Artykuł metodologiczny

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

DOI:

10.3791/51319

⸱

7 maja 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji. Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat powierzchnia błony została zidentyfikowana jako nisza zarodkowa o znaczeniu podczas embrionalnej, okołoporodowej i dorosłej neuro- i glejogenezy, w tym po urazie. Jednak metody genetycznego badania tych populacji przodków i śledzenia ich linii były ograniczone ze względu na brak swoistości lub czasochłonną produkcję wirusów. W związku z tym postęp w tym regionie był stosunkowo powolny, z zaledwie kilkoma badaniami w tej lokalizacji. Elektroporacja jest stosowana od ponad dekady do badania właściwości nerwowych komórek macierzystych w zarodku, a ostatnio w mózgu po urodzeniu. W tym miejscu opisujemy skuteczną, szybką i prostą technikę manipulacji genetycznej komórek progenitorowych na powierzchni pialnej w oparciu o dostosowane podejście do elektroporacji. Elektroporacja powierzchniowa Pial pozwala na łatwe znakowanie genetyczne i manipulację tymi komórkami progenitorowymi, co stanowi oszczędność czasu i oszczędność czasu w badaniu tych komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe są obecne w całym OUNssaków 1,2. Ich charakter i właściwości w embrionalnych i dorosłych strefach rozrodczych otaczających komorowe obszary mózgu i rdzenia kręgowego zostały obszernie udokumentowane w ciągu ostatniej dekady1-3. W dużej mierze wynika to z rozwoju coraz bardziej precyzyjnych narzędzi genetycznych, takich jak specyficzna dla układu nerwowego rekombinacja Cre floksowanych alleli lub śledzenie linii retrowirusowej4. Jednak jeden region progenitorowy – strefa progenitorowa na powierzchni pial – dopiero niedawno został opisany w szczegółach5-7 i czeka na kompleksowe badanie.

Powierzchnia mózgu jest zdefiniowana jako interfejs między powierzchnią mózgu a otaczającymi ją oponamimózgowymi 8. Podczas rozwoju neuroepitelialne, a później promieniowe stopy końcowe glejowe przyczepiają się do tej powierzchni9,10. W tym regionie obserwuje się jedne z pierwszych neuronów w ludzkim mózgu i wiele mitoz neuronalnych11. Później, podczas neurogenezy embrionalnej, wiadomo, że interneurony korowe przechodzą przez obszar pialny, oprócz swoich tras migracyjnych w strefie pośredniej i strefie podkomorowej12-14. W tym okresie komórki macierzyste mogą być hodowane z tej strefy i wydaje się, że jest to aktywne miejsce neuro- i glejogenezy5. W dorosłym mózgu doniesiono, że interneurony mogą powstać z komórek progenitorowych na powierzchni mięśnia pierwotnego po prowokacjihipoksyjnej 7. Jednak wkład tego regionu w jego genensis podczas rozwoju embrionalnego i pourodzeniowego pozostał niejasny, częściowo ze względu na trudności w dokładnym zbadaniu tego regionu6. W wzgórku górnym i korze mózgowej interneurony powierzchowne (lub warstwa I w korze mózgowej) mogą modulować wyjście obwodu leżącego poniżej populacji neuronów pobudzających, a tym samym znacząco przyczyniać się do funkcji tych struktur. W szczególności interneurony warstwy 1 są w doskonałej pozycji do regulowania wypalania neuronów w górnych warstwach kory mózgowej, biorąc pod uwagę ich rozległą łączność z powierzchownymi i głębokimi warstwami kolumn korowych15,16. W podobny sposób interneurony poziome otrzymują bodźce pobudzające z włókien korowych i siatkówkowych, wystają na stosunkowo duży obszar i spekuluje się, że pośredniczą w hamowaniu populacji neuronów reagujących na odległe bodźce wzrokowe17,18. Ponadto ich morfologia jest dobrze przystosowana do odgrywania potencjalnej roli w wzorzystej aktywności falowej w rozwijającym się układzie wzrokowym19. Co ciekawe, rozwój i dojrzewanie interneuronów zachodzi w dużym stopniu po urodzeniu. Co więcej, stwierdzono, że ten proces dojrzewania jest regulowany przez aktywność neuronalną i dlatego jest substratem plastyczności rozwojowej z konsekwencjami na całe życie dla funkcji obwodu20,21. Warto zauważyć, że nie opisano żadnych promotorów, które mogłyby specyficznie celować w te komórki transgenicznie. Dzielący się progenitorzy mogą być ukierunkowani za pomocą retrowirusa7, ale produkcja wirusa jest czasochłonna i wymaga umiejętności, aby uzyskać wysokie miana potrzebne do transdukcji komórki.

