i modułowego podejścia do fluorescencyjnego znakowania białek wirusowych. Usprawniając wytwarzanie rekombinowanych wirusów fluorescencyjnych, jesteśmy w stanie ułatwić dalsze zastosowania, takie jak zaawansowana analiza obrazowa wielu aspektów interakcji wirus-gospodarz, która zachodzi podczas replikacji wirusa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus krowianki (VACV) jest prototypowym wirusem ospy i jest wysoce spokrewniony z wirusem ospy wietrznej, czynnikiem wywołującym ospę prawdziwą. Oba te wirusy należą do rodzaju Orthopox, który obejmuje inne godne uwagi patogeny, takie jak małpia ospa i wirus ektromelii (ospa myszy)1. Ortopokswirusy mają duże dwuniciowe genomy DNA (180-220 kb), które kodują ponad 200 przewidywanych otwartych ramek odczytu2,3. Replikacja tych wirusów obejmuje tworzenie okołojądrowej fabryki wirusów, w której wytwarzane są dojrzałe wirusy (MV), oraz sieci trans-Golgiego, w której podzbiór MV uzyskuje dwie dodatkowe błony w celu wytworzenia wirusów owiniętych (WV) (przegląd Robertsa i Smitha4). Genomy ortopoksów są wysoce podatne na manipulacje genetyczne ze względu na wysoki stopień rekombinacji genetycznej, która jest cechą replikacji genomu VACV i jest pośredniczona przez wirusową polimerazę DNA5. Generowanie rekombinowanych wirusów opiera się na rekombinacji homologicznej i liniowych cząsteczkach DNA o homologiach tak małych jak 12 pz, które są wystarczające do pośredniczenia w rekombinacji w komórkach zakażonych wirusem krowianki6. Znakowanie fluorescencyjne wirusa krowianki może dać niezwykle jasne cząsteczki wirusa ze względu na duży rozmiar cząstek ortopoksy, co pozwala na włączenie wielu białek fluorescencyjnych na wirion7. Krowianka ma zdolność przenoszenia dużych fragmentów obcego DNA8, a ponadto brak sztywnej symetrii kapsydu może pozwolić na pewien stopień elastyczności podczas ekspresji fuzji genów białek wirusowych z ich endogennych loci9. Znakowanie fluorescencyjne białek VACV okazało się nieocenione w badaniu interakcji gospodarz-patogen na poziomie subkomórkowym, szczególnie w dziedzinie wnikania wirusa10, transportu11-13 i morfogenezy, szczególnie owiniętych wirionów7.

