Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

Podsumowanie

Prezentujemy nową technikę fluorescencji do selektywnego znakowania in situ aktywnych komórek fagocytarnych, które usuwają zwłoki komórek po udarze. Podejście to jest ważne dla oceny reakcji mózgu na niedokrwienie, ponieważ tylko niewielka część fagocytów obecnych w niedokrwionym mózgu uczestniczy w usuwaniu śmierci komórki.

Streszczenie

Opisujemy nowe podejście histochemiczne do wizualizacji klirensu fagocytarnego w ogniskowym niedokrwieniu mózgu. Podejście to pozwala na badanie eliminacji martwych komórek w udarze mózgu przez fagocyty gospodarujące odpadami dowolnej linii komórkowej. Chociaż w niedokrwionym mózgu obecne są liczne komórki różnego pochodzenia, które są zdolne do fagocytozy, tylko część z nich aktywnie pochłania i trawi zwłoki komórek. Selektywna wizualizacja, kwantyfikacja i analiza takiego aktywnego gospodarowania odpadami fagocytarnymi są pomocne w ocenie reakcji mózgu na niedokrwienie. Skuteczne usuwanie śmierci komórkowej jest ważne dla regeneracji mózgu po urazie niedokrwiennym, ponieważ otwiera drogę do późniejszych procesów regeneracyjnych. Nieoczyszczenie zwłok skutkowałoby reakcją toksyczną wywołaną przez niezdegradowane DNA i białka. W opisanej procedurze wykorzystuje się sondy fluorescencyjne selektywnie ligowane przez wirusową topoizomerazę do charakterystycznych pęknięć DNA powstających we wszystkich fagocytach podczas pochłaniania i trawienia komórek nieodwracalnie uszkodzonych przez niedokrwienie. Metoda ta jest nowym narzędziem do badania reakcji mózgu na uszkodzenie niedokrwienne.

Wprowadzenie

Udar niedokrwienny powoduje głębokie zmiany w tkance mózgowej, której dotyczy problem. Inicjuje masywną śmierć komórki, co prowadzi do szybkiej aktywacji rezydentnych komórek fagocytarnych pochodzenia mikroglejowego. Uruchamia również infiltrację niedokrwionego mózgu przez różne typy profesjonalnych fagocytów pochodzących z krwi, w tym neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne i mastoczne^1,2.

Nadal dyskutuje się, czy ta reakcja na uraz niedokrwienny odgrywa pozytywną czy negatywną rolę. Chociaż fagocytoza po udarze może być korzystna, ponieważ usuwa martwe komórki i tłumi stan zapalny, generuje również toksyczne reaktywne formy tlenu, wpływając na przeżycie neuronów i nasilając uszkodzenia tkanek^1-5.

Podczas gdy kilka typów komórek fagocytarnych infiltruje niedokrwiony mózg, nie wszystkie z nich uczestniczą w gospodarce odpadami, pochłaniając zwłoki komórek i torując drogę procesom regeneracyjnym^1-3. Stwarza to wymóg selektywnej identyfikacji komórek gospodarujących odpadami, które przeprowadzają fagocytarny klirens śmierci komórki w udarze mózgu. Podczas obrazowania takich aktywnych komórek gospodarujących odpadami ważne jest również znalezienie odpowiedzi na pytanie, jak skutecznie rozkładają one pochłonięte zwłoki komórek. Skuteczna i całkowita degradacja DNA umierającej komórki w fagocytozie jest niezbędna, ponieważ zapobiega samouodparnianiu się i uwalnianiu patologicznego materiału jądrowego⁶.

Tutaj prezentujemy nowe sondy, które wykorzystują specyficzne pęknięcia DNA jako markery aktywnych komórek fagocytarnych. Te charakterystyczne pęknięcia powstają wyłącznie podczas rozpadu pochłoniętych jąder w funkcjonalnych komórkach gospodarki odpadami. Dlatego sondy selektywnie znakują tylko te fagocyty, które pochłaniają i aktywnie trawią zwłoki komórkowe. Pozwalają również na obserwację intensywności i zakończenia rozpadu DNA po pochłonięciu. Sondy są pomocne w ocenie intensywności i skuteczności klirensu fagocytarnego.
Nowe sondy opierają się na markerze nieopartym na białku i dlatego mogą być szczególnie korzystne w badaniach nad udarem, w których rozległe uszkodzenie niedokrwienne może zakłócić morfologię komórkową lub zubożyć markery białkowe, zwłaszcza w strefie niedokrwiennej rdzenia.