Elektroporacja doprowadziła do renesansu w badaniach nad rozwojem neurologicznym, ponieważ pozwala na szybkie i skuteczne genetyczne badanie ścieżek sygnałowych w neuronalnych progenitorach 4,22,23. Elektroporacja polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA, a następnie dostarczeniu impulsów elektrycznych na zewnątrz głowy, w celu jednokierunkowego wkierowania DNA do proliferujących komórek progenitorowych otaczających komory 4,22,23. Wydaje się, że elektroporacja wymaga przejścia komórek przez fazę M cyklu komórkowego w celu ekspresji transgenów plazmidowych24. W szczególności stwierdzono, że tylko komórki przechodzące przez fazę M w ciągu 8 godzin od elektroporacji plazmidów będą wyrażać transgeny pomimo ich skutecznego dostarczania do wszystkich komórek w promieniu ~160 μm od ściany komory24. Spekuluje się, że wynika to z potrzeby rozpadu otoczki jądrowej w celu umożliwienia dostępu jądrowego plazmidów episomalnych, ponieważ substancje chemiczne powodujące przenikanie jądrowe mogą indukować ekspresję plazmidów w komórkach postmitotycznych25. Elektroporacja, pierwotnie stosowana w zarodku22, została przystosowana do użytku w mózgu po urodzeniu znacznie później26,27. Ostatnio dostosowaliśmy elektroporację do stosowania w manipulacji genetycznej komórek progenitorowych powierzchni pialnej6. Co więcej, stosując to podejście, wykazaliśmy, że najwyraźniej istnieją dwie odrębne linie przodków w tym regionie - międzyneuronalna i astrocytowa6. Protokół ten szczegółowo opisuje prosty, szybki i potężny sposób celowania w te komórki w celu zbadania mechanizmów regulujących rozwój tych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura jest zgodna z wymaganiami IACUC Cedars-Sinai. Badacze powinni upewnić się, że IACUC przestrzega przepisów instytucjonalnych przed podjęciem dalszych działań. Wszystkie narzędzia i odczynniki należy wysterylizować przed użyciem.

1. Przygotowanie narzędzi, roztworów i mieszaniny DNA

  1. Włóż 100-milimetrowe rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego polerowanego ogniowo do ściągacza do mikropipet. Ustaw ogrzewanie tak, aby umożliwić standardowe pociągnięcie z obciążeniem w celu uformowania końcówki pipety o średnicy około 17,5 mm. Odetnij końcówki ostrymi nożyczkami chirurgicznymi w odległości około 8-9 mm od początku końcówki, aby utworzyć otwór o średnicy około 100 μm.
  2. Przygotuj 1% w/v szybko zielony roztwór, mieszając przefiltrowaną wodę wolną od nukleaz (przy użyciu filtra strzykawkowego 20 μm) z suchym, szybko zielonym roztworem.
  3. Wyizolować oczyszczony plazmidowy DNA wolny od endotoksyn, który jest wysoce skoncentrowany (tj. > 3 μg/μl), rozcieńczony w buforze Tris-EDTA (TE). Dodaj żądane ilości plazmidu do mieszaniny rozcieńczonej w buforze TE i dodaj stosunek 1:10 1% szybkiego zielonego roztworu (co daje końcowe stężenie 0,1% w/v fast green). Użyj końcowego stężenia plazmidu 0,5-2,0 μg/μl w celu uzyskania silnej ekspresji transgenów.

