Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Podsumowanie

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Streszczenie

Większość białek mitochondrialnych jest zakodowana w jądrze i musi być importowana do organelli. Import może nastąpić, gdy białko jest syntetyzowane w pobliżu mitochondriów. Poparcie dla tej możliwości wynikają z ostatnich badań, w których wykazano, że wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest zlokalizowanych w pobliżu mitochondriów. Wraz z wcześniejszymi dowodami związku rybosomów z błoną zewnętrzną, wyniki te sugerują zlokalizowany proces translacji. Takie zlokalizowane tłumaczenie może poprawić wydajność importu, zapewnić unikalne miejsca regulacji i zminimalizować przypadki ekspresji ektopowej. Do scharakteryzowania czynników i elementów, które pośredniczą w tłumaczeniu zlokalizowanym, zastosowano różne metody. Standardem wśród nich jest frakcjonowanie subkomórkowe przez wirowanie różnicowe. Zaletą tego protokołu jest izolacja mRNA, rybosomów i białek w jednej procedurze. Można je następnie scharakteryzować za pomocą różnych metod molekularnych i biochemicznych. Co więcej, metody transkryptomiczne i proteomiczne mogą być stosowane do uzyskanego materiału, umożliwiając w ten sposób wgląd w cały genom. Wykorzystanie drożdży jako organizmu modelowego do takich badań ma zalety w postaci szybkości, kosztów i prostoty. Co więcej, zaawansowane narzędzia genetyczne i dostępne szczepy deleczujące ułatwiają weryfikację czynników kandydujących.

Wprowadzenie

Komórki eukariotyczne są zorganizowane w odrębne przedziały o określonych funkcjach. Aby spełnić swoją funkcję, każdy przedział zawiera unikalny zestaw białek, które są niezbędne do jego aktywności. Możliwym mechanizmem, za pomocą którego białka te zbliżają się do swojego przedziału, jest miejscowa translacja^1,2. W tym procesie białko jest syntetyzowane w miejscu przeznaczenia przez rybosomy i mRNA, które się tam znajdują. Wśród prawdopodobnych zalet miejscowej translacji jest zwiększona skuteczność celowania w białka, zmniejszone zapotrzebowanie na białka opiekuńcze i umożliwienie mechanizmów regulacji specyficznych dla miejsca. Ponadto zlokalizowane mRNA i rybosomy mogą być odizolowanym rezerwuarem maszynerii translacyjnej w przypadku stresu komórkowego, gdy ogólna translacja jest zahamowana.

Mitochondria stały się w ostatnich latach centralnym modelem do badania miejscowej translacji. Większość białek mitochondriów jest kodowana w jądrze, translowana w cytozolu i importowana do organelli. Różne dowody wskazują, że wiele z tych białek jest wytwarzanych w procesie lokalnej translacji. Początkowo badania mikroskopii elektronowej i frakcjonowania biochemicznego wykryły rybosomy związane z mitochondriami^3-5. Badania te zostały następnie potwierdzone in vivo przez prace nad specyficznymi mRNA, które okazały się importowane tylko w sposób kotranslacyjny^6,7. Badania całego genomu dotyczące związku mRNA z mitochondriami wykazały, że znaczna część mRNA jest zlokalizowana w pobliżu mitochondriów^8-10. Niektóre z tych mRNA zostały dodatkowo scharakteryzowane metodami fluorescencji in vivo, takimi jak FISH lub mTAG^9,11. Prosta interpretacja tego związku jest taka, że te mRNA służą jako szablony do zlokalizowanej translacji.