Zasada techniki jest przedstawiona na rysunku 1. Rysunek przedstawia sondy oligonukleotydowe w kształcie spinki do włosów ligowane przez enzym topizomerazę krowianki (VACC TOPO) do końców DNA 5'OH generowanych przez lizosomalną DNazę II podczas trawienia DNA⁷.

Protokół

Metoda jest odpowiednia dla utrwalonych formaldehydem, zatopionych w parafinie skrawków tkanki. Technika ta jest tutaj zademonstrowana w jej zastosowaniu do eksperymentalnego udaru mózgu u szczurów.

1. Przygotowanie komponentów do systemu wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA)

Chociaż ulepszenie oparte na TSA jest używane w końcowym etapie etykietowania, przygotowanie do tej reakcji może zająć więcej niż 1 godzinę. Dlatego wygodnie jest przygotować odczynniki TSA przed rozpoczęciem etykietowania.

1. Zrobić roztwór podstawowy tyramidu fluoroforowego. Użyć odczynnika tyramidowego fluoroforowego dostarczanego w oddzielnych fiolkach z zestawem do etykietowania TSA. Dodać 300 μl DMSO do fiolki z odczynnikiem tyramidu. Roztwór podstawowy tyramidu fluoroforowego jest stabilny przez co najmniej 3 miesiące, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. Przygotuj bufor do płukania TNT zawierający: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. W razie potrzeby 0,3% Triton X-100 można zastąpić 0,05% Tween-20. Alternatywnie PBS może być używany jako bufor do mycia.
3. Przygotować bufor blokujący TNB zawierający: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% odczynnik blokujący (dostarczany z zestawem). Aby całkowicie rozpuścić odczynnik blokujący, powoli dodawaj go małymi porcjami do buforu, mieszając. Podgrzewać ten roztwór stopniowo do temperatury 55 °C, ciągle mieszając. Może to zająć 30-60 minut. Roztwór będzie mleczny. Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.

2. Przygotowanie sekcji

Użyj szkiełek z zamontowanymi sekcjami o grubości 5 μm, wyciętymi z tkanek utrwalonych formaliną.

1. Traktuj skrawki ksylenem przez 15 minut.
2. Nawadniaj sekcje w następujący sposób: moczyć w 96% EtOH 2x przez 5 min każda; moczyć w 80% EtOH przez 5 min; myć wodą 2x po 5 min każda.
3. Przygotować roztwór roboczy proteinazy K, rozcieńczając roztwór podstawowy proteinazy K do 50 μg/ml w PBS.
4. Dodaj roztwór roboczy proteinazy K do sekcji. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 °C. Objętość roztworu i czas trawienia mogą wymagać dostosowania w zależności od wielkości skrawków i typów tkanek. Dla małego (poniżej 5 mm średnicy) przekroju wystarczy 50 μl roztworu proteinazy. W przypadku przekroju średniej wielkości (~10 mm średnicy) dodać 100 μl roztworu proteinazy K. W przypadku bardzo dużych odcinków objętość rozwiązania może być skalowana w górę. We wszystkich przypadkach należy zadbać o to, aby nie dopuścić do nadmiernego trawienia odcinków, co prowadzi do całkowitej utraty sygnału i niszczy morfologię tkanek. Dzieje się tak często, gdy czas inkubacji przekracza 25 minut.
5. Umyj sekcje w wodzie destylowanej 2x po 5 min każdy. Przygotuj mieszankę do etykietowania zawierającą aktywną sondę, gdy sekcje znajdują się w wodzie.

3. Barwienie oparte na VACC TOPO

1. Przygotuj aktywny roztwór sondy, łącząc następujące elementy:
   Woda - 11,75 μl
   1 M Tris-HCl, pH 7,4 - 1,25 μl
   100 pmol 12-zasadowego oligonukleotydu samobójczego - 1 μl
   100 pmol oligonukleotydu adapterowego - 1 μl
   50 pmol VACC TOPO - 10 μl
2. Delikatnie wymieszać, pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej (23 °C) przez 15 minut, aby umożliwić aktywację sondy.
3. Weź skrawki ze słoika do mycia i odessaj pozostałą wodę. Następnie nanieść aktywny roztwór sondy przygotowany w kroku 3.1 (25 μl na odcinek ~10 x 10 mm).
4. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć i inkubować przez 15 minut w temperaturze 23 °C. Zanurzyć szkiełka podstawowe w wodzie, aby delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe. Prać w wodzie 3x po 5 min.

