Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

19.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51284

⸱

22 maja 2014

 ,  , 
1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, 3Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Streszczenie

Procesy zapalne wynikające z wydzielania cytokin z rodziny interleukiny (IL)-1 przez komórki odpornościowe prowadzą do miejscowego lub ogólnoustrojowego stanu zapalnego, przebudowy i naprawy tkanek oraz kontroli wirusologicznej 1,2 . Interleukina-1β jest niezbędnym elementem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i przyczynia się do eliminacji atakujących patogenów, jednocześnie zapobiegając powstawaniu uporczywych infekcji1-5.

Inflamasomy są kluczową platformą sygnalizacyjną dla aktywacji enzymu konwertującego interleukinę 1 (ICE lub kaspazy-1). Inflamasom NLRP3 wymaga co najmniej dwóch sygnałów w DC, aby spowodować wydzielanie IL-1β6. Ekspresja białka Pro-IL-1β jest ograniczona w komórkach w stanie spoczynku; dlatego do transkrypcji IL-1β i ekspresji białka wymagany jest sygnał primingowy. Drugi sygnał wykrywany przez NLRP3 powoduje powstanie wielobiałkowego inflamasomu NLRP3. Zdolność komórek dendrytycznych do reagowania na sygnały wymagane do wydzielania IL-1β można przetestować przy użyciu syntetycznej puryny R848, która jest wykrywana przez TLR8 w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC) do komórek pierwotnych, a następnie aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą toksyny bakteryjnej i jonoforu potasu, nigerycyny.

Pochodzące z monocytów DC są łatwo wytwarzane w hodowli i dostarczają znacznie więcej komórek niż oczyszczone ludzkie mieloidalne DC. Przedstawiona tutaj metoda różni się od innych testów inflamasomów tym, że wykorzystuje in vitro DCs pochodzące od ludzi, a nie od myszy, co pozwala na badanie inflamasomu w chorobach i infekcjach u ludzi.

Wprowadzenie

Aktywacja wrodzonego układu odpornościowego jest wymagana do kierowania adaptacyjnymi reakcjami immunologicznymi podczas infekcji, choroby i szczepienia7. Komórki dendrytyczne są najsilniejszymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego prezentującymi antygen; są wyspecjalizowane w wychwytywaniu antygenów, migracji do węzłów chłonnych i aktywacji naiwnych limfocytów T CD4 + i cytolitycznych CD8 + 8-10. Aby umożliwić szybkie wykrywanie patogenów, wrodzony układ odpornościowy wykorzystuje liczne receptory rozpoznawania wzorców kodowane przez linię zarodkową (PRR), które rozpoznają konserwatywne motywy pochodzące z patogenów lub pochodzące od gospodarza markery stresu i uszkodzenia komórek. Receptory tollopodobne (TLR) to receptory rozpoznawania wzorców związanych z błoną, które rozpoznają pewne zewnątrzkomórkowe wzorce molekularne związane z fagocytowanymi patogenami (PAMP) i wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP). Z kolei receptory podobne do nod (NLR) są cytozolowe i reagują na różnorodny zakres PAMP i DAMP. Receptory przypominające Nod stanowią drugą linię obrony przed patogenami, które unikają powierzchni komórki i endocytarnych PRR. Interakcja czynników pochodzących od patogenu lub "niebezpieczeństwo" związane z ligandami TLR i NLR prowadzi do stanu dojrzewania DC, co skutkuje zwiększoną interakcją DC z innymi komórkami odpornościowymi i promowaniem aktywacji limfocytów T i komórek NK11.

Interleukina-1β jest kluczowym elementem obrony gospodarza przed infekcją. Po rozpoznaniu mikroorganizmu wydzielana jest wysoce prozapalna cytokina IL-1β, która działa jako atraktant chemioterapii i aktywator wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych. In vivo (in vivo) IL-1β jest w dużej mierze odpowiedzialna za odpowiedź ostrej fazy, w tym gorączkę i syntezę cytokin zapalnych12.