Rekombinowane wirusy mogą być wybrane przez uratowanie osłabionego fenotypuwzrostu 14,15, selekcję metaboliczną16-18, lub przez ekspresję genu markerowego (np. X-gal19 lub białko fluorescencyjne13,20). W tym miejscu opisujemy selekcję wirusów fluorescencyjnych przy użyciu potężnej kombinacji selekcji fluorescencyjnej i metabolicznej. Przejściowe wektory selekcji dominującej (TDS), opracowane przez Faulknera i Mossa (1990)21, umożliwiają integrację markerów wraz z pożądanym genem znakowanym fluorescencyjnie. Po usunięciu selekcji metabolicznej może wystąpić wtórne zdarzenie rekombinacji, które wycina geny selekcyjne, ale pozostawia nienaruszone fluorescencyjnie znakowane białko wirusa. Rysunek 2 poniżej przedstawia przegląd procedury eksperymentalnej. Geny selekcyjne wykorzystane w tym badaniu to mCherry i gen fosforybozylotransferazy guaninowej Escherichia coli (gpt), oba ulegające ekspresji z syntetycznego promotora wczesnego / późnego wirusa i używane wcześniej przez Cordeiro i wsp.22 Ponadto występuje fluorescencja znakowanego białka fuzyjnego, które jest przedmiotem zainteresowania. Po usunięciu selekcji metabolicznej markery selekcyjne (mCherry i gpt) są wycinane, pozostawiając tylko fluorescencję znakowanego genu, co pozwala na identyfikację prawidłowych rekombinowanych wirusów. Wycięcie markerów selekcyjnych daje możliwość łączenia wielu znaczników fluorescencyjnych, co pozwala na tworzenie wirusów ze zdolnością do fluorescencyjnego znakowania kilku białek wirusowych jednocześnie. Wcześniejsze badania określiły minimalne wymagania homologiczne dla rekombinacji krowianki liniowych i kolistych cząsteczek DNA transfekowanych do komórek zakażonych wirusem krowianki6. Chcieliśmy określić wydajność rekombinacji różnych długości homologii ramion flankujących w wektorze TDS gpt-mCherry poprzez jego włączenie do genomu wirusa krowianki. Stwierdzono, że regiony homologiczne o wartości 100 pz w wektorze TDS są wystarczające do celowania i pośredniczenia w insercji rekombinowanego DNA do genomu VACV przez rekombinację homologiczną (ryc. 4). Podczas gdy mniejsze długości homologii również umożliwiłyby rekombinację, długości homologii 100 pz zapewniły wystarczającą ilość rekombinowanych wirusów, które można było łatwo zidentyfikować za pomocą selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej. Fragmenty DNA tej wielkości mogą być komercyjnie syntetyzowane przy stosunkowo niskich kosztach i znacznie ułatwiają produkcję wielu wektorów do tworzenia rekombinowanych wirusów. Zdecydowaliśmy się na zwiększenie długości homologii do 150 pz, aby zapewnić większą częstotliwość rekombinacji przy jednoczesnym utrzymaniu niskich kosztów syntezy sekwencji oligonukleotydowej regionów flankujących.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie wektora rekombinacji

  1. Zidentyfikuj 150 pz długie boczne obszary homologii (określane jako lewe i prawe ramię) wymagane do N- lub C-końcowego znakowania interesującego genu wirusa (patrz ryc. 1b).
  2. Zaprojektuj sekwencję oligonukleotydową składającą się z lewego i prawego ramienia o długości 150 pz oddzielonych parą wybranych miejsc restrykcyjnych. Cała ta sekwencja musi być również otoczona przez drugą parę miejsc restrykcyjnych (inną niż pierwsza para), aby umożliwić włączenie do wektora TDS po zsyntetyzowaniu. Podczas projektowania oligonukleotydu z miejscami restrykcyjnymi należy zwrócić uwagę, aby sekwencje znajdowały się w ramce z pożądanym miejscem insercji.
  3. Podczas projektowania oligonukleotydu do syntezy należy uwzględnić miejsca restrykcyjne między lewym i prawym ramieniem, które muszą pasować do tych otaczających otwartą ramkę odczytu wybranego znacznika fluorescencyjnego (patrz rysunek 1b). Możliwe jest użycie miejsca restrykcyjnego NotI jako łącznika trzech aminokwasów między lewym ramieniem a początkiem znacznika fluorescencyjnego.
  4. Włączyć te same miejsca restrykcyjne po obu stronach znacznika fluorescencyjnego metodą PCR (patrz rysunek 1c).
  5. Sklonuj zsyntetyzowany fragment do wektora TDS.
  6. Sklonuj znacznik fluorescencyjny do wynikowego wektora rekombinacji, używając miejsc restrykcyjnych między obszarami homologii lewego i prawego ramienia (patrz rysunek 1d).

