Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Handel neutrofilami odgrywa kluczową rolę w określaniu postępu i rozwiązania wielu stanów zapalnych, w tym miażdżycy¹, infekcji bakteryjnej lub sepsy² i oparzeń³. Ze względu na ich duży wpływ na zdrowie i stany chorobowe, liczba neutrofili jest częścią standardowej analizy krwi, często rozważanej w laboratoriach klinicznych i badawczych. Jednak pomimo tego, że jest to jeden z najbardziej wszechobecnych testów, wartość liczby neutrofili w diagnostyce infekcji i sepsy jest często kwestionowana⁴. Na przykład jedno z badań neutrofili u pacjentów z oparzeniami wykazało, że liczba neutrofili i funkcja migracji neutrofili nie są ze sobą powiązane; Oznacza to, że sama liczba granulocytów obojętnochłonnych nie jest dokładnym wskaźnikiem stanu immunologicznego³. Chociaż trudniejsza do zmierzenia, kompetencja funkcjonalna neutrofili została zaproponowana jako bardziej wartościowa w szerokim zakresie warunków.

Co ważne, wiele defektów neutrofili jest przejściowych i nie są wywoływane przez trwałe wady genetyczne, rozróżnienie, które do niedawna było w dużej mierze pomijane w klinice. W kontekście oparzeń migracja neutrofili może być monitorowana w trakcie leczenia pacjenta jako wskaźnik stanu zapalnego lub infekcji³. Tradycyjne testy migracji stosowane obecnie w laboratorium (komora Boydena, komora Dunna, test mikropipet) nie mogą być przełożone na warunki kliniczne, ponieważ wymagają dużych objętości krwi i kłopotliwych, czasochłonnych technik izolacji neutrofili (Tabela 1). Testy te nie mogą być również wykorzystywane do monitorowania przejściowych zmian w chemotaksji neutrofili u małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, ponieważ objętość krwi potrzebna do izolacji neutrofili pozwala na pobranie tylko jednej próbki, a często wymaga nawet zebrania krwi od wielu zwierząt w jednym teście. Na przykład badanie obejmujące wiele schorzeń i metod leczenia w wielu punktach czasowych może potencjalnie wymagać tysięcy myszy przy użyciu obecnych testów chemotaksji. Ogranicza to podstawowe badania biologiczne, które można przeprowadzić, aby zrozumieć złożoną dynamikę funkcji immunologicznej w kontekście urazu, infekcji lub oparzenia, często badanych w modelach mysich⁵.

Aby zaspokoić potrzebę szybkiego i solidnego testu funkcjonalnego neutrofili, a jednocześnie wymagającego minimalnej objętości krwi, opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które mierzy chemotaksję neutrofili bezpośrednio z małej kropli krwi pełnej. Wiadomo, że wiele czynników we krwi pełnej, w tym surowica⁶ i płytki krwi⁷, wpływa na czynność neutrofili. Dlatego korzystne jest, że test mikroprzepływowy krwi pełnej minimalizuje przetwarzanie próbki w celu utrzymania mikrośrodowiska in vivo neutrofili podczas pomiaru zmian chemotaksji za pomocą testu in vitro ⁸. Takie podejście skraca czas od pobrania krwi do testów migracji neutrofili z godzin przy użyciu tradycyjnych technik do zaledwie minut (Tabela 1). Platforma mikroprzepływowa całej krwi wytwarza stabilny liniowy gradient chemoatraktantu przez cały czas trwania eksperymentu, nie ma ruchomych części i nie wymaga zewnętrznego źródła ciśnienia (np. pompy strzykawkowej). Kluczową cechą konstrukcji urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej jest włączenie grzebienia filtracyjnego do czerwonych krwinek (RBC), który mechanicznie filtruje krwinki czerwone przed wejściem do kanału migracyjnego urządzenia. Prawe zwoje tego grzebienia filtracyjnego zapobiegają potrzebie filtracji wykluczającej rozmiar, która prawdopodobnie zostałaby zatkana przez erytrocyty, a tym samym blokuje gradient chemoatraktantu przed dotarciem do aktywnie migrujących neutrofili w WB. Włączenie urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej w 12- lub 24-dołkowej płytce ułatwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu mediatorów chemotaksji neutrofili ludzkich lub mysich.

