Artykuł metodologiczny

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

DOI:

10.3791/51215

⸱

3 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1The BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Medical School, 3Shriners Burns Hospital, 4Harvard University School of Engineering and Applied Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile odgrywają istotną rolę w ochronie przed infekcjami, a ich liczba we krwi jest często mierzona w klinice. Wyższa liczba granulocytów obojętnochłonnych we krwi jest zwykle wskaźnikiem trwających infekcji, podczas gdy niska liczba neutrofili jest znakiem ostrzegawczym dla większego ryzyka infekcji. Aby spełniać swoje funkcje, neutrofile muszą również być w stanie skutecznie przemieszczać się z krwi, w której spędzają większość swojego życia, do tkanek, w których dochodzi do infekcji. W związku z tym wszelkie defekty w zdolności neutrofili do migracji mogą zwiększać ryzyko infekcji, nawet jeśli neutrofile są obecne we krwi w odpowiedniej liczbie. Jednak pomiar zdolności migracji neutrofili w klinice jest trudnym zadaniem, które jest czasochłonne, wymaga dużej objętości krwi i wiedzy specjalistycznej. Aby rozwiązać te problemy, zaprojektowaliśmy solidne testy mikroprzepływowe do migracji neutrofili, które wymagają pojedynczej kropli nieprzetworzonej krwi, omijają potrzebę separacji neutrofili i są łatwe do ilościowego określenia pod prostym mikroskopem. W tym teście neutrofile migrują bezpośrednio z kropelki krwi, małymi kanałami, w kierunku źródła chemoatraktantu. Aby zapobiec ziarnistemu przepływowi czerwonych krwinek przez te same kanały, zastosowaliśmy filtry mechaniczne ze zwojami pod kątem prostym, które selektywnie blokują postęp czerwonych krwinek. Zwalidowaliśmy test, porównując migrację neutrofili z kropelek krwi pobranych z nakłucia palca i krwi żylnej. Porównaliśmy również te źródła krwi pełnej (WB) z migracją neutrofili z próbek oczyszczonych neutrofili i stwierdziliśmy stałą prędkość i kierunkowość między trzema źródłami. Ta platforma mikroprzepływowa umożliwi badanie migracji neutrofili u ludzi w warunkach klinicznych i badawczych, aby pomóc w lepszym zrozumieniu funkcji neutrofili w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Handel neutrofilami odgrywa kluczową rolę w określaniu postępu i rozwiązania wielu stanów zapalnych, w tym miażdżycy1, infekcji bakteryjnej lub sepsy2 i oparzeń3. Ze względu na ich duży wpływ na zdrowie i stany chorobowe, liczba neutrofili jest częścią standardowej analizy krwi, często rozważanej w laboratoriach klinicznych i badawczych. Jednak pomimo tego, że jest to jeden z najbardziej wszechobecnych testów, wartość liczby neutrofili w diagnostyce infekcji i sepsy jest często kwestionowana4. Na przykład jedno z badań neutrofili u pacjentów z oparzeniami wykazało, że liczba neutrofili i funkcja migracji neutrofili nie są ze sobą powiązane; Oznacza to, że sama liczba granulocytów obojętnochłonnych nie jest dokładnym wskaźnikiem stanu immunologicznego3. Chociaż trudniejsza do zmierzenia, kompetencja funkcjonalna neutrofili została zaproponowana jako bardziej wartościowa w szerokim zakresie warunków.

Co ważne, wiele defektów neutrofili jest przejściowych i nie są wywoływane przez trwałe wady genetyczne, rozróżnienie, które do niedawna było w dużej mierze pomijane w klinice. W kontekście oparzeń migracja neutrofili może być monitorowana w trakcie leczenia pacjenta jako wskaźnik stanu zapalnego lub infekcji3. Tradycyjne testy migracji stosowane obecnie w laboratorium (komora Boydena, komora Dunna, test mikropipet) nie mogą być przełożone na warunki kliniczne, ponieważ wymagają dużych objętości krwi i kłopotliwych, czasochłonnych technik izolacji neutrofili (Tabela 1). Testy te nie mogą być również wykorzystywane do monitorowania przejściowych zmian w chemotaksji neutrofili u małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, ponieważ objętość krwi potrzebna do izolacji neutrofili pozwala na pobranie tylko jednej próbki, a często wymaga nawet zebrania krwi od wielu zwierząt w jednym teście. Na przykład badanie obejmujące wiele schorzeń i metod leczenia w wielu punktach czasowych może potencjalnie wymagać tysięcy myszy przy użyciu obecnych testów chemotaksji. Ogranicza to podstawowe badania biologiczne, które można przeprowadzić, aby zrozumieć złożoną dynamikę funkcji immunologicznej w kontekście urazu, infekcji lub oparzenia, często badanych w modelach mysich5.