2. Generacja rekombinowanego wirusa

  1. Jak pokazano na rysunku 2, zainfekuj monowarstwę komórek BS-C-1 wirusem krowianki w pożywce bez surowicy w wielu infekcjach (MOI) > 1.
  2. 1 godzinę po zakażeniu, uratuj komórki zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i transfekcją mieszaniny plazmidu wektora rekombinacji i odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 w pożywce bez surowicy.
  3. Po 24 godzinach zeskrob i odzyskaj komórki w DMEM nie zawierające płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i wykonaj trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić otwarte komórki i uwolnić cząsteczki wirusa.
  4. Wykonaj test płytki nazębnej z płynną nakładką 10% odczynników selekcyjnych FBS, DMEM i GPT, kwasu mykofenolowego (25 μg / ml) i ksantyny (250 μg / ml) w następujący sposób:
    1. Wysiewaj 6-dołkową płytkę z monowarstwą komórek BS-C-1.
    2. Infekować w 100% zlewające się monowarstwy komórek seryjnymi rozcieńczeniami zamrożonych i rozmrożonych komórek zawierających cząsteczki wirusa, aby zapewnić odpowiednią separację poszczególnych blaszek.
    3. Nakładka z płynem 10% FBS zawierającym DMEM zawierającym odczynniki selekcyjne GPT - kwas mykofenolowy i ksantynę w końcowych stężeniach odpowiednio 25 μg/ml i 250 μg/ml.
  5. Po 24-godzinnej inkubacji usunąć płynną nakładkę i za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego poszukać blaszek wykazujących rozproszoną czerwoną fluorescencję odpowiadającą włączeniu mCherry z wektora TDS do wirusa. W zależności od docelowego genu i wybranego znacznika fluorescencyjnego, w tej samej czerwonej blaszce można również zaobserwować miejscową fluorescencję znakowanego genu.
  6. Wybierz wiele blaszek dla każdego rekombinowanego wirusa przez miejscowe skrobanie końcówką pipety i 100 μl 5% FBS zawierającego DMEM w celu przeniesienia komórek do probówki Eppendorfa, a następnie trzy rundy zamrażania i rozmrażania zeskrobanych komórek w celu uwolnienia rekombinowanych wirusów.
  7. Dodaj DMEM zawierający zamrożonego i rozmrożonego wirusa do monowarstwy komórek na 12-dołkowej płytce w celu amplifikacji rekombinowanych wirusów za pomocą odczynników selekcyjnych GPT w pożywce wzrostowej. Zeskrob udane amplifikacje 24 godziny po infekcji.
  8. Wykonaj test płytki z pomyślnie amplifikowanymi blaszkami wykazującymi czerwoną fluorescencję, tym razem z nakładką agarozową i selekcją GPT, w następujący sposób:
    1. Wysiewaj 6-dołkową płytkę z monowarstwą komórek BS-C-1.
    2. Wykonać seryjne rozcieńczanie rekombinowanych wirusów i zainfekować studzienki rosnącym rozcieńczeniem wirusów w DMEM wolnym od FBS.
    3. 1 godzinę po zakażeniu usuń płynne podłoże i pokryj każdą studzienkę 0,5% agarozą w minimalnym niezbędnym podłożu (MEM) zawierającym 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, wraz z odczynnikami selekcyjnymi GPT.
  9. 2-3 dni po infekcji wybierz blaszki wyświetlające fluorescencję, która jest zarówno czerwona, jak i kolor wybranego znacznika fluorescencyjnego, aby ponownie wzmocnić, tym razem bez wyboru GPT.
  10. Wykonaj następny test płytki nazębnej z nakładką agarozową bez selekcji.
  11. Wybierz blaszki, które utraciły swoją rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.
  12. Kontynuuj oczyszczanie płytki nazębnej bez selekcji, aby uzyskać czysty zapas rekombinowanych wirusów, które utraciły geny selekcji mCherry i gpt, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Sprawdź, czy zapasy są czyste za pomocą testu płytki nazębnej, wszystkie blaszki powinny mieć podobny fenotyp płytki.
  13. Stosuj badania przesiewowe PCR genomowego DNA, aby upewnić się, że stada wirusów są czyste.
    1. Zaprojektuj startery, które otaczają miejsce insercji genu fluorescencyjnego oraz startery, które wzmacniają sam wstawiony gen fluorescencyjny. Różne kombinacje tych starterów będą wytwarzać amplikony PCR, które wykryją insercję genu i wskażą czystość.
    2. Amplifikacja zapasów wirusa do badania przesiewowego PCR w jednym dołku monowarstwy 12-dołkowej płytki komórek BS-C-1.
    3. 24 godziny po zakażeniu zeskrob zainfekowane komórki do 250 μl DMEM.
    4. Odwirować zakażone komórki (18 000 x g przez 10 min, 4 °C), usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl TE (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA, pH 8) z 0,1% (v/v) SDS. Wir do lizy komórek.
    5. Dodać 500 μl akolu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego, odwrócić do mieszania. Wirówka (18 000 x g przez 4 min, 4 °C). Weź supernatant i powtórz.
    6. Przeprowadzić wytrącanie etanolu na supernatencie, dodając 1 ml 100% etanolu (schłodzonego) i 50 μl octanu sodu, odwrócić w celu wymieszania.
    7. Pozostawić w temperaturze -20 °C na noc lub -80 °C na 1 godzinę. Odwirować (18 000 x g przez 30 min, 4 °C), usunąć cały płyn i pozostawić wytrącone DNA do wyschnięcia na powietrzu. Zawiesić ponownie w 50 μl TE.
    8. Użyj tego jako szablonu do badań przesiewowych genomowego DNA PCR.