Większość NLR-ów zawiera C-końcową domenę powtórzeniową bogatą w leucynę, która jest uważana za funkcjonalną w wykrywaniu ligandów, centralną domenę wiążącą nukleotydy (NACHT), która jest ważna dla oligomeryzacji NLRP3, oraz końcową domenę efektorową N (PYD w NLRP3), która pośredniczy w transdukcji sygnału do dalszych celów poprzez interakcje białek. Białko NLRP3 definiuje najintensywniej badany kompleks inflamasomowy. Białko to należy do rodziny NLR i ma zdolność tworzenia wielocząsteczkowego kompleksu białkowego składającego się z NLRP3, białka adaptorowego PYCARD (znanego również jako ASC) i ICE. Po aktywacji inflamasomu PYCARD wiąże się z domenami końcowymi NLRP3 N i rekrutuje ICE poprzez domeny aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD). Enzym konwertujący interleukinę-1 jest początkowo generowany jako zymogen zawierający motyw CARD na swoim N-końcu. Tworzenie inflamasomu powoduje zbliżenie dwóch cząsteczek ICE do siebie na tyle, aby wywołać ich autokatalityczną aktywację. Kompleks inflamasomów jest niezbędny do aktywacji ICE, umożliwiając mu w ten sposób przekształcenie cytoplazmatycznego pro-IL-1β w dojrzałą cytokinę.

Pomyślne wydzielanie IL-1β w DCs wymaga wykrycia dwóch różnych i niezależnych sygnałów niebezpieczeństwa. Po pierwsze, wykrywanie TLR PAMP, DAMP lub sygnalizacji cytokin (TNFα lub IL-1β) powoduje regulację w górę cytoplazmatycznego białka pro-IL-1β. Drugi, często inny, sygnał jest wymagany do tworzenia kompleksu inflamasomu przed dojrzewaniem ICE. Kilka sygnałów stymulujących inflamasomy obejmuje toksyny tworzące pory błony bakteryjnej (takie jak nigerycyna), kryształy zaburzające lizosomalne (takie jak kryształy moczanu sodu, MSU) i zewnątrzkomórkowe ATP. Wcześniejszy mechanizm prowadzący do aktywacji inflamasomu NLRP3 przez te różne aktywatory jest niejasny. Badania nad sygnalizacją przed powstawaniem inflamasomu sugerują, że zdarzenia wewnątrzkomórkowe, takie jak indukcja hipokaliemii lub reaktywne formy tlenu (ROS), pośrednio aktywują inflamasom13-28.

Wśród różnych aktywatorów wirusowych inflamasomu NLRP3 jest grypa, która dostarcza zarówno pierwotnego, jak i wtórnego sygnału wymaganego do wydzielania IL-1β 3,29-33 . Korzystając z mysich modeli nokautu NLRP3, stwierdzono, że wydzielanie IL-1β w DC jest zależne od NLRP332. Ponadto myszy z nokautem NLRP3 przyciągały mniej leukocytów do miejsca infekcji i doświadczały wyższej śmiertelności 2,5. Dwa ostatnie artykuły sugerują mechanizm aktywacji inflamasomu NLRP3 podczas infekcji wirusem grypy; po pierwsze, pobudzanie poprzez rozpoznawanie wirusowego RNA przez TLR7 lub TLR8 (w zależności od ekspresji TLR odpowiadającej komórki) lub poprzez wykrywanie bakterii komensalnych przez inne TLR w celu indukcji cytoplazmatycznej ekspresji pro-IL-1β, a następnie drugi sygnał, aktywacja tworzenia inflamasomu NLRP3 przez białko kanału jonowego wirusa M2 w sieci trans Golgiego33, Lokal mieszkalny 34. W ostatnim etapie wyzwalanie inflamasomu NLRP3 odbywa się poprzez zakłócenie wewnątrzkomórkowego środowiska jonowego prowadzące do produkcji ROS, która jest po prostu wyczuwana przez NLPR3 jako sygnał do utworzenia inflamasomu. Jednak dokładny mechanizm aktywacji inflamasomu przed aktywnością ICE podczas infekcji grypą nadal pozostaje niejasny.

Ta praca opisuje technikę cenną do badania inflamasomu NLRP3 w ludzkich moDCs, która może być wykorzystana jako podstawa do dalszych badań szlaku leżącego u podstaw wydzielania IL-1β na bazie DC w odpowiedzi na ligację TLR8 z R848, po której następuje aktywacja inflamasomu przez dobrze znany aktywator NLRP3, nigerycynę. Odmiany tej metody można stosować z innymi typami komórek, w tym między innymi: monocytami, makrofagami, innymi podzbiorami DC i komórkami nabłonkowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Próbki badawcze są pobierane i przechowywane do badań za zgodą darczyńców. Wszystkie próbki powinny być zakodowane lub zanonimizowane przed użyciem. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi naszej Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.

