Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Summary

Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.

Abstract

3D organotypowe hodowle komórek nabłonkowych na matrycy z komórkami mezenchymalnymi są szeroko stosowane do badania różnicowania i inwazji komórek nabłonkowych. Kolagen i/lub matryca ogona szczura typu I pochodzące z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm były tradycyjnie wykorzystywane jako substraty do modelowania mikrośrodowiska macierzy lub zrębu, w którym znajdują się komórki mezenchymalne (zwykle fibroblasty). Chociaż eksperymenty z użyciem takich matryc są bardzo pouczające, można argumentować, że ze względu na nadrzędną obecność pojedynczego białka (takiego jak kolagen typu I) lub wysoką zawartość składników błony podstawnej i czynników wzrostu (takich jak w macierzy pochodzącej z komórek mięsaka myszy), substraty te nie odzwierciedlają najlepiej wkładu samych komórek zrębu w skład macierzy. Aby zbadać natywne matryce wytwarzane przez pierwotne fibroblasty skóry wyizolowane od pacjentów ze skłonnym do nowotworów, genetycznym zaburzeniem pęcherzowym (recesywne dystroficzne pęcherzowe oddzielanie się naskórka), dostosowaliśmy istniejący natywny protokół matrycowy do badania inwazji komórek nowotworowych. Fibroblasty są indukowane do wytwarzania własnej macierzy przez dłuższy czas w hodowli. Ta natywna matryca jest następnie odłączana od naczynia hodowlanego, a komórki nabłonkowe są na niej umieszczane, zanim cała kokultura zostanie podniesiona do granicy faz powietrze-ciecz. Różnicowanie i/lub inwazję komórkową można następnie ocenić w czasie. Technika ta zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy, a jedyną wadą jest wydłużony okres czasu wymagany do wytworzenia macierzy natywnej. Tutaj opisujemy zastosowanie tej techniki do oceny zdolności pojedynczej cząsteczki wyrażanej przez fibroblasty, kolagen typu VII, do hamowania inwazji komórek nowotworowych.

Introduction

Użycie biomateriału w hodowli tkanek 3D umożliwiło naukowcom badanie zachowania komórek w laboratorium w warunkach fizjologicznych bardziej zbliżonych do środowiska in vivo niż do środowiska rekapitulowanego z adhezją 2D i plastikowym podłożem. W szczególności poczyniono ogromne postępy w modelowaniu nabłonka warstwowego dzięki zastosowaniu metod hodowli 3D na granicy faz powietrze-ciecz^1-4. Takie techniki wiernie naśladują różnicowanie keratynocytów i inwazję komórek nowotworowych, umożliwiając badaczom badającym te procesy większą elastyczność i wierność. Wybór substratu biomateriałowego do naśladowania środowiska zrębu obejmował przede wszystkim użycie kolagenu typu I, macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm i odskórnej skóry właściwej. Na przykład wykazano, że fibroblasty związane z rakiem przyczyniają się do inwazji raka⁵, inicjacji i progresji poprzez interakcje zrębowo-nabłonkowe^6,7, gdy są hodowane w takich podłożach.

Złotym standardem naśladowania środowiska zrębu w skórze, największego i najczęściej badanego nabłonka warstwowego przy użyciu takich technik, jest de-epidermized human dermis (DED). Przygotowanie DED polega na usunięciu naskórka poprzez trypsynizację lub fizyczną dysocjację od skóry zwłok człowieka^3,4. Jednak dostęp do takiej skóry może być bardzo trudny dla laboratoriów niezwiązanych z instytucjami klinicznymi, a chora skóra właściwa jest prawie niemożliwa do uzyskania. Jako alternatywę, laboratoria często używają kombinacji kolagenu typu I (wyizolowanego z ogonów szczura) i/lub macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm.

Po odkryciu w 1927 roku przez Nageotte⁸, że kolagen można łatwo wyizolować za pomocą kwasu octowego i wytrącania soli, jego zastosowanie do hodowli tkankowej zostało następnie zapoczątkowane przez Huzellę i współpracowników⁹. Powłoka kolagenowa okazała się lepsza od szkła w hodowli komórkowej 29 szczepów i eksplantatów tkankowych, jak przebadali Ehrmann i Gey⁹. Obecnie główny rodzaj kolagenu stosowany w hodowli tkankowej jest izolowany ze ścięgien ogona szczura i jest zwykle kupowany ze źródeł komercyjnych. Jednak wadą wiernej rekapitulacji substratu jest to, że kolagen z ogona szczura nie jest identyczny z kolagenem ludzkim lub ludzką skórą właściwą, gdzie kolageny typu I i III są obecne jako główne składniki, a izolowany kolagen z ogona szczura jest niezmiennie rozdrobniony.