Mechanizmy, za pomocą których te mRNA zbliżają się do mitochondriów, są nieznane. Wykazano, że domeny niekodujące (przede wszystkim 3' UTR) są zaangażowane w asocjację mRNA z mitochondriami¹². Domeny te mogą służyć jako miejsce wiązania białek wiążących RNA, które pośredniczą w ich transporcie. Badania na drożdżach wykazały, że członek rodziny białek PUM (Puf3) wspiera asocjację mRNA z mitochondriami^8,13. Prawdopodobną rolą Puf3, która opiera się na funkcjach innych członków rodziny, jest hamowanie translacji, gdy mRNA jest w drodze¹⁴. W ten sposób mRNA mogą być transportowane w stanie nieulegającym translacji przez białka wiążące RNA, które oddziałują z regionami niekodującymi. Alternatywnie, duża część prac sugeruje, że transport zachodzi podczas syntezy białka. W szczególności wykazano, że inhibitory translacji wpływają na asocjację mRNA^8,13. Ponadto wykazano, że translowane cechy, takie jak AUG, sekwencja kierowania mitochondrialnego (MTS) lub regiony ORF, pomagają w lokalizacji^8,11,15. Wykazano również, że białko opiekuńcze z rodziny Hsp70 i receptor białkowy na zewnętrznej błonie mitochondriów wspierają asocjację mRNA, co dodatkowo sugeruje, że cechy kodowanego białka są ważne dla lokalizacji mRNA¹⁶. Jest to zgodne z modelem, w którym białko powstające z rybosomem służy jako element rozpoznający do kierowania kompleksu mRNA-rybosom-białko do mitochondriów¹⁷.

Zlokalizowane translacje w pobliżu mitochondriów badano różnymi metodami, w tym mikroskopią elektronową (w celu wizualizacji rybosomów)³, FISH⁹, zielonym RNA (w celu wykrycia specyficznych mRNA)¹¹ oraz frakcjonowaniem biochemicznym (w celu wykrycia zarówno RNA, jak i rybosomów)^10,18. Podczas gdy pierwsze metody wykrywają lokalizację in vivo i mogą umożliwiać wizualizację dynamiki transportu, druga pozwala na wykrycie wielu różnych mRNA w jednym eksperymencie. Ponadto w przypadku frakcjonowania biochemicznego domeny kodujące lub niekodujące nie muszą być zmieniane, dlatego można ocenić ich specyficzne role. Frakcjonowanie biochemiczne jest z powodzeniem stosowane od wielu lat, do izolacji wielu różnych przedziałów komórkowych. Jego zasady i ograniczenia są dobrze znane i można łatwo modyfikować istniejące protokoły do różnych celów. Niezbędne oprzyrządowanie jest standardem w wielu laboratoriach, dlatego jest to zwykle metoda pierwszego wyboru do badania lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Opisujemy protokół, który został zoptymalizowany pod kątem izolacji mRNA, podczas gdy rybosomy są związane z mitochondriami. Protokół ten jest zatem optymalny do badania czynników zaangażowanych w zlokalizowaną translację w pobliżu mitochondriów.

Protokół

1. Oczyszczanie mitochondriów

Zważ granulkę komórek. Około 0,6 g uzyskuje się ze 100 ml komórek.