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

1. Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, wyprodukuj płytkę wzorcową w czystym pomieszczeniu klasy 1,000. Ułóż wzór pierwszej warstwy ujemnego fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej o grubości 3 μm, aby zdefiniować kanały migracji zgodnie z instrukcjami producenta. Ułóż wzór drugiej warstwy o grubości 50 μm, aby zdefiniować komory ładowania komórek i chemokin.
2. Użyj wzorzystej płytki do odlewania urządzeń z polidimetylosiloksanu (PDMS). Energicznie mieszaj PDMS (20 g) z inicjatorem (2 g) przez 5 minut za pomocą plastikowego widelca w dużej plastikowej wadze wagowej.
3. Ostrożnie wlej PDMS na formę.
4. Odgazowanie PDMS poprzez umieszczenie formy z wylanym PDMS w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę.
5. Piecz i utwardzaj urządzenia mikroprzepływowe PDMS przez co najmniej 3 godziny w piekarniku ustawionym na 65 °C.
6. Wytnij środkowe WBLC za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 1,5 mm.
7. Wykrawaj całe urządzenia w kształcie pączków za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 5,0 mm.
8. Usuń cząstki z urządzeń do pączków za pomocą taśmy klejącej.
9. Opłucz 12-dołkową płytkę wodą dejonizowaną, a następnie osusz azotem. Wstaw talerz do piekarnika o temperaturze 60 °C na 5 minut.
10. Plazma tlenowa potraktuj 12-dołkową płytkę dwukrotnie; raz samodzielnie przez 35 sekund, a następnie ponownie za pomocą urządzeń do pączków przez kolejne 35 sekund.
11. Ostrożnie umieść urządzenia w dołkach płyty za pomocą pęsety.
12. Piec blachę z połączonymi urządzeniami na płycie grzejnej ustawionej na 80 °C przez 10 minut.

2. Przygotowanie testu mikroprzepływowego

1. Urządzenia mikroprzepływowe należy zalać natychmiast po obróbce plazmą tlenową, gdy urządzenie jest hydrofilowe, a efekty kapilarne mogą sprzyjać zalewaniu małych kanałów w urządzeniu.
2. Stworzyć roztwór chemoatraktantu, mieszając 5 μl fMLP [roztwór podstawowy 10 μM] z 5 μl fibronektyny [roztwór podstawowy 1 mg/ml] i 490 μl HBSS.
3. Powoli pipetować roztwór chemoatraktantu do WBLC za pomocą końcówki do napełniania żelem (Rysunek 1A). Odpipetować dodatkowe 20 μl chemoatraktantu na zewnątrz urządzenia.
4. Umieścić płytkę w eksykatorze na 15 minut. Poprzez zastosowanie podciśnienia do urządzenia, roztwór jest wkraplany do bocznych kanałów urządzenia, a wyparte powietrze jest rozpraszane przez PDMS.
5. Wyjąć płytkę z eksykatora i potwierdzić zwilżenie kanału urządzenia pod mikroskopem. Obserwuj, jak pęcherzyk zmniejsza się, gdy roztwór chemoatraktantu dostaje się do komory. Po obróbce próżniowej w urządzeniu nie powinny znajdować się pęcherzyki.
6. Dokładnie umyj WBLC i zewnętrzną część urządzenia, aby usunąć nadmiar roztworu chemoatraktantu. Ten krok generuje gradient chemoatraktantu z każdej z ogniskowych komór chemotaktycznych (FCC) do centrum urządzenia.
   1. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml PBS, dodać do strzykawki końcówkę igły o stężeniu 30 g. Delikatnie włożyć końcówkę igły strzykawki w środek otworu na pączek. Delikatnie wepchnij 100 μl PBS do otworu, tak aby na górze urządzenia utworzyła się kropla PBS.
   2. Przechylić płytkę i odpipetować 1 ml PBS wokół urządzenia, tak aby płyn zebrał się na dnie studzienki. Zassać ciecz i powtórzyć proces w sumie 3 razy przy użyciu świeżego roztworu buforowego (użyj pożywki zamiast buforu, jeśli oddzielone neutrofile zostaną załadowane do pożywki)⁹.
7. Napełnij każdą studzienkę mediami, aż górne części urządzeń zostaną zanurzone w płynie. Pozostaw urządzenia na 15 minut, aby umożliwić ustabilizowanie się gradientu. Wyniki eksperymentalne i dane teoretyczne z symulacji elementów skończonych pokazują, że gradienty w tych urządzeniach są stabilne do 24 godzin dla małych cząsteczek (np. fMLP) i do kilku dni dla większych mas cząsteczkowych (np. IL8).
8. Używając końcówek do ładowania żelem, powoli pipetuj 2 μl krwi (lub wyizolowanych neutrofili) do każdej komory ładowania krwi pełnej (WBLC) (Rysunek 1A).