Macierz mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm to galaretowata mieszanina białek wydzielana przez hodowane komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm¹⁰. Głównymi składnikami są laminina, kolagen typu IV, siarczan heparyny, proteoglikan, entaktyna i nidogen, a dokładne proporcje tych białek będą się różnić w zależności od partii. Oprócz białek strukturalnych, matryca ta zawiera również znaczne poziomy czynników wzrostu, takich jak transformujący czynnik wzrostu β, naskórkowy czynnik wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu 1, czynnik wzrostu fibroblastów bydlęcych i płytkowy czynnik wzrostu, który zmieniłby zachowanie komórkowe^11,12. Wskazując na samą złożoność macierzy mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm, w niedawnym badaniu proteomicznym zidentyfikowano łącznie¹⁸⁵¹ białek. Ze względu na bogatą i złożoną naturę tej matrycy zaleca się ostrożność przy interpretacji i porównywaniu różnych eksperymentów z jej użyciem¹¹.

Nasze laboratoria żywo interesują się genetycznymi chorobami skóry, szczególnie tymi z predyspozycjami do rozwoju raka płaskonabłonkowego skóry (cSCC)¹⁴. W przypadku recesywnego dystroficznego pęcherzowego oddzielania się naskórka (RDEB), ciężkiej choroby pęcherzowej z mutacjami linii zarodkowej w genie^15-17 COL7A1, ustaliliśmy, że mikrośrodowisko skórne u tych pacjentów sprzyja nowotworowi¹⁸. W trakcie tego badania nie byliśmy w stanie ocenić właściwości fibroblastów skóry osadzonych w macierzy mięsaka myszy kolagenu I / Engelbreth-Holm-Swarm i badaliśmy sposoby oceny własnej, natywnej macierzy komórek. Aby to osiągnąć, zmodyfikowaliśmy poprzednią technikę z laboratorium Lucie Germain, pracując na odpowiednikach ludzkiej skóry^19,20. Technika Germaina była w stanie zrekonstruować ludzką skórę z dobrze zorganizowaną błoną podstawną przy użyciu pierwotnych kultur ludzkich keratynocytów i fibroblastów przy braku syntetycznego lub trupiego rusztowania.

W tym artykule opisano kroki użyte do podsumowania mikrośrodowiska zrębu guza skórnego (macierzy natywnej) pochodzącego bezpośrednio z pierwotnych fibroblastów zrębu in vitro ¹⁸. Natywne matryce wytworzone w wyniku długotrwałej hodowli fibroblastów zastosowano jako skórny odpowiednik testu na inwazję komórek cSCC. Przedstawiamy dane przy użyciu natywnej macierzy pochodzącej albo z macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielanej przez fibroblasty RDEB (z niedoborem kolagenu typu VII (C7)) lub z fibroblastów RDEB transdukowanych retrowirusowo konstruktem eksprymującym kolagen typu VII i wykazujemy głęboki wpływ pojedynczego kolagenu na inwazję komórek nowotworowych.

Protocol

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Zasad Helsińskich i zostało zatwierdzone przez odpowiednie Komisje Etyki.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

1. Przygotowanie 200x bulionu z 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego
   1. Rozpuścić 29 mg 2-fosforanu L-askorbinowego w 5 ml roztworu zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco i przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Przechowywać w postaci 0,25 ml sterylnych podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
   2. Dodać 0,25 ml podwielokrotności 200x 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego do każdych 50 ml pożywki fibroblastów (DMEM z 1% L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą) w wymaganym dniu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego.
2. Przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów
   1. Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów SCC została opisana wcześniej²¹. Opisano w nim również przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów.
   2. Pokrótce przygotuj podłoże w następujący sposób:
      300 ml DMEM i 100 ml Ham's F-12 uzupełnione 10% FBS
      0,4 mg/ml hydrokortyzonu
      5 mg/ml insuliny
      10 ng/ml EGF
      5 mg/ml transferyny
      8,4 ng/ml toksyny
      13 ng/ml liotyroniny
      1x roztwór penicyliny-streptomycyny

2. Budowa in vitro natywnej matrycy pochodzącej z fibroblastów w pożywce z dodatkiem 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego

1. Wysiewaj 200 000 fibroblastów na studzienkę na płytkach 6-dołkowych (20 000 komórek/^cm2) w pożywce fibroblastów uzupełnionej 2-fosforanem kwasu L-askorbinowego. Podawaj co 2-3 dni 2-5 ml pożywki. (Uwaga: Częstotliwość i objętość ponownego karmienia można dostosować do indywidualnych potrzeb różnych komórek. Zobacz "Dyskusje").
2. Pod koniec 6 tygodni utworzy się gruba warstwa komórek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej, widoczna gołym okiem (ryc. 1). Aby uwolnić tę warstwę z płytki do hodowli tkankowej, delikatnie zeskrob obwód matrycy końcówką mikropipety o pojemności 1 ml, a następnie popchnij krawędzie matrycy w kierunku środka dołka. Ta warstwa komórek i matrycy (matryca natywna) powinna być łatwa do oderwania od powierzchni płytki, a teraz unosić się w podłożu. Rozłóż natywną matrycę na nośniku, aby uniknąć jej składania się na siebie.
3. Pozwól natywnej matrycy unosić się i przemodelować przez 5 dni, zmieniając nośnik co 2-3 dni. Ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę w matrycy, matryca drastycznie się skurczy i zostanie zredukowana do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej i jest gotowa do wykorzystania w teście inwazji.

3. Test inwazji z keratynocytami SCC guza

1. Delikatnie podnieś natywną matrycę kleszczami i przenieś do siatki nylonowej. Po umieszczeniu na nylonowej siatce delikatnie rozprowadź matrycę, aby leżała jak najbardziej płasko, używając końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml i kleszczyków.
2. Przygotuj sterylne cylindry klonalne, smarując niewielką ilość sterylnej wazeliny na jednym końcu.
3. Umieść cylindry klonalne na macierzy natywnej, stroną z wazeliną do dołu. Ma to na celu zapewnienie szczelnego uszczelnienia między macierzyą natywną a pierścieniami klonalnymi.
4. Dodaj komórki cSCC do cylindrów klonalnych (250 000 komórek w 100 μl pożywki wzrostowej keratynocytów).
5. Wyjmij cylindry klonalne po 6 godzinach, gdy komórki cSCC osiądą na macierzy natywnej.
6. Podnieś siatkę nylonową z natywną matrycą i komórkami cSCC do interfejsu powietrze-ciecz na wygiętym wsporniku z siatki drucianej ze stali nierdzewnej.
7. Dodaj pożywkę wzrostową keratynocytów uzupełnioną kwasem askorbinowym, aż poziom pożywki dotknie dna macierzy natywnej.
8. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni i zbieraj po 7 i 14 dniach od wysiewu komórek cSCC.

4. Pobieranie kultur 3D i przygotowanie do histologii

1. Utrwal 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze pokojowej.
2. Przeciąć próbki na pół i zatopić w wosku w przypadku utrwalonych w formalinie bloków parafinowych, z powierzchnią cięcia skierowaną na zewnątrz.
3. Alternatywnie, należy osadzić przecięte na pół próbki w OCT i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w celu uzyskania świeżo zamrożonych bloków tkanek.
4. Wyciąć 4 μm odcinki na mikrotomie i odwoskować (jeśli to konieczne). Barwienie przy użyciu standardowej hematoksyliny i eozyny. Aby uwidocznić komórki cSCC, mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko keratynie 14 (LL001, we własnym zakresie) można zastosować w barwieniu immunohistologicznym.

Results

Ta technika otwiera możliwość badania i porównywania inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych (w tym przypadku cSCC) w różnych środowiskach zrębu 3D. Korzystając z tej techniki, można nie tylko wygenerować natywne matryce z niedoborem C7, które podsumowały środowisko skórne RDEB, ale także dodatkowe matryce, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu nadekspresji C7¹⁸. Jak widać na rycinie 2, inwazja keratynocytów cSCC RDEB była znacznie opóźniona w natywnych matrycach z nadekspresją C...

Discussion

Ze względu na charakter tego eksperymentu, całkowity czas potrzebny na jego ukończenie może wynosić do dwóch miesięcy. Przez cały ten czas należy zachować najwyższą ostrożność i stosować praktyki sterylnych hodowli tkankowych, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.

Oprócz roli kofaktora w syntezie hydroksyproliny i hydroksylizyny kolagenów, kwas askorbinowy stymuluje ekspresję mRNA specyficznego dla kolagenu w fibroblastach²². Kwas askorbinowy z wybor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fosforan kwasu L-askorbinowego	Sigma	A8960
DMEM z L-glutaminą, 4 500 mg/L D-glukoza, 110 mg/L pirogronian sodu	Life Technologies	11995-073
100x Penicylina-Streptomycyna	Life Technologies	15070
Wazelina	VWR	PROL28908.290
Cylindry klonalne	Sigma	Z370789
Siatka nylonowa Tarcza filtracyjna hydrofilowa 100 μ m 25 μ m średnica 100 / pk	Millipore	NY1H02500
Gięta siatka druciana ze stali nierdzewnej	Wykonane we własnym zakresie		Wymiary zostały wykonane tak, aby siatka pasowała do płyt 6-dołkowych