3. Generowanie rekombinowanych wirusów zawierających więcej niż jeden znacznik

  1. Współinfekować tę samą monowarstwę komórkową fluorescencyjnymi rekombinowanymi wirusami, aby utworzyć podwójnie lub potrójnie znakowane wirusy lub powtórzyć procedurę z Protokołu 1) z innym znacznikiem.
  2. Oczyszczanie wirusów na podstawie fenotypu płytki nazębnej lub badania przesiewowego PCR wirusa izolowanego genomowego DNA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia różne konstrukcje, które są wymagane do tej procedury, które są albo syntetyzowane (rysunki 1b i 1c), albo tworzone przez etapy klonowania (Rysunek 1d). Rysunek 2 przedstawia zarys procedury eksperymentalnej z reprezentatywnymi obrazami blaszek fluorescencyjnych rekombinowanego VACV A3-GFP przedstawionymi dla każdego etapu procesu selekcji. Na rycinie 3 pokazano rekombinowane wirusy krowianki wykazujące ekspresję białek oznaczonych markerami fluorescencyjnymi ukierunkowanymi na białka strukturalne wirusa A3 i F13, które są częścią odpowiednio wewnętrznego rdzenia wirusa23 i zewnętrznej otoczki24. Przedstawiono obserwacje blaszek wirusowych i zakażonych komórek dla każdego z utworzonych rekombinowanych wirusów. Przetestowano skuteczność homologicznej rekombinacji wektorów z genomem VACV, zawierającym zaledwie 70 pz regionów homologii do niego, a wyniki przedstawiono na rycinie 4. Względny sukces identyfikacji blaszek wirusowych powstałych w wyniku rekombinacji z wektorami zawierającymi homologię 100 pz był powodem wyboru syntezy lewego i prawego ramienia homologii o długości 150 pz do genu docelowego.

