Artykuł metodologiczny

Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6

84.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51275

⸱

15 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF), Münster, 3Institute of Physiology – Neuropathophysiology, University of Münster

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane to przewlekła neurozapalna choroba demielinizacyjna ośrodkowego układu nerwowego z silnym komponentem neurodegeneracyjnym. Chociaż dokładna etiologia choroby jest jeszcze niejasna, uważa się, że autoreaktywne limfocyty T odgrywają kluczową rolę w jej patofizjologii. Terapia stwardnienia rozsianego jest jak dotąd tylko częściowo skuteczna, a wysiłki badawcze nadal mają na celu poszerzenie naszej wiedzy na temat patofizjologii choroby i opracowanie nowych strategii leczenia. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najczęstszym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego, posiadającym wiele cech klinicznych i patofizjologicznych. Istnieje duża różnorodność modeli EAE, które odzwierciedlają różne kliniczne, immunologiczne i histologiczne aspekty stwardnienia rozsianego u ludzi. Aktywnie indukowany EAE u myszy jest najłatwiejszym do wywołania modelem z solidnymi i powtarzalnymi wynikami. Jest szczególnie przydatny do badania działania leków lub określonych genów przy użyciu myszy transgenicznych z autoimmunologicznym zapaleniem nerwów. Dlatego myszy są immunizowane homogenatami OUN lub peptydami białek mielinowych. Ze względu na niski potencjał immunogenny tych peptydów stosuje się silne adiuwanty. Wrażliwość i fenotyp EAE zależy od wybranego antygenu i szczepu gryzonia. Myszy C57BL/6 są powszechnie stosowanym szczepem do budowy myszy transgenicznych i reagują m.in. na glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG). Immunogenny epitop MOG35-55 zawiesza się w pełnym adiuwancie Freunda (CFA) przed szczepieniem, a toksynę krztuścową aplikuje się w dniu immunizacji i dwa dni później. Myszy rozwijają "klasyczne", samoograniczające się, jednofazowe EAE z rosnącym wiotkim paraliżem w ciągu 9-14 dni po szczepieniu. Myszy są oceniane codziennie przy użyciu systemu punktacji klinicznej przez 25-50 dni. Omówiono specjalne uwagi dotyczące opieki nad zwierzętami z EAE, a także potencjalne zastosowania i ograniczenia tego modelu.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą demielinizacyjną chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego, w której zniszczenie oligodendrocytów i neuronów powoduje heterogenne i kumulujące się objawy kliniczne. Stwardnienie rozsiane jest uważane za prototypowe zaburzenie autoimmunologiczne ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a modele zwierzęce zostały opracowane, aby rzucić światło na jego złożoną patogenezę. Co więcej, obecne terapie są tylko częściowo skuteczne i są ukierunkowane głównie na fazę zapalną choroby, podczas gdy komponent neurodegeneracyjny jest prawdopodobnie głównym wyzwaniem dla przyszłych podejść terapeutycznych1,2.

Chociaż dokładna etiologia choroby jest jeszcze niejasna, zakłada się, że reakcja autoimmunologiczna przeciwko epitopom na osłonce mielinowej aksonów w OUN wywołuje początek choroby. Uważa się, że rozregulowanie układu odpornościowego, podatność genetyczna i czynniki środowiskowe (np. infekcje, witamina D) wpływają na centralne aspekty mechanizmów patofizjologicznych SM.

Obecnie tworzone są trzy różne typy modeli zwierzęcych do badania patologicznych wzorców SM: modele wirusowe, takie jak wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV), modele indukowane przez czynniki toksyczne, takie jak kupryzon, i wreszcie różne warianty eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE)3,4. Chociaż wszystkie naśladują cechy stwardnienia rozsianego, różnią się ogromnie podstawowymi cechami patologicznymi, takimi jak udział adaptacyjnego układu odpornościowego. EAE jest najpowszechniejszym modelem zwierzęcym, ponieważ jest szczególnie przydatny do badania szlaków neurozapalnych i często służy jako model "dowodu zasady" skuteczności nowych strategii leczenia5,6. EAE może być indukowane u wielu odmiennych zwierząt (np. myszy, szczurów, świń miniaturowych, świnek morskich, kurczaków, czy naczelnych). Jednak myszy stały się najczęściej używanym gatunkiem, co przynajmniej częściowo wynika z rozszerzającego się repertuaru wyrafinowanych myszy transgenicznych lub nokautujących7.