3. Przygotowanie próbki

Ludzkie neutrofile z krwi żylnej

3. Pobrać 10 ml obwodowej krwi żylnej do probówek zawierających 33 heparynę USP.
4. Dodać 50 μl krwi żylnej do pożywki i zabarwić metodą Hoechsta, jak opisano wcześniej. Inkubować krew i barwnik Hoechst przez 10 minut, aby umożliwić barwienie fluorescencyjne jądra. Uruchom próbkę w ciągu 1 godziny od pobrania krwi.

Oddzielenie neutrofili od krwi pełnej - kontrola pozytywna

5. Aby oddzielić neutrofile, należy użyć sterylnych technik do wyizolowania neutrofili z 10 ml próbki krwi pełnej żylnej przy użyciu gradientu gęstości hetaskrobi (6% w/v), a następnie zestawu do izolacji kulek magnetycznych o negatywnej selekcji zgodnie z protokołem producenta.
6. Zawiesiła końcową podwielokrotność neutrofili w stężeniu 4 000 komórek/μl w 1X HBSS + 0,2% albumina surowicy ludzkiej. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania do przeprowadzenia eksperymentu.

4. Mikroskopia i analiza obrazu do pomiarów chemotaksji neutrofili

1. Ustaw temperaturę biokomory na 37 °C, wilgotność na 80%, a CO₂ na 5%.
2. Natychmiast rozpocznij obrazowanie, korzystając z obrazowania poklatkowego pod mikroskopem (powiększenie 10x lub większe).

5. Analiza statystyczna

1. Ręcznie śledź co najmniej 50 neutrofili w każdej próbce.
2. Policz komórki wchodzące do FCC w czasie (Rysunek 2).
3. Oblicz prędkości neutrofili w kanale między WBLC i FCC za pomocą ImageJ (NIH) (rysunek 2).
4. Określ ilościowo kierunkowość neutrofili, licząc liczbę komórek, które przechodzą przez bifurkację i obliczając stosunek między liczbą komórek, które zwracają się w kierunku FCC, a komórkami, które opuszczają urządzenie. Komórki, które nie są kierunkowe, nie podążają za gradientem chemotaktycznym i dlatego migrują w równych ilościach w kierunku FCC i kanału wyjściowego (ryc. 2).

Test chemotaksji neutrofili we krwi pełnej (WB) został zweryfikowany poprzez pomiar akumulacji neutrofili w kierunku gradientu fMLP (Film S1). Wyniki potwierdzają, że erytrofile są wychwytywane przez grzebień filtracyjny, podczas gdy neutrofile (niebieskie) są w stanie aktywnie migrować z krwi pełnej (ryc. 3A i film S1). Stabilny liniowy gradient chemoatraktantu (zielony) utworzony przez urządzenie mikroprzepływowe krwi pełnej został potwierdzony za pomocą dekstranu znakowanego FITC (wstawka Figura 3A) i zmierzył poziomy fluorescencji w czasie. Gradienty wytwarzane w tych urządzeniach były stabilne do 24 godzin dla małych cząsteczek i do tygodnia dla większych mas cząsteczkowych. Skuteczność protokołu prania została zweryfikowana poprzez obrazowanie zlokalizowanego sygnału fluorescencyjnego w FCC bez sygnału w WBLC lub wokół urządzenia. Urządzenia te zostały następnie wykorzystane do oceny różnic w migracji neutrofili z różnych źródeł krwi.