1. Różnicowanie ludzkich monocytów krwi obwodowej na komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów.

Uwaga: Ludzkie kożuchy służą jako źródło ludzkich komórek krwi obwodowej (PBMC) i zostały pozyskane z New York Blood Center (New York, NY). Krwiodawcami są zdrowi ochotnicy. 5-dniowa procedura rozpoczyna się od posiewu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na kolbach do hodowli tkankowych35,36. Godne uwagi różnice w stosunku do opublikowanych protokołów są następujące:

  1. Użyj 225 cm2 niepirogennych polistyrenowych kolb do hodowli tkankowych z nasadką filtrującą, aby przykleić łącznie 2x108 PBMC na kolbę zamiast 10 cm płytek do hodowli tkankowych z polistyrenu (58 cm2) (krok 1).
  2. Przygotować pożywkę z 5% zbiorczą surowicą ludzką (PHS; 30 ml) w 500 ml RPMI-1640 + L-glutamina, 5 ml 1 M buforu HEPES i 1,4 ml 50 mg/ml gentamycyny (5% pożywki PHS), a następnie przefiltrować przez filtr 20 μM. Dodać łącznie 50 ml pożywki o sprężystości 5% PHS na kolbę do hodowli tkankowych o pojemności 225cm2.
  3. Umyj przylegające komórki trzykrotnie 25 ml świeżego RPMI-1640. Wstrząsaj energicznie przez 5 sekund podczas każdego mycia i odsysaj nieprzylegające komórki (krok 4).
  4. Dodać 190 μl 400 j.m./μl IL-4 i 380 μl 100 j.m./μl GM-CSF na kolbę (etap 3) w dniu 0, 2 i 4. Dzień 0 definiuje się jako dzień, w którym PBMC są początkowo powlekane w kroku 1 (kroku 8).
  5. Zebrać 5 moDC w stężeniu 1x106 komórek/ml (krok 15).
  6. Używaj moDC natychmiast w stanie spoczynku. Kroki 17-22 nigdy nie są wykonywane. Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, próbki należy przetworzyć tak szybko, jak to możliwe po pobraniu.
  7. Podwielokrotne moDC w stężeniu 2x105 komórek/basenik (200 μl/dołek z 1x106 komórek/ml) w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem (western blot, ELISA, FAC) lub na szkiełku komorowym poddanym działaniu poli-L-lizyny (mikroskopia) w celu eksperymentów. Uwaga: Istnieją co najmniej 4 warunki: Całkowicie niestymulowany (kontrola negatywna), tylko zalewanie, tylko aktywacja i torowanie, po którym następuje aktywacja. W razie potrzeby warunki można rozszerzyć o kontrolę rozcieńczalnika dla R848 i nigerycyny. Jeżeli dalszym testem jest ICS, duplikaty są niezbędne do kontroli izotypu.

2. Przygotowanie inflamasomu - Sygnał 1

  1. Rozpuść liofilizowany R848 w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć materiał roboczy w RT za pomocą RPMI-1640.
  2. Dodać R848 o końcowym stężeniu 10 μM do odpowiednich studzienek na 18 godzin. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Aktywacja inflamasomu NLRP3 - Sygnał 2

  1. Rozpuść liofilizowaną nigerycynę w etanolu zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć materiał roboczy w RT za pomocą RPMI-1640 przed dodaniem do odpowiednich warunków.
  2. Dodać nigerycynę w końcowym stężeniu 20 μM i wrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin. Między zalewaniem a aktywacją nie zachodzą żadne etapy mycia. Uwaga: Wydzielanie IL-1β zwiększa obecność jonoforów wapnia, brefeldyny A, monenzyny, dinitrofenolu lub chlorofenylohydrazonucyjanku karbonylu 37,38. Dlatego dodawanie tych inhibitorów wydzielniczych nie jest zalecane podczas analizy pobudzania lub aktywności inflamasomów, ponieważ zmieni to wydzielanie IL-1β.

4. Pobieranie próbek IL-1ß

  1. Odwirować płytkę z komórkami i supernatantami w temperaturze 974 x g przez 3 minuty.
  2. Nie naruszając osadu komórkowego, odessać supernatant i przenieść na oddzielną płytkę z okrągłym dnem w celu zmierzenia wydzielania cytokin z supernatantów. Uwaga: Supernatanty mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  3. Przemyć granulki komórkowe trzykrotnie 200 μl 1x PBS przy 974 x g przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe IL-1β z próbek komórkowych. Uwaga: Podczas mycia osadów komórkowych z płytki 96-dołkowej, należy usunąć płukanie przez szybkie odwrócenie płytki do pojemnika zbiorczego, aby nie naruszyć próbki.