1. Hodować 100-150 ml komórek drożdży do OD₆₀₀ = 1-1,5 w temperaturze 30 °C na niefermentującym pożywce wzrostowej, takiej jak pożywka wzrostowa na bazie galaktozy, w celu wzbogacenia mitochondriów.
2. Odwirować komórki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
3. Umyj osad podwójnie destylowaną wodą i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant.
4. Zawiesić osad w 1 ml buforu DTT na 0,5 g komórek. Ważne jest, aby potraktować komórki środkiem redukującym w celu zerwania wiązań dwusiarczkowych w ścianie komórkowej, poprawiając w ten sposób hydrolizę.
5. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 30 °C, delikatnie wstrząsając. W międzyczasie zważ 6 mg zymoliazy na 1 g komórek i zawieś ją w buforze Zymolyase Buffer.
6. Odwirować komórki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad w 1 ml buforu zymoliazy na 0,15 g komórek. Nie wirować.
8. Zmierzyć OD₆₀₀ z 10 μl podwielokrotności komórek w 990 μl wody.
9. Dodaj Zymoliazę (krok 1.5) do komórek, aby hydrolizować polimery glukozy w wiązaniach β-1,3-glukanu i wytworzyć sferoplasty. Na tym etapie sferoplasty powinny być przechowywane w roztworze izotonicznym, aby uniknąć lizy.
10. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C (dla optymalnej aktywności zymolyazy), delikatnie wstrząsając. Aby zweryfikować hydrolizę ściany komórkowej i wytwarzanie sferoplastów, należy zmieszać 10 μl komórek z 990 μl wody. Oczekuje się, że sferoplasty ulegną lizie z powodu różnicy osmotycznej, a OD₆₀₀ powinien być co najmniej 10-krotnie mniejszy niż wartość określona w kroku 1.9. Jeśli nie, kontynuuj inkubację z zymoliazą przez kolejne 15 minut.
11. Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant, ponieważ osad może być niestabilny.
12. Przemyć sferoplasty buforem zymoliazy i wyrzucić supernatant.
13. Zawiesić sferoplasty za pomocą 100 ml pożywki Recovery. Przenieść sferoplasty do kolby Erlenmeyera i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Ten etap odzyskiwania jest konieczny, ponieważ podczas leczenia zymoliazą translacja zostaje zatrzymana, a lokalizacja mRNA zostaje zakłócona (Figura 1B).
14. Dodać 0,1 mg/ml CHX i przenieść sferoplasty do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodatek CHX jest ważny dla zamrożenia asocjacji rybosomów z mRNA. W ten sposób utrzymywana jest zależna od rybosomów asocjacja mRNA z mitochondriami.
15. Odwirować sferoplasty o stężeniu 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
16. Umyć dwukrotnie zimnym buforem mannitolowym.
17. Zawiesić sferoplasty za pomocą 4 ml zimnego buforu mannitolowego i przenieść je do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml wyposażonego w ściśle przylegający tłuczek. Delikatnie rozbij sferoplasty za pomocą 15 pociągnięć i przenieś lizat do probówki o pojemności 13 ml.
18. Odwirować lizat przy stężeniu 1 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i nieuszkodzonych komórek.
19. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Odłożyć 1 ml (25%) próbki jako próbkę niefrakcjonowaną ("próbka całkowita"). Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4X LSB do analizy western blot. Wytrącić RNA z reszty próbki "całkowitej" (patrz Protokół 3, Wytrącanie RNA).
20. Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia mitochondriów.
21. Przenieść supernatant (~3 ml) do nowej probówki i trzymać go na lodzie. To jest frakcja "cytozolowa". Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4x LSB do analizy western blot. Wytrącić RNA z reszty próbki "cytozolowej" (patrz Protokół 3, Wytrącanie RNA).
22. Przemyć osad 3 ml buforu mannitolowego i ponownie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
23. Zawiesić osad za pomocą 3 ml buforu mannitolowego. Ta próbka zawiera mitochondria i jest określana jako frakcja "mitochondriów". Przenieść 50 ml tej próbki do nowej probówki i dodać 15 ml 4x LSB do analizy western blot.

2. Ekstrakcja RNA

1. Do każdej próbki dodać jedną objętość 8 M chlorowodorku guanidyny i dwie objętości 100% etanolu. Wirować i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.
2. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Bądź ostrożny, ponieważ pellet może być niestabilny.
3. Przemyć granulat 70% EtOH.
4. Zawiesić osad w 400 ml wody wolnej od RNaz i przenieść próbkę do nowej probówki Eppendorfa.
5. Ponownie wytrącić RNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 i dwie objętości 100% EtOH. Wirować i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.
6. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 70% EtOH.
7. Wysuszyć granulki na powietrzu i ponownie zawiesić wodą wolną od RNaz. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki mogą być używane do analizy północnej¹⁹ lub analizy mikromacierzy¹⁸ (patrz Protokół 3).