Wyniki uzyskane za pomocą nowej platformy chemotaksji WB ujawniają, że neutrofile z kropli WB nakłutej palcem, z żylnego WB lub wyizolowane z krwi żylnej migrują ze stałą prędkością (20 ± 2 mm/min, niebieska linia) i z podobną całkowitą liczbą komórek migrujących (38 ± 10 komórek/godz., zacienione paski) ze wszystkich źródeł krwi (Rysunek 3B). Byliśmy również w stanie określić ilościowo kierunkowość lub zdolność neutrofili do prawidłowego podążania za gradientem chemotaktycznym. Bifurkacja zastosowana w projekcie urządzenia do krwi pełnej pozwoliła nam określić ilościowo neutrofile, które migrowały kierunkowo wzdłuż gradientu chemoatraktantu w kierunku FCC, w porównaniu z neutrofilami, które migrowały losowo pod wpływem chemokinezy i opuszczały urządzenie. Neutrofile migrujące ze wszystkich trzech źródeł krwi migrowały ze wskaźnikiem kierunkowości 0,9 (9 komórek w kierunku FCC na każdą komórkę, która opuściła urządzenie).

Rysunek 1. Schemat urządzenia w kształcie pączka. A) Chemoatraktant jest zalewany do urządzenia, a wzdłuż kanału migracyjnego tworzy się gradient w kierunku ogniskowych komór chemotaksji (FCC). Szesnaście FCC otacza każdy WBLC. Po umyciu chemoatraktant pozostaje tylko w FCC, a wzdłuż kanału migracyjnego tworzy się gradient liniowy. Grzebień filtracji czerwonych krwinek (RBC) zapobiega zatykaniu kanału przez erytrocyty i blokowaniu aktywnej migracji neutrofili. Zobacz film S1. B) Neutrofile aktywnie migrują z krwi pełnej i gromadzą się w FCC, a ich prędkość, kierunkowość i liczbę można dokładnie określić ilościowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat i przegląd schematu zliczania komórek dla urządzenia WB. Neutrofile aktywnie migrują z 2 μl krwi pełnej (WB) załadowanej do komory ładowania krwi pełnej (WBLC) przez grzebień do filtracji krwinek czerwonych i do wejścia do urządzenia. Kierunkowość komórki jest mierzona na podstawie decyzji komórki w momencie bifurkacji. Kierunkowe neutrofile będą podążać za gradientem chemotaktycznym prowadzącym w kierunku ogniskowej komory chemotaksji, a komórki bezkierunkowe nie będą podążać za gradientem i będą losowo migrować w kierunku kanału wyjściowego lub FCC z równym rozkładem. Ostateczna liczba komórek jest obliczana w każdym punkcie czasowym poprzez zliczanie komórek w FCC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Pomiar chemotaksji neutrofili z kropli krwi pełnej (WB). A) WB (1 μl) jest ładowany do komory ładowania krwi pełnej (WBLC). Neutrofile (niebieskie) migrują wzdłuż gradientu chemotaktycznego fMLP utworzonego w kanale migracyjnym w kierunku FCC. B) Neutrofile z kropli WB po nakłuciu palca, z żyły WB lub wyizolowane z krwi żylnej migrują ze stałą liczbą (słupkami) i prędkością (niebieska linia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Porównanie protokołów chemotaksji neutrofili przy użyciu platformy mikroprzepływowej krwi pełnej z urządzeniem mikroprzepływowym kanału bocznego i tradycyjną komorą Boydena. Czas i odczynniki potrzebne do wykonania każdego kroku protokołu są porównywane między różnymi metodami pomiaru chemotaksji neutrofili. Platforma mikroprzepływowa krwi pełnej skraca całkowity czas potrzebny do przeprowadzenia testu o 95%, a wymaganą objętość krwi >99%.

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.