Patofizjologia EAE opiera się na reakcji układu odpornościowego na specyficzne dla mózgu antygeny. Reakcja ta indukuje stan zapalny i niszczenie struktur przenoszących antygen, w wyniku czego powstają cechy neurologiczne i patologiczne porównywalne z obserwowanymi u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Można wyróżnić trzy różne podejścia: aktywnie indukowane EAE (aEAE; aktywna immunizacja), pasywnie przenoszone EAE (pEAE; transfer komórek encefalitogennych od uodpornionego zwierzęcia), a ostatnio spontaniczne modele myszy EAE (sEAE), które pozwalają na badanie mechanizmów autoimmunologicznych bez manipulacji egzogennej. Najłatwiejszym do indukowania modelem jest aEAE u myszy, który daje szybkie i solidne wyniki. Model ten jest uważany za "złoty standard" neuroimmunologicznych modeli zwierzęcych przez wielu badaczy w tej dziedzinie8.

Dla indukcji aEAE, zwierzę jest immunizowane podskórnym wstrzyknięciem emulsji składającej się z wybranego antygenu i kompletnych adiuwantów Freunda (CFA), którym towarzyszy dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej w dniu szczepienia i dwa dni później. W związku z tym limfocyty T specyficzne dla mieliny są aktywowane na obrzeżach i migrują do OUN przez barierę krew-mózg. Po wejściu do OUN limfocyty T są reaktywowane przez miejscowe i naciekające komórki prezentujące antygen, co prowadzi do kolejnych kaskad zapalnych, zajęcia innych komórek, takich jak monocyty lub makrofagi, a ostatecznie do demielinizacji i śmierci komórek aksonalnych9. W zależności od protokołu szczepienia i kombinacji szczepu myszy (np. C57BL/6, SJL/J, Biozzi) i antygenu (np. glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG), zasadowego białka mielinowego (MBP), białka proteolipidowego mieliny (PLP)), przebieg choroby może mieć ostry, przewlekły przebieg postępujący lub nawracający przebieg remisyjny.

C57BL/6 myszy stały się najczęściej używanym szczepem do budowy myszy transgenicznych i dostępna jest coraz większa liczba myszy nokautujących lub transgenicznych. Opisujemy tutaj protokół immunizacji myszy C57BL / 6 peptydem MOG35-55 10, który skutkuje jednofazowym EAE z pierwszymi objawami po 9-14 dniach, maksimum choroby około 3-5 dni po wystąpieniu choroby oraz powolnym i częściowym powrotem objawów w ciągu następnych 10-20 dni. Ponieważ potencjał immunogenny samego peptydu MOG35-55 nie jest wystarczający do wywołania choroby, konieczne są adiuwanty, takie jak CFA. Przypuszcza się, że składniki CFA aktywują fagocyty jednojądrzaste, indukując fagocytozę tych cząsteczek i wydzielanie cytokin. Skutkuje to wydłużeniem obecności antygenów i sprawniejszym transportem ich do układu limfatycznego. Indukcja EAE jest ułatwiona przez zastosowanie toksyny krztuścowej (PT), która, między innymi, sugeruje modulowanie bariery krew-mózg i samej odpowiedzi immunologicznej11. Po indukcji choroby należy zwrócić szczególną uwagę na codzienną ocenę myszy pod kątem objawów choroby.