Aby zaspokoić potrzebę szybkiego i solidnego testu funkcjonalnego neutrofili, a jednocześnie wymagającego minimalnej objętości krwi, opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które mierzy chemotaksję neutrofili bezpośrednio z małej kropli krwi pełnej. Wiadomo, że wiele czynników we krwi pełnej, w tym surowica6 i płytki krwi7, wpływa na czynność neutrofili. Dlatego korzystne jest, że test mikroprzepływowy krwi pełnej minimalizuje przetwarzanie próbki w celu utrzymania mikrośrodowiska in vivo neutrofili podczas pomiaru zmian chemotaksji za pomocą testu in vitro 8. Takie podejście skraca czas od pobrania krwi do testów migracji neutrofili z godzin przy użyciu tradycyjnych technik do zaledwie minut (Tabela 1). Platforma mikroprzepływowa całej krwi wytwarza stabilny liniowy gradient chemoatraktantu przez cały czas trwania eksperymentu, nie ma ruchomych części i nie wymaga zewnętrznego źródła ciśnienia (np. pompy strzykawkowej). Kluczową cechą konstrukcji urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej jest włączenie grzebienia filtracyjnego do czerwonych krwinek (RBC), który mechanicznie filtruje krwinki czerwone przed wejściem do kanału migracyjnego urządzenia. Prawe zwoje tego grzebienia filtracyjnego zapobiegają potrzebie filtracji wykluczającej rozmiar, która prawdopodobnie zostałaby zatkana przez erytrocyty, a tym samym blokuje gradient chemoatraktantu przed dotarciem do aktywnie migrujących neutrofili w WB. Włączenie urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej w 12- lub 24-dołkowej płytce ułatwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu mediatorów chemotaksji neutrofili ludzkich lub mysich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, wyprodukuj płytkę wzorcową w czystym pomieszczeniu klasy 1,000. Ułóż wzór pierwszej warstwy ujemnego fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej o grubości 3 μm, aby zdefiniować kanały migracji zgodnie z instrukcjami producenta. Ułóż wzór drugiej warstwy o grubości 50 μm, aby zdefiniować komory ładowania komórek i chemokin.
  2. Użyj wzorzystej płytki do odlewania urządzeń z polidimetylosiloksanu (PDMS). Energicznie mieszaj PDMS (20 g) z inicjatorem (2 g) przez 5 minut za pomocą plastikowego widelca w dużej plastikowej wadze wagowej.
  3. Ostrożnie wlej PDMS na formę.
  4. Odgazowanie PDMS poprzez umieszczenie formy z wylanym PDMS w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę.
  5. Piecz i utwardzaj urządzenia mikroprzepływowe PDMS przez co najmniej 3 godziny w piekarniku ustawionym na 65 °C.
  6. Wytnij środkowe WBLC za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 1,5 mm.
  7. Wykrawaj całe urządzenia w kształcie pączków za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 5,0 mm.
  8. Usuń cząstki z urządzeń do pączków za pomocą taśmy klejącej.
  9. Opłucz 12-dołkową płytkę wodą dejonizowaną, a następnie osusz azotem. Wstaw talerz do piekarnika o temperaturze 60 °C na 5 minut.
  10. Plazma tlenowa potraktuj 12-dołkową płytkę dwukrotnie; raz samodzielnie przez 35 sekund, a następnie ponownie za pomocą urządzeń do pączków przez kolejne 35 sekund.
  11. Ostrożnie umieść urządzenia w dołkach płyty za pomocą pęsety.
  12. Piec blachę z połączonymi urządzeniami na płycie grzejnej ustawionej na 80 °C przez 10 minut.