3. Przygotowanie RNA do analizy mikromacierzy

1. Ponownie zawiesić mRNA z kroku 2.2 za pomocą 650 ml wody wolnej od RNaz.
2. Aby usunąć wszelkie pozostałości DNA lub białka, dodaj równą objętość (650 ml) kwaśnego fenolu:chloroformu (5:1, pH 4,7) i energicznie wiruj. Wirować z maksymalną prędkością przez 2 min.
3. Przenieść 500 ml górnej fazy (fazy wodnej) do nowej probówki. Unikaj przyjmowania interfazy, ponieważ zawiera ona DNA. Należy również uważać na przyjmowanie fenolu, który może hamować reakcję odwrotnej transkrypcji.
4. Próbka RNA zawiera znaczną ilość heparyny, która jest silnym inhibitorem odwrotnej transkryptazy. W związku z tym w przypadku znakowania RT-PCR lub mikromacierzy należy go usunąć. Usunąć heparynę przez wytrącanie LiCl: dodać LiCl do końcowego stężenia 2 M i inkubować próbki przez noc w temperaturze -20 °C.
5. Rozmrażać próbki w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Ostrożnie wyrzuć sklarowany osad i umyj osad 80% etanolem. Ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 3.5.
7. Wyrzucić supernatant, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić osad w 150 ml wody wolnej od RNaz.
8. Aby usunąć resztki LiCl, należy ponownie wytrącić 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,3 i 3 objętościach 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny.
9. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Dokładnie umyć przezroczyste osady 80% etanolem i wysuszyć na powietrzu.
10. Zawiesić osad w 25 ml wody wolnej od RNaz i utrzymywać próbki w temperaturze -80 °C.
11. Postępuj zgodnie z krokami znakowania i hybrydyzacji RNA opisanymi w^18,20.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia oddzielenie frakcji zawierającej mitochondria od składników cytozolu. Najlepszym sposobem sprawdzenia skuteczności tej procedury jest przeprowadzenie analizy northern oraz analizy western (Rycina 1) próbek z poszczególnych etapów izolacji. Na podstawie tych analiz wyznacza się trzy parametry jakości izolacji. Po pierwsze, sprawdza się, czy RNA lub białka w próbkach są nienaruszone – będą one widoczne jako wyraźne prążki w analizach. Procesy degradacji spowodują pojawienie się...

Dyskusja

Postęp technologiczny w obrazowaniu zaowocował narzędziami o wysokiej rozdzielczości do badania lokalizacji mRNA. Dziś można zmierzyć ruch nawet pojedynczej cząsteczki mRNA w skali czasowej^{ms 23-26}. Jednak tradycyjne podejścia biochemiczne, takie jak to opisane powyżej, są również pouczające i w niektórych przypadkach są preferowane. Izolacja biochemiczna umożliwia oczyszczanie dużego repertuaru mRNA i białek, a zatem jest preferowana w badaniach całego genomu. W pojedynczej izolacji można uzyskać wystarczając...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakt drożdżowy
Galaktoza			Nie autoklawuj
pożywki			galaktozy Do wzbogacania mitochondriów należy użyć dowolnego niefermentującego źródła węgla, takiego jak pożywka wzrostowa na bazie galaktozy sterylizowana 1% ekstrakt drożdżowy, 2% baktopepton, 2% galaktoza
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 mM Tris-HCl, pH 7,6
Ditiothreitol (DTT)
10 mM Bufor			0,1 M TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Odświeżaj za każdym razem
1,2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0,2 μ
filtr Bufor			1,2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Przefiltruj ten bufor (0.2 μ m) i przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości
Zymoliaza 20T			20 000 U/g
Pożywka			regeneracyjna Pożywka wzrostowa na bazie galaktozy uzupełniona 1 M Sorbitol
0,1 mg/ml Cykloheksymid (CHX)
0,6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0,5 mg/ml Heparyna
1 mM Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)
Bufor			0,6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH 7,6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Dodaj na świeżo: 0,5 mg/ml heparyny, 0,1 mg/ml CHX i 1 mM (PMSF). Przefiltruj ten bufor i użyj go lodowato
zimny 8 M Guanidynium-HCl
100% i 70% Etanol (EtOH)
3 M Octan sodu, pH 5,2
10 M LiCl roztwór
250 mM Tris HCl pH 6,8
SDS
Glicerol
β-Merkaptoetanol
Bromofenol niebieski
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% β-merkaptoetanol i 0,02% błękit bromofenolowy
Homogenizator Dounce o pojemności 15 ml wyposażony w ściśle przylegający tłuczek