Protokół

1. Ogólne uwagi do eksperymentów na myszach

  1. Wszystkie doświadczenia na myszach powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi odpowiedniego instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania.
  2. Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów i zapewnij im dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Uwaga: Ważne jest, aby używać myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w grupach eksperymentalnych, ponieważ podatność na choroby może się różnić w zależności od wieku i płci.
  3. W zależności od wybranych warunków eksperymentalnych można rozważyć grupę kontrolną immunizowaną pozorowano, w której peptyd MOG35-55 jest zastępowany przez PBS bez antygenu lub peptyd nieencefalitogenny.
  4. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy wziąć pod uwagę aspekty metodologiczne (patrz również poniżej). Zalecamy zaangażowanie jednego lub dwóch zaślepionych obserwatorów do oceny punktowej EAE.

2. Przygotowanie emulsji MOG35-55

  1. Każdej myszy należy wstrzyknąć 200 μl roztworu peptydowego MOG35-55 i CFA w stosunku 1:1. Podczas przygotowywania i wstrzykiwania dochodzi do pewnej utraty lepkiej emulsji. Dlatego przygotuj 1,5-2x potrzebnej ilości. Obliczyć całkowitą objętość emulsji i podzielić przez 2 dla potrzebnych ilości zarówno roztworu peptydu MOG35-55, jak i CFA.
  2. Rozcieńczyć liofilizowany MOG35-55 w ddH2O do końcowego stężenia 2 mg/ml. Zwykle używamy 200 μg peptydu MOG35-55 na mysz. Ilość ta zawarta jest w 100 μl roztworu podstawowego. Roztwór peptydu należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Umieścić zawartość 1 fiolki z wysuszonymi prątkami prątków gruźlicy H37RA (100 mg) w moździerzu.
    1. Zmielone moździerzem i tłuczkiem do uzyskania rzadkiego proszku.
    2. Dodać 10 ml niekompletnych adiuwantów Freunda w celu otrzymania roztworu podstawowego CFA o stężeniu 10 mg/ml, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C.
    3. Przed immunizacją rozcieńczyć roztwór podstawowy CFA IFA do końcowego stężenia 2 mg/ml. Przed każdym użyciem dokładnie wymieszać w celu ponownego zawieszenia materiału w postaci cząstek stałych i rozważyć pewną utratę objętości lepkiego roztworu podczas przygotowywania doświadczeń.
    4. Mieszać w stosunku 1:1 z roztworem peptydu MOG35-55 aż do osiągnięcia końcowego stężenia 1 mg/ml.
      UWAGA: Zabite termicznie Mycobacterium tuberculosis stymuluje wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Unikać wdychania, spożycia i kontaktu ze skórą i oczami.
  4. Roztwory do wstępnego schładzania na lodzie.
    1. Pobrać 1 ml roztworu 2 mg/ml CFA i 1 ml roztworu 2 mg/ml MOG35-55 do dwóch strzykawek o pojemności 2 ml. Oblicz liczbę potrzebnych strzykawek w zależności od liczby zaszczepionych zwierząt.
      UWAGA: Bezwzględnie unikaj zszywania podczas przygotowywania adiuwantu, ponieważ może to spowodować ziarniniaki lub wywołać reakcje autoimmunologiczne.
    2. Użyj kaniuli 27 G do roztworu MOG35-55 i kaniuli 20 G do CFA. Należy unikać pęcherzyków powietrza i połączyć obie strzykawki z zaworem trójdrogowym.
    3. Wyślij emulsję z jednej strzykawki do drugiej i dokładnie mieszaj przez co najmniej 10 minut, ponieważ dobra emulgacja jest kluczowym krokiem. Prawie zamknij zawór trójdrogowy, aby wspomóc emulgację. Roztwór powinien być biały, sztywny i lepki, bez separacji faz.
    4. Emulsja może być przechowywana przez kilka dni przed szczepieniem. Po przygotowaniu emulsji należy odczekać co najmniej 30 minut, aby sprawdzić, czy są stabilne. Przed szczepieniem należy pobrać roztwór do jednej z dwóch strzykawek i podłączyć kaniulę 27 G.