2. Przygotowanie testu mikroprzepływowego

  1. Urządzenia mikroprzepływowe należy zalać natychmiast po obróbce plazmą tlenową, gdy urządzenie jest hydrofilowe, a efekty kapilarne mogą sprzyjać zalewaniu małych kanałów w urządzeniu.
  2. Stworzyć roztwór chemoatraktantu, mieszając 5 μl fMLP [roztwór podstawowy 10 μM] z 5 μl fibronektyny [roztwór podstawowy 1 mg/ml] i 490 μl HBSS.
  3. Powoli pipetować roztwór chemoatraktantu do WBLC za pomocą końcówki do napełniania żelem (Rysunek 1A). Odpipetować dodatkowe 20 μl chemoatraktantu na zewnątrz urządzenia.
  4. Umieścić płytkę w eksykatorze na 15 minut. Poprzez zastosowanie podciśnienia do urządzenia, roztwór jest wkraplany do bocznych kanałów urządzenia, a wyparte powietrze jest rozpraszane przez PDMS.
  5. Wyjąć płytkę z eksykatora i potwierdzić zwilżenie kanału urządzenia pod mikroskopem. Obserwuj, jak pęcherzyk zmniejsza się, gdy roztwór chemoatraktantu dostaje się do komory. Po obróbce próżniowej w urządzeniu nie powinny znajdować się pęcherzyki.
  6. Dokładnie umyj WBLC i zewnętrzną część urządzenia, aby usunąć nadmiar roztworu chemoatraktantu. Ten krok generuje gradient chemoatraktantu z każdej z ogniskowych komór chemotaktycznych (FCC) do centrum urządzenia.
    1. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml PBS, dodać do strzykawki końcówkę igły o stężeniu 30 g. Delikatnie włożyć końcówkę igły strzykawki w środek otworu na pączek. Delikatnie wepchnij 100 μl PBS do otworu, tak aby na górze urządzenia utworzyła się kropla PBS.
    2. Przechylić płytkę i odpipetować 1 ml PBS wokół urządzenia, tak aby płyn zebrał się na dnie studzienki. Zassać ciecz i powtórzyć proces w sumie 3 razy przy użyciu świeżego roztworu buforowego (użyj pożywki zamiast buforu, jeśli oddzielone neutrofile zostaną załadowane do pożywki)9.
  7. Napełnij każdą studzienkę mediami, aż górne części urządzeń zostaną zanurzone w płynie. Pozostaw urządzenia na 15 minut, aby umożliwić ustabilizowanie się gradientu. Wyniki eksperymentalne i dane teoretyczne z symulacji elementów skończonych pokazują, że gradienty w tych urządzeniach są stabilne do 24 godzin dla małych cząsteczek (np. fMLP) i do kilku dni dla większych mas cząsteczkowych (np. IL8).
  8. Używając końcówek do ładowania żelem, powoli pipetuj 2 μl krwi (lub wyizolowanych neutrofili) do każdej komory ładowania krwi pełnej (WBLC) (Rysunek 1A).

3. Przygotowanie próbki

Ludzkie neutrofile z krwi żylnej

  1. Pobrać 10 ml obwodowej krwi żylnej do probówek zawierających 33 heparynę USP.
  2. Dodać 50 μl krwi żylnej do pożywki i zabarwić metodą Hoechsta, jak opisano wcześniej. Inkubować krew i barwnik Hoechst przez 10 minut, aby umożliwić barwienie fluorescencyjne jądra. Uruchom próbkę w ciągu 1 godziny od pobrania krwi.

Oddzielenie neutrofili od krwi pełnej - kontrola pozytywna

  1. Aby oddzielić neutrofile, należy użyć sterylnych technik do wyizolowania neutrofili z 10 ml próbki krwi pełnej żylnej przy użyciu gradientu gęstości hetaskrobi (6% w/v), a następnie zestawu do izolacji kulek magnetycznych o negatywnej selekcji zgodnie z protokołem producenta.
  2. Zawiesiła końcową podwielokrotność neutrofili w stężeniu 4 000 komórek/μl w 1X HBSS + 0,2% albumina surowicy ludzkiej. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania do przeprowadzenia eksperymentu.

4. Mikroskopia i analiza obrazu do pomiarów chemotaksji neutrofili

  1. Ustaw temperaturę biokomory na 37 °C, wilgotność na 80%, a CO2 na 5%.
  2. Natychmiast rozpocznij obrazowanie, korzystając z obrazowania poklatkowego pod mikroskopem (powiększenie 10x lub większe).