figure-results-1
Rysunek 1. Wektor rekombinacji przejściowej selekcji dominującej (TDS). (a) Wektor TDS ze znacznikami wyboru gpt i mCherry. (b) Lewe i prawe ramię homologii są zaprojektowane ze specyficznymi miejscami restrykcyjnymi pomiędzy ramionami homologii i po ich bokach. Miejscami restrykcyjnymi między lewym i prawym ramieniem używanymi w tej metodzie były NotI i BamHI, przy czym miejsce NotI było również używane jako łącznik między genem a znacznikiem fluorescencyjnym. c) Znaczniki fluorescencyjne zgodne z tą metodą są otoczone odpowiednimi miejscami ograniczającymi. Niektóre stosowane znaczniki to GFP (białko zielonej fluorescencji), RFP (białko czerwonej fluorescencji), Cerulean (ulepszenie ECFP, cyjanowego białka fluorescencyjnego, przez mutagenezę skierowanądo miejsca 25) i mini-SOG, białko fluorescencyjne zaprojektowane z GFP, które tworzy produkt rozpuszczalny przez EM przy oświetleniu26. (d) Etapy klonowania związane z generowaniem końcowego wektora rekombinacji TDS. Zsyntetyzowany oligonukleotyd zawierający lewe i prawe ramię boczne jest najpierw klonowany do wektora TDS. Zapewnia to wektor rekombinacji, do którego dowolny wybrany znacznik może być przenoszony do środka i na zewnątrz poprzez klonowanie do miejsc restrykcyjnych wbudowanych między lewe i prawe ramię. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

figure-results-2
Rysunek 2. Zarys procedury eksperymentalnej mającej na celu stworzenie rekombinowanego wirusa krowianki. Przedstawiono zdarzenia zachodzące na poziomie genetycznym i komórkowym, wraz z reprezentatywnymi obrazami płytki nazębnej przedstawiającymi etapy po utworzeniu fluorescencyjnego wirusa krowianki znakowanego A3-GFP. (A) Komórki zakażone wirusem krowianki są transfekowane wektorem rekombinacji TDS. (B) Na tym rysunku przedstawiono tylko wynik rekombinacji lewej strony, a w przykładzie użyto GFP jako wybranego znacznika fluorescencyjnego. Rekombinacja prawoskrętna skutkowałaby włączeniem całego plazmidu TDS do genomu w podobny sposób, z wyjątkiem tego, że znacznik zostałby połączony z całym genem docelowym na etapie pośrednim, tj. kroku C. Test płytki nazębnej przeprowadza się na monowarstwie komórki z mieszanką rekombinacyjną i poddaje selekcji GPT. (C) Blaszki wykazujące zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję, odpowiadające odpowiednio ekspresji mCherry i GFP, są wybierane i amplifikowane. Po usunięciu selekcji nastąpi utrata czerwonej fluorescencji odpowiadająca utracie genów gpt i mCherry (D), a blaszki wykazujące wyłącznie zieloną fluorescencję zostaną wybrane i amplifikowane (E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-3
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki systemu rekombinacji TDS. Obrazy przedstawiają całe blaszki rekombinowanych komórek infekujących VACV po 48 godzinach (a, c, e; podziałka 100 μm), wraz z obrazem pojedynczej komórki zakażonej odpowiednim rekombinowanym wirusem po 8 godzinach (b, d, f; podziałka 10 μm). Geny odpowiadające białkom zlokalizowanym w wirionie zostały wybrane do wizualizacji cząsteczek wirusa. A3 jest białkiem rdzeniowym wirionu krowianki (a, b), a F13 (c, d) jest białkiem otoczki wirusa. Pokazany jest również podwójnie znakowany wirus z fluorescencyjnie znakowanymi A3 i F13 (e, f). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-4
Rysunek 4. Analiza ilościowa skuteczności rekombinacji między wektorami rekombinowanymi a genomem VACV. Monowarstwy BS-C-1 zostały zakażone VACV i transfekowane 1 godzinę po zakażeniu trzema wektorami rekombinacyjnymi zawierającymi regiony homologii 500 pz, 100 pz lub 70 pz do genomu VACV. Każdy wektor zawierał również kasetę TDS zawierającą geny selekcyjne gpt i mCherry. Komórki odzyskano 24 godziny po zakażeniu i poddano lizie w celu uwolnienia powstałych rekombinowanych wirusów. Testy płytek miażdżycowych przeprowadzono na lizatach komórkowych z pożywką selekcyjną GPT, a blaszki wykazujące fluorescencję mCherry policzono jako udane rekombinanty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