3. Przygotowanie toksyny krztuścowej

  1. W literaturze można znaleźć różne ilości toksyny krztuścowej, które również zależą od drogi podania (np. dożylnie lub dootrzewnowo). Nasze laboratorium stosuje 400 ng toksyny krztuścowej w 200 μl PBS dootrzewnowo w dniu szczepienia i dwa dni później. UWAGA: Toksyna krztuśca ma wiele skutków biologicznych. Unikać wdychania, spożywania i kontaktu ze skórą i oczami.
  2. Rozpuścić 50 μg toksyny krztuścowej w 500 μl ddH2O w 100 μg/ml roztworu podstawowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Rozcieńczyć w stosunku 1:50 PBS. 200 μl zawiera teraz 400 ng PBS. Przygotować niezbędną ilość strzykawek i rozważyć dodatkowy nadmiar objętości ~100 μl na każdą piastę igły.

4. Szczepienia zwierząt

  1. Prosimy o skontaktowanie się z instytucjonalnym komitetem ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w celu uzyskania szczegółowych kryteriów wymaganej krótkoterminowej eutanazji. Nasze laboratorium stosuje krótką narkotyzację izofluranem, podczas gdy inne protokoły, takie jak wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny lub halotan, mogą być również możliwe. Poczekaj na znieczulenie i użyj szczypania przedniego palca stopy, aby ocenić poziom znieczulenia.
  2. Upewnij się, że szczepienie jest wykonywane przez doświadczoną osobę, aby zminimalizować stres u zwierząt i zapewnić optymalną immunizację.
  3. Wstrzyknąć podskórnie 100 μl emulsji antygenowej/CFA w dwa różne miejsca na każdym tylnym boku. Upewnij się, że pod skórą utworzy się bulwiasta masa, która powinna utrzymywać się przez cały czas trwania eksperymentu.
  4. Wstrzyknąć 200 μl toksyny krztuścowej dootrzewnowo.
  5. Upewnij się, że poszczególne myszy można łatwo zidentyfikować do codziennej oceny, np. za pomocą kolorowych oznaczeń na podstawie ogona.
  6. Drugą dawkę toksyny krztuścowej należy podać w drugim dniu po szczepieniu.

5. Monitorowanie EAE

  1. Masa ciała i wynik kliniczny powinny być oceniane codziennie. Początek EAE zazwyczaj koreluje z utratą masy ciała, która może być wykorzystana jako wskaźnik aktywności choroby. Prosimy o skontaktowanie się z instytucjonalnym komitetem ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w celu wstępnego określenia kryteriów, kiedy poszczególne myszy muszą zostać wyłączone z eksperymentów. Należy to rozważyć, gdy utrata masy ciała przekracza 20% początkowej masy ciała lub gdy wystąpią ciężkie objawy kliniczne (wynik EAE 7 lub gorszy). Prosimy o zapoznanie się z odpowiednimi wytycznymi odpowiedniego instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, aby uzyskać dozwolone maksymalne wyniki.
  2. Kiedy myszy mają kliniczne objawy EAE, ważne jest, aby upewnić się, że butelka z wodą jest nadal dostępna, a jedzenie jest umieszczone na podłodze klatki.
  3. Można stosować różne objawy punktacji. W naszym laboratorium ustalana jest skala 0-10.
ocena Objaw kliniczny komentarz 0 Brak objawów klinicznych Normalny chód, ogon porusza się i może być podniesiony, ogon owija się wokół okrągłego przedmiotu, jeśli mysz jest trzymana u podstawy ogona 1 Częściowo wiotki ogon Chód normalny, czubek ogona opada cyfra arabska Sparaliżowany ogon Normalny chód, opadający ogon 3 Niedowład kończyn tylnych, nieskoordynowany ruch Nieskoordynowany chód, utykanie na ogon, tylne kończyny reagują na szczypanie 4 Jedna tylna kończyna sparaliżowana Nieskoordynowany chód z ciągnięciem jedną tylną kończyną, ogon utyka, jedna tylna kończyna nie reaguje na szczypanie 5 Obie tylne kończyny sparaliżowane Nieskoordynowany chód z ciągnięciem obu tylnych kończyn, utykanie ogona, obie tylne kończyny nie reagują na szczypanie 6 Kończyny tylne sparaliżowane, osłabienie kończyn przednich Nieskoordynowany chód z przednimi kończynami ma trudności z ciągnięciem ciała, kończyny przednie odruchują po uszczypnięciu, ogon utyka 7 Kończyny tylne sparaliżowane, jedna kończyna przednia sparaliżowana Mysz nie może się poruszać, jedna przednia kończyna reaguje na szczypanie palca, ogon utyka 8 Kończyny tylne sparaliżowane, obie kończyny przednie sparaliżowane Mysz nie może się poruszać, obie kończyny przednie nie reagują na szczypanie palców, ogon utyka 9 Konające Brak ruchu, zaburzenia oddychania 10 śmierć