4. Wzmocnienie sygnału TSA

1. Skrawki tkanek przykryć przygotowanym wcześniej buforem blokującym TNB i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej (23 °C).
2. Przygotować rozcieńczenie 1:100 koniugatów streptawidyny i peroksydazy chrzanowej (SA-HRP) w buforze blokującym TNB. Odessać bufor blokujący TNB i zastosować roztwór SA-HRP. Inkubować szkiełka z SA-HRP przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj odpowiedniej objętości odczynnika, aby pokryć wycinek tkanki, zwykle 100 μl na sekcjon.
3. Myj szkiełka 3x po 5 minut w buforze do płukania TNT (lub PBS) w temperaturze pokojowej.
4. Przygotuj rozcieńczenie 1:50 wywaru tyramidowego fluoroforu w 1x rozcieńczalnik Amplifikacji z zestawu. Odpipetować roztwór roboczy tyramidu fluoroforowego na każde szkiełko. Użyj wystarczającej ilości roztworu roboczego, aby całkowicie pokryć wycinek tkanki, zwykle 100 μl na sekcję. Przygotuj roztwór roboczy tyramidu fluoroforowego bezpośrednio przed każdym etykietowaniem. Roztwór nie może być ponownie użyty, więc po oznakowaniu wyrzuć każdą niewykorzystaną jego część.
5. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 3 do 10 minut. Monitorować wzrost fluorescencji pod mikroskopem, aż pojawią się pierwsze oznaki struktur. Szybko przejdź do etapu prania.
6. Szkiełka myć 3x po 5 minut w buforze do płukania TNT (lub PBS) w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
7. Dodaj roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI i szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Do wizualizacji fluorescencji DAPI i FITC należy użyć zestawu filtrów pasmowo-przepustowych:
   wzbudzenie FITC D490/40, emisja 520/10; Wzbudzenie DAPI D360/40, emisja 460/20 lub podobne.

Wyniki

Zasada techniki oznaczania fagocytów do aktywnego gospodarowania odpadami jest przedstawiona na rysunku 1. Na schemacie widać, że detekcja przebiega w trzech krokach. Pierwszy etap obejmuje aktywację sondy (rysunek 1A); w drugim etapie aktywowana sonda jest podwiązywana do określonych pęknięć DNA w skrawkach tkanek (ryc. 1C); trzeci etap obejmuje wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego (rysunek 1D). W bard...

Dyskusja

W tym filmie pokazujemy, w formacie sekcji tkanki, jak oznaczać aktywne fagocyty, które usuwają śmierć komórki w ogniskowym niedokrwieniu mózgu. Przedstawiona technika jest pierwszym podejściem, które w szczególności oznacza tylko te komórki gospodarki odpadami, które pochłonęły i aktywnie trawią zwłoki komórkowe. To sprawia, że jest korzystny w stosunku do innych istniejących metod znakowania komórek fagocytarnych, które nie mają tej zdolności.

W metodzie wykorzystuje się ogólny i selektywny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ksylen	JT Baker	9490-22
Proteinaza etanolowa
K	Roche	3115879001
PBS Bufor	Invitrogen	AM9624
Krowianka Topoizomeraza I	Vivid Technologies		5 pmol/μ l zapas
12-zasadowy zwis samobójczy oligonukleotyd	IDT DNA		5'-AAG GGA CCT GCB< / silny> GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B – Biotyna-dT; 100 pmol/μ l zapasy w ddH2O
Adapter Oligonukleotyd	IDT DNA		5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l zapasy w ddH2O
1 M Tris-HCl, PH 7,4	Lonza	51237
TSA, system fluoresceinowy	PerkinElmer
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Vectashield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Szkiełka			nakrywkowe 22 x 22 mm lub 22 x 40 mm szklane lub plastikowe. Podczas reakcji preferowane są szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego, ponieważ łatwiej je usunąć z sekcji.
Sekcje mózgu szczura Mózg			szczura pobrany 48 godzin po rozrodczości udaru niedokrwiennego, jak opisano w Didenko et al11. 5-6 μ Skrawki o grubości M wycięte z utrwalonych w paraformaldehydzie bloków tkanek zatopionych w parafinie. Używaj naładowanych i wstępnie oczyszczonych szkiełek.
Odwrócony mikroskop	Olympus
Cyfrowa kamera wideo i oprogramowanie	Micromax
Software	Metamorph