figure-results-5
Rysunek 5. Mapa wektora TDS gpt-mCherry pokazująca miejsce wielokrotnego klonowania. Wektor został opisany wcześniej22, a mapa wektorowa została stworzona przy pomocy EZ Plasmid Map v1.9 firmy Zhang Lab Group (SCU). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika ta opisuje skuteczny i modułowy protokół tworzenia rekombinowanych wirusów, które wyrażają fluorescencyjnie znakowane białka wirusowe. Metoda zapewnia, że jedyną zmianą w genomie wirusa jest dodanie znacznika lub markera, nie pozostawiając żadnych markerów selekcyjnych. Krótka długość ramienia wymagana do rekombinacji homologicznej umożliwia jej bezpośrednią syntezę, eliminując kilka czasochłonnych rund PCR i klonowania, podczas gdy fluorescencja mCherry i metaboliczna selekcja GPT są wykorzystywane do izolowania produktów pośrednich rekombinacji wirusa. Te produkty pośrednie mogą zostać rozwiązane, po usunięciu selekcji, do wirusa ze znakowanym genem lub z powrotem do typu rodzicielskiego. Podobna metoda, obejmująca zastosowanie zarówno selekcji fluorescencyjnej, jak i metabolicznej, została opisana wcześniej27 , chociaż metoda zastosowana w tym badaniu wykorzystuje krótsze, zsyntetyzowane regiony homologii, umożliwiając identyfikację pożądanego rekombinowanego wirusa poprzez obrazowanie fluorescencji znakowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ta wtórna selekcja ma zastosowanie tylko do znakowania genów wirusowych o wysokiej ekspresji, które wytwarzają wystarczającą fluorescencję w teście płytki nazębnej. Alternatywnie można przewidzieć wprowadzenie kompletnej kasety ekspresyjnej, na przykład białka fluorescencyjnego pod silnym promotorem wirusowym. W tym przypadku lewe i prawe ramię określałyby punkt insercji, a nie gen wirusa, który ma zostać oznaczony.

Istnieje kilka kluczowych kroków, które okazały się pomocne podczas procedury eksperymentalnej. Płynna powłoka w kroku 2.3.3 opisana powyżej okazała się kluczowa dla wykrywania i izolowania czerwono-zielonych blaszek fluorescencyjnych. Uważamy, że połączenie odczynników selekcyjnych GPT i nakładki agarozowej powstrzymało wzrost rekombinowanych wirusów i dlatego przestawiono się na płynną nakładkę jako pierwszy etap amplifikacji wirusów po transfekcji. Ważne jest również, aby wybrać blaszki fluorescencyjne wykazujące zlokalizowaną fluorescencję koloru znacznika w celu wzbogacenia i oczyszczenia, ponieważ produkty pośrednie wynikające z rekombinacji lewego ramienia mogą powodować rozproszoną fluorescencję obserwowaną w blaszkach, jeśli lewe ramię zawiera również sekwencję promotorową. Gen markera mCherry w wektorze TDS może być również zastąpiony przez gfp, na przykład, aby umożliwić łatwe włączenie i wybór mCherry jako znacznika fluorescencyjnego.

Niektóre techniki opisane powyżej różnią się nieznacznie od ustalonych metod tworzenia rekombinowanego wirusa krowianki. Na przykład MOI wirusa używanego do tworzenia rekombinantów jest zwykle mniejszy niż 128, jednak użycie wyższych MOI było wystarczające do stworzenia rekombinowanego wirusa krowianki tą metodą. Stosowanie odczynników selekcyjnych GPT zwykle wymaga wstępnej inkubacji komórek za pomocą odczynników selekcyjnych18, jednak dodanie ich w fazie ratunkowej po infekcji nadal zapewniało wystarczającą selekcję pożądanych rekombinantów, szczególnie ze względu na obecność fluorescencyjnego markera selekcyjnego.