Tabela 1. System punktacji klinicznej.

Wyniki

Po immunizacji myszy muszą być codziennie oceniane pod kątem zmian masy ciała i objawów klinicznych. Początek choroby jest zazwyczaj skorelowany ze spadkiem masy ciała, który może wystąpić na 1-2 dni przed pojawieniem się widocznych objawów EAE. Objawy kliniczne EAE pojawiają się zazwyczaj między 9. a 14. dniem po immunizacji. Ponieważ zmiany w modelu MOG-EAE u myszy C57BL/6 lokalizują się głównie w rdzeniu kręgowym, u zwierząt rozwijają się zazwyczaj przede wszystkim objawy motoryczne w kierunku od ogona do głowy. Przykładowy obraz immunizowanej myszy z objawami EAE (wynik 6) przedstawiono na Rysunku 1A. Mogą również wystąpić nietypowe objawy EAE, takie jak toczenie się w sposób osiowo-rotacyjny, zgarbiona postawa lub nadwrażliwość, które nie są uwzględnione w klasycznej skali oceny EAE przedstawionej w Tabeli 1. Ponieważ objawy motoryczne są główną charakterystyką tego modelu, skala ta stanowi dobrą wskazówkę co do ciężkości choroby. W literaturze opublikowano również różne systemy monitorowania (np. skale 0-5 lub 0-6) oraz bardziej złożone oceny kompozytowe badające różne deficyty. Należy pamiętać, że myszy z ciężkimi objawami muszą zostać wycofane z eksperymentu zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Myszy zazwyczaj wykazują częściową poprawę objawów w ciągu kolejnych 10-20 dni. Reprezentatywny przebieg choroby przedstawiono na Rysunku 1B. W trakcie EAE istnieją różne punkty czasowe, które są istotne dla oceny parametrów wyniku. Krótko opisano niektóre typowe analizy, które często są stosowane. W szczycie choroby u myszy można ocenić produkcję cytokin lub proliferację po restymulacji izolowanych komórek odpornościowych peptydem MOG35-55 in vitro (test pamięci immunologicznej MOG). Komórki odpornościowe mogą być również izolowane z mózgu i rdzenia kręgowego myszy z objawami EAE i dalej przetwarzane, np. za pomocą cytometrii przepływowej. W szczycie choroby można przeprowadzić analizę histologiczną przekrojów rdzenia kręgowego w celu oceny stopnia zmian i demielinizacji, natomiast w późniejszych punktach czasowych interesujące mogą być markery neurodegeneracji i śmierci neuronów.