2. Znieczulenie zwierząt, ładowanie pipet i wstrzykiwanie plazmidu na powierzchnię Pial

  1. Wywołaj znieczulenie hipotermią u myszy 1-2 dni po urodzeniu, umieszczając je na szalce Petriego, którą umieszcza się na lodzie na 5-8 minut (czas zależy od wieku/wagi szczeniąt). Gdy hipotermia zostanie potwierdzona przez brak ruchu spowodowany szczypaniem palców u nóg i/lub odruchem ogona, myszy są gotowe do wstrzyknięcia. Umieść zwierzęta z powrotem na lodzie, jeśli widoczne są odruchy bólowe. Procedura wstrzykiwania i elektroporacji trwa łącznie mniej niż 2-3 minuty, więc odpowiednio zaplanuj procedury hipotermii, iniekcji i elektroporacji, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie.
  2. Podczas znieczulenia, za pomocą standardowej pipety, ostrożnie odpipetuj żądaną ilość mieszanki plazmidowej, która ma zostać wstrzyknięta (0,5-2 μl) na kawałek warstwy wosku parafinowego w celach informacyjnych. Tutaj wstrzykuje się całkowitą objętość 0,5 μl mieszanki plazmidowej. Następnie, za pomocą mikrowtryskiwacza, ostrożnie włóż zmontowaną szklaną pipetę kapilarną do probówki zawierającej mieszaninę plazmidu. Podejmij dodatkowe środki ostrożności, aby zapobiec pęknięciu końcówki, upewniając się, że nie dotyka krawędzi rurki. Zassać roztwór do pipety, powoli przykręcając pokrętło transferu. Po załadowaniu wystarczającej objętości do pipety należy przesuwać suwak do przodu, aż ciśnienie powróci do pozycji neutralnej 0 hPa.
  3. Używając ciśnienia 300-450 hPa do wstrzykiwania, aby zapewnić odpowiednie ciśnienie do równomiernego wypełnienia powierzchni pial/przestrzeni oponowej, umieść końcówkę w pobliżu referencyjnego wstrzykiwania filmu parafinowego z pipetowaną parafiną (od 2.2) i użyj pedału nożnego z mikrowtryskiwacza, aby wyrzucić jedną objętość na film parafinowy. Dostosuj odpowiednio ciśnienie, aż wyrzucana ilość zrówna się z poprzednio odpipetowaną objętością referencyjną.
  4. Po zrównoważeniu końcówki i potwierdzeniu znieczulenia, szczenięta są gotowe do wstrzyknięcia.
  5. Celem eksperymentu jest wstrzyknięcie mieszanki plazmidowej pod czaszkę i powyżej powierzchni pial, aby umożliwić elektroporację DNA w dół do progenitorów na powierzchni pial (ryc. 1A). W przypadku wstrzyknięć do kory mózgowej należy przytrzymać szczenię za pomocą kciuka i palca wskazującego mniej dominującej ręki. Półkule korowe i inne powierzchowne struktury, takie jak górne wzgórki, są widoczne między P0 a P2, co pozwala na łatwe celowanie w te struktury (ryc. 1B). Używając dominującej ręki i docelowego obszaru kory mózgowej (tj. motorycznego, somatosensorycznego itp.), włóż pipetę obok skóry i czaszki, uważając, aby uniknąć tętnic mózgowych. Upewnij się, że nie dopuścić do dalszego przenikania końcówki poza czaszkę (na co wskazuje brak dalszego oporu tuż po przebiciu czaszki).
  6. Wstrzyknąć roztwór plazmidu za pomocą pedału nożnego mikrowstrzykiwacza i upewnić się, że równomiernie rozprowadza się w tkance (ryc. 2A).
    Uwaga: Bardzo ważne jest, aby empirycznie określić podejście, które maksymalizuje dostarczanie plazmidu, jednocześnie unikając krwiaka spowodowanego ciśnieniem płynu. Można to zrobić, dostosowując czas wstrzyknięcia, kąt, objętość i dokładne miejsce docelowe, aby uniknąć zaburzeń naczyniowych.
  7. Pamiętaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia końcówki między wstrzyknięciami, umieszczając końcówkę w kropelkach testowych z iniekcji wykonanych wcześniej na papierze woskowanym lub plastikowej folii parafinowej. Jest to wymagane, aby zapobiec gromadzeniu się w końcówce odparowanego i skrystalizowanego roztworu DNA, co może spowodować zatkanie końcówki i niespójne objętości dostarczania.