Jak wspomniano wcześniej, jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że etap selekcji fluorescencji wtórnej opiera się na wysokiej ekspresji znakowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania, na poziomie, który umożliwia jego wykrycie wzrokowo w teście płytki nazębnej. Bez tego możliwe byłoby oczyszczenie wirusów, które wykazywały tylko fluorescencję mCherry , z których co najmniej 50% zawierałoby pożądane wirusy rekombinowane, które można zidentyfikować za pomocą strategii molekularnych, takich jak PCR opisanych w kroku 2.12 powyżej. Innym ograniczeniem może być inaktywacja niektórych białek w wyniku ich znakowania. Znacznik fluorescencyjny może ulegać mutacjom lub zostać wycięty przez rekombinowany wirus z pasażowaniem w czasie. W związku z tym zaleca się regularne pobieranie próbek z rekombinowanych zapasów wirusa za pomocą mikroskopii i PCR. Wreszcie, może istnieć ograniczenie liczby fluorescencyjnie znakowanych białek, które mogą być włączone do pojedynczego wirusa. Jednym z aspektów tego jest możliwość wizualizacji ich wszystkich jednocześnie; Biorąc pod uwagę nakładający się na siebie charakter widm emisyjnych dostępnych znaczników fluorescencyjnych, ważne jest, aby starannie je dobierać, aby zapewnić minimalne przenikanie widma. Ponadto zastosowanie blisko spokrewnionych znaczników, takich jak GFP i Cerulean, otwiera możliwość rekombinacji między nimi, w zależności od ich lokalizacji w rekombinowanym genomie.

Modułowy charakter tej techniki umożliwia proste zastępowanie znaczników fluorescencyjnych w oparciu o kompatybilność z innymi opcjami barwienia i/lub znaczników. Poprzez wycinanie markerów wybieralnych, metoda TDS pozwala na seryjne dodawanie różnych białek fluorescencyjnych lub połączenie znakowania opartego na TDS z delecjami genów opartymi na TDS w analizach fenotypowych29. Jako przykład użyteczności tego podejścia wygenerowano podwójnie oznakowanego wirusa fluorescencyjnego, który znakuje rdzenie wirusa i błonę WV. Badania obrazowe z użyciem tego wirusa mogą być wykorzystane do badania ruchu, morfogenezy i owijania wirusa podczas replikacji wirusa. Niescharakteryzowane do tej pory białka wirusa krowianki mogą być również znakowane i badane za pomocą tej techniki.

Wirus krowianki jest szeroko stosowany w badaniach obrazowych ze względu na wiele cech wirusa, które są korzystne dla mikroskopii żywych komórek. Znaczniki fluorescencyjne ulegają ekspresji z genomu wirusa, eliminując potrzebę transfekcji, umożliwiając łatwą analizę komórek pierwotnych pochodzących od zakażonych zwierząt lub komórek nietransfekcyjnych. Początkowo fluorescencyjne VACV były używane do prostego subkomórkowego śledzenia ruchu wirusa30, ale nowsze podejścia rozszerzyły ich użyteczność o badania FRET31, FRAP na pojedynczych cząsteczkach wirusa32, reportery promotorów33, obrazowanie przyżyciowe34 i badania strukturalne35-37. Wszystkie te techniki mogą być w łatwiejszym i bliższym zasięgu w połączeniu z tą metodą tworzenia rekombinowanych wirusów fluorescencyjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych Federacji Discovery Project #1096623.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas mykofenolowySigma-AldrichM3536-50MGRozpuszcza się w 0,1 N NaOH
XanthineSigma-AldrichX0626-5GRozpuszcza się w 0,1 N NaoH
Odczynnik do transfekcji FuGENE HDPromegaE2311 
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry Chroma 31001, 31002Olympus, ChromaBX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przej ciowa selekcja dominuj carekombinacja homologicznagenerowanie wirusa rekombinowanegoznakowanie bia ek fluorescencyjnychtest plackowy wirusaselekcja metabolicznamikroskopia fluorescencyjnaprotok ekstrakcji DNA

Powiązane artykuły