Badanie na modelu mysim; wykres progresji EAE; wpływ immunizacji na myszy; wykres analizy danych badawczych.
Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki EAE. A. Reprezentatywne zdjęcie immunizowanej myszy C57BL/6 z objawami EAE (wynik EAE 6). B. Reprezentatywny przebieg choroby po immunizacji w ciągu 30 dni. Dane przedstawiono jako średnią i błąd standardowy średniej (n = 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano wiele różnych modeli EAE z protokołami aktywnej immunizacji. Podczas gdy modele szczurze były do niedawna szeroko stosowane, myszy są obecnie najpopularniejszym organizmem modelowym w badaniach EAE. Rozwój ten wynika między innymi z szerokiego i stale rosnącego repertuaru dostępnych myszy transgenicznych. Immunizacja myszy C57BL/6 peptydem MOG35-55 jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych modeli EAE i może być uważana za wiarygodny, powtarzalny i dobrze używany model zwierzęcy. W wielu laboratoriach neuroimmunologicznych EAE indukowane przez MOG35-55 jest ustalane jako model z wyboru, podczas gdy inne modele EAE są używane do bardziej szczegółowych pytań eksperymentalnych.

Krytycznym punktem do rozważenia jest zaplanowanie warunków eksperymentalnych w celu zapewnienia, że eksperymenty EAE są przeprowadzane poprawnie metodologicznie. W celu uzyskania trafności wewnętrznej zdecydowanie zaleca się ślepą ocenę objawów choroby. Grupy eksperymentalne powinny być dopasowane pod względem wieku, masy ciała i płci, a myszy powinny być losowo przydzielane do grup leczonych. Doświadczenia powinny być zawsze przeprowadzane zgodnie z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Badania EAE są często niedostatecznie rozwinięte i nie uwzględniają błędów statystycznych typu II. Dlatego przed eksperymentami należy przeprowadzić obliczenia wielkości próby. Niezbędna liczebność grup zależy od oczekiwanej wielkości efektu. Przed rozpoczęciem eksperymentów EAE można rozważyć konsultację z ekspertem w zakresie analizy statystycznej.

Należy pamiętać o pewnych ograniczeniach protokołu. Co najważniejsze, interpretacja danych aEAE jest zagrożona przez sposób immunizacji z użyciem adiuwantu i toksyny krztuścowej, które mają dodatkowy wpływ na reakcję immunologiczną. Należy również wziąć pod uwagę, że model MOG35-55 EAE wykazuje głównie odpowiedź immunologiczną sterowaną limfocytami T CD4+ . Limfocyty T CD8 + i limfocyty B odgrywają mniej znaczącą rolę i należy rozważyć alternatywne protokoły w przypadku tych typów komórek. Przewidywany przebieg choroby jest ostry, jednofazowy i samoograniczający się. Alternatywnie, przebieg choroby rzutowo-remisyjnej można również osiągnąć w alternatywnych modelach EAE. Dodatkowym ważnym ograniczeniem protokołu jest pewne odchylenie w kierunku immunologicznego komponentu patofizjologii SM. W ostatnich latach stało się coraz bardziej jasne, że stwardnienie rozsiane ma silny komponent neurodegeneracyjny. Śmierć oligodendrocytów i neuronów powoduje postępującą akumulację deficytów neurologicznych. Należy wziąć pod uwagę, że model EAE może nie być w pełni przystosowany do odpowiedzi na pytania eksperymentalne dotyczące neurodegeneracyjnych mechanizmów zapalenia autoimmunologicznego. Można rozważyć alternatywne modele zwierzęce z naciskiem na patologię OUN – np. model cuprizone, który upośledza toksyczną demielinizację bez udziału obwodowego układu odpornościowego.

Opisany protokół może być traktowany jako podstawowy neuroimmunologiczny model eksperymentalny i może być modyfikowany do innych zastosowań. Opisana powyżej procedura eksperymentalna może być łatwo zastosowana do innych protokołów EAE poprzez różnicowanie szczepów myszy lub rodzaju i ilości białka (np. należy użyć peptydu PLP139-151 i myszy SJL w przypadku rzutowo-remisyjnego przebiegu choroby EAE, co jest szczególnie przydatne do oceny efektów terapeutycznych w nawrotach). Opisany protokół może być również wykorzystany do eksperymentów adopcyjno-transferowych (passive EAE). W tym modelu myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem MOG35-55 i CFA, jak opisano powyżej. Natomiast toksyna krztuścowa nie jest wymagana. Po 7-15 dniach śledziony lub węzły chłonne są izolowane, a komórki odpornościowe są remumulowane in vitro za pomocą peptydu MOG35-55 i różnych cytokin przed przeniesieniem do nowej grupy myszy C57BL / 6se. U tych myszy biorców rozwija się EAE kilka dni wcześniej niż po klasycznym szczepieniu. Warunki in vitro mogą być zróżnicowane w zależności od określonych kwestii immunologicznych (np. polaryzacja do komórek TH1 lub TH17).