3. Elektroporacja

  1. Ustaw elektroporator na 135-150 V na pięć impulsów, trwających 50 ms, z przerwami 950 ms między każdym impulsem. Aby zwiększyć przewodność i zapobiec poparzeniom skóry, pokryj 3-milimetrową platynową pęsetę żelem do elektroporacji. Sprawdź, czy w tym momencie nie ma szczypania palców u nóg i odruchów ogonowych, aby zapewnić znieczulenie. Jeśli reaguje, umieść na lodzie na kilka minut w celu znieczulenia.
  2. Do wstrzykiwań kory mózgowej (i wzgórka górnego) należy użyć elektrody 3 mm (ryc. 2B), aby zwiększyć żywotność szczeniąt (w porównaniu z elektrodami 7 i 10 mm, które są używane do elektroporacji strefy komorowej). Umieść ujemnie naładowaną sondę elektrody nad obszarem wstrzyknięcia, a dodatnio naładowaną sondę wokół przeciwległego obszaru poniżej oka, tak aby elektroda była zorientowana pod kątem 45-60° w stosunku do linii środkowej (rysunek 2C).
  3. Użyj pedału nożnego elektroporatora, aby wyzwolić prąd i przytrzymaj pęsetę w miejscu przez 3-5 impulsów, w zależności od wieku i wagi szczeniąt, skutecznie kierując DNA do leżących poniżej komórek powierzchni pial podczas uwzględniania krzywizny półkul.
    Uwaga: Biegun ujemny można przesunąć po obszarze wtrysku między impulsami lub można zastosować większą elektrodę w celu zwiększenia obszaru elektroporowanego.
  4. Natychmiast po elektroporacji ostrożnie usuń żel ze szczeniąt i umieść je pod lampą grzewczą na około 5 minut.
  5. Szczenięta ostro tracą swój naturalny czerwonawo-różowy odcień w ciągu kilku minut po elektroporacji z powodu sinicy. Obserwuj młode pod kątem odzyskania naturalnego koloru i zainicjowania normalnego ruchu przed powrotem do klatek.
  6. Zapewnij resocjalizację z matką, obserwując, czy przynosi ona młode z powrotem do gniazda i zaczyna je pielęgnować. Jeśli stanie się agresywna, upewnij się, że szczenięta nie mają resztek żelu i wysiaduj je z częścią ściółki, aby przenieść zapach na szczenięta.

4. Modyfikacje dla celowania w górne kolikilusy

Kierowanie:

  1. Wstrzyknij górny wzgórek w taki sam sposób jak korę, ale zwróć uwagę, że obszar docelowy leży tuż za i bocznie do lambda i mniej więcej na linii środkowej (ryc. 3A i 3B). Przy udanych iniekcjach mieszanka plazmidowa w naturalny sposób wypełnia kontury wzgórka górnego. Po pomyślnym wykonaniu iniekcji zwierzęta są gotowe do elektroporacji.

Elektroporacja:

  1. W bardzo podobny sposób, w przypadku wstrzyknięć górnego wzgórka, umieść ujemnie naładowaną sondę elektrody na wstrzykniętym obszarze, a dodatnio naładowaną sondę wokół oka, pyska lub podbródka, kierując DNA do powierzchownych obszarów górnego wzgórka (ryc. 3C). W tym przypadku orientacja elektrody jest ustawiona pod kątem 25-40° w stosunku do linii środkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznym aspektem dla udanej elektroporacji komórek progenitorowych powierzchni pial są: 1) ukierunkowanie mieszanki plazmidowej na powierzchnię pial; 2) unikanie powstawania krwiaków w miejscu wstrzyknięcia; oraz 3) unikanie śmiertelności związanej z elektroporacją śródmózgowia.

Właściwe celowanie w powierzchnię pial odbywa się poprzez mierzone i ostrożne nakłucie czaszki, aby uniknąć penetracji powierzchni pial. O niewłaściwym kierowaniu na leżącą nad nią skórę lub leżącą pod n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie od Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award, a także funduszy od Instytutu Medycyny Regeneracyjnej w Cedars-Sinai i Rodziny Guerin. Opisany projekt był wspierany w formie CTSI Core Voucher ufundowanego przez National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, a obecnie znajduje się w National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polerowane ogniowo rury borokrzemianoweWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
Ściągacz do mikropipetSutter Instruments CompanyP-30
Fast Green FCFSigma Aldrich, Inc.F7528
Cyfrowy mikrowtryskiwacz XenoWorksSutter Instruments Company
ECM 830 GeneratorAparat Harvard, BTX Instrument Div45-0052
3-mm platynowe pęsetyAparat Harvard, instrument BTX Div45-0487
Żel elektrody SignaGelCardinal Health70315-025
Bufor Tris-EDTA, pH 8,0Integrated DNA Technologies, Inc.11-01-02-05
Lampa grzewcza na podczerwieńVWR36547-009
Cienkie nożyczki Ostrenarzędzia naukowe14060-09

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  4. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  5. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  6. Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
  7. Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
  8. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
  9. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
  10. Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
  11. Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
  12. Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
  13. Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
  14. Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
  15. Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
  16. Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
  17. Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
  18. Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
  19. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  20. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
  21. Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  23. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  24. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
  25. De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
  26. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
  27. Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
  28. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
  29. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  30. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  31. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
  32. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  33. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

M zg noworodkamanipulacja genetycznainiekcja plazmidutechnika elektroporacjiprogenitorzy neuronalniprzestrze oponowapipeta szklanamikroinjektorp seta platynowa

Powiązane artykuły