5. Analiza statystyczna

  1. Ręcznie śledź co najmniej 50 neutrofili w każdej próbce.
  2. Policz komórki wchodzące do FCC w czasie (Rysunek 2).
  3. Oblicz prędkości neutrofili w kanale między WBLC i FCC za pomocą ImageJ (NIH) (rysunek 2).
  4. Określ ilościowo kierunkowość neutrofili, licząc liczbę komórek, które przechodzą przez bifurkację i obliczając stosunek między liczbą komórek, które zwracają się w kierunku FCC, a komórkami, które opuszczają urządzenie. Komórki, które nie są kierunkowe, nie podążają za gradientem chemotaktycznym i dlatego migrują w równych ilościach w kierunku FCC i kanału wyjściowego (ryc. 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test chemotaksji neutrofili we krwi pełnej (WB) został zweryfikowany poprzez pomiar akumulacji neutrofili w kierunku gradientu fMLP (Film S1). Wyniki potwierdzają, że erytrofile są wychwytywane przez grzebień filtracyjny, podczas gdy neutrofile (niebieskie) są w stanie aktywnie migrować z krwi pełnej (ryc. 3A i film S1). Stabilny liniowy gradient chemoatraktantu (zielony) utworzony przez urządzenie mikroprzepływowe krwi pełnej został potwierdzony za pomocą dekstranu znak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tej pracy opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do pomiaru chemotaksji neutrofili z kropli krwi (2 μl). Wbudowana w układ mechaniczny filtracja erytrocytów z aktywnie migrujących neutrofili pozwala uniknąć konieczności stosowania kłopotliwych metod separacji komórek, takich jak gradienty gęstości10, selekcja pozytywna11 lub selekcja ujemna12, które są podatne na wprowadzanie artefaktów poprzez aktywację neutrofili. Mechaniczna filtracja erytrocytów odróżnia naszą technologię o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie ze strony National Institutes of Health (granty GM092804, DE019938) i Shriners Burns Hospital.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Device Fabrication
SU-8MicrochemY131273
Polidimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth AdhesivesSylgard 184 1,1 funta Zestaw
Standardowe prowadniceszklane Fisher Scientific125495 1 X 3 cale
Płyta ze szklanym dnemMatTekP12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, średnica końcówki 5,0 mmTed Pella, Inc.15081
- Harris Uni-Core - Średnica końcówki 1,5 mmTed Pella, Inc.15072
Przygotowanie i analiza testów mikroprzepływowych
Końcówka do pipety ładującej żelFisher Scientific02-707-139
StrzykawkaFisher Scientfic309602
Igła z końcówką, 30 G ½ in.Brico Medical SupplyBN3005
Vacutainer, HeparynaBecton Dickinson
HBSSSigma-Aldrich
Albumina surowicy ludzkiejSigma-AldrichA5843-5G0,2% stężenie końcowe w HBSS
FibronectinSigma-AldrichF0895-1MG
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
Nakłuwacz bezpieczny SurgiLance, głębokość 2,2 mm, 22 GSLN240
Hoescht stainLife TechnologiesH3570
Positive Control
HetaSepSTEMCELL Technologies Inc.7906
Zestaw do wzbogacania ludzkich neutrofili EasySep STEMCELLTechnologies Inc.19257
Plasma AsherMarch InstrumentsP-250
Lindberg/Blue M PiekarnikThermo Scientific13-258-30C
Precyzyjna pęseta ze stali nierdzewnejNarzędzie techniczne758TW458
Bel-Art Scienceware Odporny na chemikalia eksykator próżniowyFisher Scientific08-594-15A Tabliczka
znamionowa Cyfrowa płyta grzejnaAlpha MultiservicesPMC 720
Nikon TiENikon - Micro Video Instruments Inc.
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd ObiektywNikon - Micro Video Instruments Inc.
Lumen 200 z 2-metrowym światłowodem do NikonNikon - Micro Video Instruments Inc.500-L200NI2
Wzbudnice wąskopasmowe DAPI/Hoechst/AMCA 32 mm - Emitery 25 mmChroma - Micro Video Instruments Inc.31013v2
Chłodzona kamera CCD Retiga R 2000 1,600 x 1,200 pikseliQimaging - Micro Video Instruments Inc.RET-2000R-F-M-12-C
Mikroskop odwrócony MEA53100MRH20101

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
  4. Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
  5. De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
  6. Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
  7. Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
  8. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
  9. Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
  10. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
  11. Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
  12. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
  13. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
  14. Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
  15. Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
  16. Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
  17. Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza krwi pe nejmigracja neutrofiligradient chemotaktycznyfiltracja erytrocyt wobrazowanie poklatkoweanaliza pojedynczych kom rekmikrofluidyka PDMSkrew z nak ucia palca

Powiązane artykuły