Czasami niska częstość występowania choroby lub słabe objawy mogą być wyzwaniem eksperymentalnym. Oto kilka zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów:

- Nasilenie choroby można zmieniać za pomocą różnych ilości peptydu / myszy.

- Optymalne stężenie CFA może wahać się od 1-5 mg/ml. Rozważ miareczkowanie CFA podczas ustalania eksperymentów. Prosimy o zapoznanie się z odpowiednimi wytycznymi odpowiedniego instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w celu uzyskania informacji o dopuszczalnych stężeniach CFA, ponieważ wiele przepisów zabrania stężeń CFA przekraczających 2 mg/ml.

- Opisano różne metody przygotowania emulsji. Alternatywne metody, takie jak wirowanie przez 1 godzinę lub sonikacja, mogą być brane pod uwagę, jeśli słaba emulgacja jest uważana za możliwe źródło błędów.

- Wiek, płeć, pora roku i warunki środowiskowe w obiekcie dla zwierząt są ważnymi czynnikami wpływającymi na podatność na EAE. Należy zapewnić, aby warunki były porównywalne między niezależnymi doświadczeniami.

Jak opisano powyżej, wspomniany protokół może być wykorzystany jako punkt wyjścia dla eksperymentów adopcyjnych EAE. Model ten jest szczególnie przydatny do oddzielania obwodowych i ośrodkowych układów nerwowych fenotypu genetycznego (np. poprzez przenoszenie encefalitogennych komórek nokautujących do myszy biorców typu dzikiego) oraz do specyficznych pytań immunologicznych, ponieważ fenotyp przenoszonych komórek można dokładnie scharakteryzować. Najnowszym osiągnięciem w badaniach EAE w ostatnich latach są myszy transgeniczne z receptorem limfocytów T. U myszy tych objawy EAE rozwijają się spontanicznie, bez wpływu zewnętrznego, co pozwala obejść problem szczepienia adiuwantowego. Jednak ten model wymaga dużej ilości zwierząt do hodowli, aby zapewnić wystarczającą wielkość grupy. Ocena myszy z nokautem wymaga krzyżowania przed eksperymentami EAE, w przeciwieństwie do aEAE. Ponieważ u każdej myszy objawy choroby rozwijają się w innym dniu, ocena nowych substancji może być dość skomplikowana. W związku z tym wartość klasycznego aEAE dla neuroimmunologii pozostaje niekwestionowana.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Samica myszy C57BL/6, wiek 10-12 tygodni, waga ~20 ge.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVHLYRNGK)e.g. Pepceuticals LtdSklep przy -20 ° C
Niekompletny Freund' s adiuwant (IFA)e.g. Sigma-Aldrich Co.F5506Sklep pod adresem 4 & deg; C
Strzykawki, 1 ml z igłą 26 G 3/8 e.g. Becton Dickinson & Co.
Strzykawki, 2 mlnp. Igły B. Braun7389
, 25 G 5/8 cala i 30 G 1/2 cala <>np. Becton Dickinson & Co.,305122, 305106
Zawór trójdrogowynp. B. Braun16494 C
Toksyna krztuścowa, liofilizowana w buforzeEnzo Life Sciences Inc.BML-G100Przechowywać pod adresem 4 & deg; C
M. tuberculosis H37 RABD Difco 231141Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z
309625

Bibliografia

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kompletny adiuwant Freundatoksyna krztuścainiekcja podskórnainiekcja doszpikowasystem oceny klinicznejprzygotowanie antygenumieszanie emulsji
Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.