5. Pomiar IL-1ß z próbek komórkowych i supernatantów

  1. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS): Protokół ICS jest opisany poniżej39,40. Uwaga: nie zawieszaj komórek, jeśli dalszym testem jest mikroskopia. Wszystkie płukania i aspiracje powinny być wykonywane bez naruszania warstwy komórkowej/osadu (w zależności od dalszego testu).
    1. Dodaj 100 μl 5% pożywki PHS do odpowiednich studzienek. Dodaj odpowiednią objętość (około 1 μl / 2x105 komórek lub 1 μl / basenik) fluorescencyjnie znakowanych α-CD11c i α-CD14 (markery fenotypu; klon odpowiednio B-ly6 i MφP9) lub kontrolę izotypu do komórek przez 10 minut w RT w ciemności.
    2. Umyć trzy razy 1x PBS przy 974 x g przez 3 min.
    3. Napraw komórki, dodając 100 μl 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    4. Punkt pauzy: Umyć 100 μl 1x PBS przy 974 x g przez 3 minuty i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N w 1x PBS.
    5. Dodać 100 μl buforu permeabilizacji do komórek na 30 min. Uwaga: bufor permeabilizacji składa się z 1x PBS z 0,3% Triton X-100 i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do permeabilizacji. Nie należy przeszkadzać przylegającym komórkom, gdy dalszy test to mikroskopia.
    6. Dodać odpowiednią objętość (około 62 ng przeciwciała/2x105 komórek, około lub 2,5 μl/basenik) α-IL-1β-FITC (klon 8516) lub kontrolę izotypu przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    7. Przemyć komórki trzykrotnie 200 μl buforu permeabilacyjnego o stężeniu 974 x g przez 3 minuty w ciemności.
    8. Opcjonalnie: Zabejcuj za pomocą DAPI, dodaj środek mocujący i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Poczekaj, aż utrwalenie O / N przed wykonaniem obrazów mikroskopowych.
    9. Pozyskaj dane za pomocą FAC lub mikroskopii. Uwaga: Porównaj izotyp dla każdego stanu z odpowiednim barwieniem podczas analizy za pomocą FAC lub mikroskopii.
      1. FAC: Pobieraj jedną próbkę na raz. Ustaw bramkę FSC / SSC na żywych komórkach, a następnie bramkowanie na komórkach CD11c + CD14- przed analizą barwienia populacji moDC pro-IL-1β.
      2. Mikroskopia: Ustaw czas naświetlania, używając próbki do barwienia dodatniego - poddanej działaniu R848. Użyj DAPI+pro-IL-1β+ i DAPI+pro-IL-1β-, aby określić procent ekspresji pro-IL-1β+ moDCs.
  2. SDS-Page: Immunoblotting jest wykonywany w celu wykrycia pro-IL-1β. Uwaga: Opisana poniżej technika łączy standardową technikę immunoblottingu, gradientowy żel poliakrylamidowy 4-20% oraz detekcję fluorescencyjną lub chemiluminescencyjną41,42 .
    1. Lizować komórki bezpośrednio w 10 μl denaturującego buforu do lizy (5 μl β-merkaptoetanolu/950 μl buforu próbki Laemmli, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1 buforem do lizy komórek). Przenieś lizat do 1,5 ml probówek Eppendorfa.
    2. Podgrzewać lizat na suchej płycie przez 10 minut w temperaturze 100 °C.
    3. Wirować lizat przy 20 800 x g na miniwirówce przez 1 minutę, aby zagęścić objętość cieczy. Punkt wstrzymania: próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.
    4. Załaduj całą objętość na żel poliakrylamidowy. Przepuść 140 V przez pudełko z żelem przez około 1 godzinę lub do momentu, gdy przód barwnika będzie spływał od dna żelu.
    5. Przenieść białko z żelu poliakryloamidowego na membranę PVDF Immobilon-FL przez 90 minut przy napięciu 100 V. Zablokować membranę 5% BSA w Tris Buffered Saline/ 0,1% Tween-20 (TBS-T) przez 1 godzinę. Uwaga: PVDF Immobilon-FL Najlepiej nadaje się do stosowania z detekcją fluorescencyjną. Membrana o innym składzie jest zalecana w przypadku innych technik detekcji w celu zwiększenia stosunku sygnału do tła.
    6. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w 10 ml 5% BSA/TBS-T. Przeprowadzić inkubację przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 °C O/N podczas wstrząsania i przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę podczas wstrząsania.
    7. Przemyć błonę 3 razy TBS-T przez 5 minut, wstrząsając między inkubacjami przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz ponownie między inkubacjami wtórnymi a obrazowaniem. Uwaga: Pasma można wykrywać za pomocą detekcji fluorescencyjnej lub chemiluminescencyjnej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykrywania.
  3. ELISA: Próbki, które są zamrażane do przechowywania, muszą zrównoważyć się z RT przed analizą. Odwirować próbki w wirówce, aby skonsolidować kondensację supernatantu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi pomiaru IL-1β. Uwaga: W tym protokole IL-1β jest specjalnie mierzona; jednak jednoczesny pomiar TNFα, IL-6 i cytokiny immunomodulującej IL-10 zapewnia odpowiednie warunki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Techniki te służą do pomiaru aktywacji TLR8 za pomocą R848. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla pro-IL-1β umożliwia odczyty mikroskopowe i FACS z moDC CD14-CD11c+. Obie techniki mogą być kwantyfikowane w stosunku do kontroli komórkowej nieaktywowanej (spoczynkowej) oraz kontroli izotypowej (Rysunki 1 i 2). Procent komórek wybarwionych na pro-IL-1β+ mnoży się przez medianę geometryczną tej populacji, aby uzyskać średnią intensywność fl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cytokiny zapalne są integralną częścią kierowania wrodzoną i adaptacyjną odpowiedzią immunologiczną w celu zwalczania infekcji wirusowej. Wykazano, że wydzielanie IL-1β zwiększa się podczas infekcji grypą 3,43,44 . Dokładne mechanizmy, za pomocą których te cytokiny są przetwarzane w odpowiedzi na rozpoznanie wirusa w ludzkich komórkach dendrytycznych, nie są w pełni poznane. Zestawy do izolacji szpiku DC są drogie i czasochłonne. Zestawy izolacyjne i sortowanie FAC m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Olivierowi Manchesowi, Ph.D., Davorowi Frleta, Ph.D. i Meagan O'Brien, M.D. za ich wsparcie i opinie. Badania te były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych i zakończone finansowaniem z grantów NIH Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individual Predoctoral Fellowships (F31) w celu promowania różnorodności w badaniach związanych ze zdrowiem (AI089030) i RO1 (AI081848).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IŁ-4R& D
ten produkt za pośrednictwem naszej lokalnej apteki na receptę
RPMI 1640 z L-glutaminąCellgro10-040-CV
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowejNew York Blood CenterPBMC zostały wyizolowane z krwi zdrowych dawców
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowychSigma-Aldrich3516
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z okrągłym dnemSigma-Aldrich3799
α-IL-1β-FITCR& DIC201F
Kontrola izotypu FITCMiltenyi Biotec130-092-213
α-&β-TubulinSanta CruzSC-9014
α-IL-1βR& Dmab201
Membrana PVDF Immobilon-FLmiliporowy
4-12% żel polikrylamidowyBio Rad161-1159
Bufor do próbek LaemmliBio Rad161-0737
BSAEquitech Bio Inc30% roztwór sterylny/filtrowany
PFAMikroskopia elektronowa Sciences1571016% rozwiązanie
Zestaw macierzy kulek cytokin zapalnychdla ludzi BD551811
NigericinInvivogentlrl-nig
R8483M Corp.
α-CD14BD340436
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-10ML
TBSMagazyn na miejscu
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Nasadka filtra, objętość robocza 70 ml, 30/CsThermo 159933
20 μ M Sterylne jednorazowe jednostki filtrująceThermo Scientific569-0020
HEPESInvitrogen15630080
Koza & alfa-mysz IRDye 800CWLicor926-32210
Osioł &alfa;-królik IRDye 680RDLicor926-68073
Spectra wielokolorowa drabinka białkowa o szerokim zasięguThermo Scientific26634
Tris Glycine SDS 10xBio Rad1610732
Tris Glycine 10xBio Rad161-0734
Metanol - 4 LFisher ScientificA433P-4
8-komorowe szkło polistyrenowe do hodowli tkanek w naczyniuFalcon354108
Poly-L-LizynaSigmaP4707
GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 Nabywamy Gradient IPFL00010 Naukowy BD

Bibliografia

  1. Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
  2. Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
  3. Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
  4. Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
  5. Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
  6. Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
  7. Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
  8. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
  9. Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
  10. Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
  11. Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
  12. Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
  13. Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
  14. Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
  15. Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
  16. Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
  17. Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
  19. Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  20. Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
  21. Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
  22. Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
  23. Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
  24. Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
  25. Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
  26. Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
  27. Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
  28. Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
  29. Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
  30. Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
  31. Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
  32. Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
  33. Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
  34. Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
  35. O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
  36. Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
  37. Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
  38. Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
  39. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
  40. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
  41. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
  42. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
  43. Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
  44. Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
  45. Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
  46. Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekrecja IL 1 betaprimowanie R848aktywacja nigerycyndetekcja immunofluorescencyjnaanaliza Western Blotcytometria przep ywowapomiar ELISAprotok hodowli kom rkowej
Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.