Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Podsumowanie

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Streszczenie

Wiele białek przejściowo oddziałuje z innymi białkami lub jest zintegrowanych w kompleksy wielobiałkowe, aby spełniać swoje biologiczne funkcje. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) to metoda monitorowania takich interakcji in vivo w komórkach roślinnych. W przedstawionym protokole badane białka kandydujące są łączone z komplementarnymi połówkami białek fluorescencyjnych, a odpowiednie konstrukty są wprowadzane do komórek roślinnych w procesie transformacji za pośrednictwem agrobacterium. Następnie białka ulegają przejściowej ekspresji w liściach tytoniu, a przywrócone sygnały fluorescencyjne można wykryć za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w nienaruszonych komórkach. Pozwala to nie tylko na wizualizację samej interakcji, ale także na określenie subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych. W tym celu geny markerowe zawierające znacznik fluorescencyjny mogą być koeksprymowane wraz z konstruktami BiFC, wizualizując w ten sposób struktury komórkowe, takie jak retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, aparat Golgiego lub błona plazmatyczna. Sygnał fluorescencyjny może być monitorowany bezpośrednio w komórkach naskórka liści lub w pojedynczych protoplastach, które można łatwo wyizolować z przekształconych liści tytoniu. BiFC idealnie nadaje się do badania interakcji białko-białko w ich naturalnym otoczeniu w żywej komórce. Należy jednak wziąć pod uwagę, że ekspresja musi być napędzana przez silne promotory i że partnerzy interakcji są modyfikowani w wyniku fuzji stosunkowo dużych znaczników fluorescencyjnych, co może zakłócać mechanizm interakcji. Niemniej jednak BiFC jest doskonałym podejściem uzupełniającym do innych powszechnie stosowanych metod badania interakcji białko-białko, takich jak koimmunoprecypitacja, testy in vitro pull-down lub eksperymenty z drożdżami i dwiema hybrydami.

Wprowadzenie

Badanie powstawania kompleksów białkowych i ich lokalizacji w komórkach roślinnych in vivo jest niezbędne do badania sieci komórkowych, sygnalizacji i procesów metabolicznych. BiFC umożliwia wizualizację interakcji białko-białko w ich naturalnym środowisku bezpośrednio w żywej komórce roślinnej^1-5.

W podejściu BiFC uzupełnienie dwóch niefluorescencyjnych N- i C-końcowych fragmentów białka fluorescencyjnego prowadzi do odtworzonego białka fluorescencyjnego. Do wykrywania oddziaływań białkowych wykorzystano fragmenty wielu różnych białek fluorescencyjnych, np. białka zielonej fluorescencji (GFP), którego chromofor jest chemicznie utworzony przez trzy odrębne reszty⁶. Białka fluorescencyjne można podzielić na pół w pętli lub ß-nici, aby uzyskać dwa niefluorescencyjne fragmenty, które można połączyć z obydwoma interesującymi białkami. Test może być stosowany do wykrywania interakcji w dowolnym przedziale subkomórkowym w dowolnym organizmie lub komórkach rosnących tlenowo, które można genetycznie modyfikować w celu ekspresji białek fuzyjnych. Jeśli te dwa białka znajdą się w bliskim sąsiedztwie w komórce, fluorescencja jest odtwarzana i może być monitorowana pod mikroskopem bez dodatku egzogennych fluoroforów lub barwników³.

Tytoń (Nicotiana benthamiana) okazał się wygodnym organizmem modelowym do wizualizacji interakcji białek roślinnych, ponieważ białka mogą być łatwo wyrażane poprzez wykorzystanie przemiany liści tytoniu za pośrednictwem agrobacterium z wygenerowanymi konstruktami. Agrobakterie wykorzystują tak zwany plazmid Ti (indukujący nowotwór) kodujący enzymy, które pośredniczą w transdukcji interesującego genu do komórek roślinnych. BiFC ma dobre zastosowanie zarówno do białek rozpuszczalnych, jak i błonowych we wszystkich przedziałach komórkowych i był z powodzeniem stosowany w ostatnich latach do identyfikacji oddziałujących białek in vivo, a także do analizy miejsc interakcji w białkach^7-9. Po ekspresji wprowadzonych genów można uwidocznić interakcję białek fluorescencyjnych bezpośrednio w liściach, co jest odpowiednie dla większych struktur komórkowych, takich jak retikulum endoplazmatyczne (ER), błona plazmatyczna lub chloroplasty. Jednak, aby monitorować lokalizację w bardziej wyrafinowanych strukturach, na przykład otoczce chloroplastowej, zaleca się wizualizację fluorescencji w protoplastach wyizolowanych z przekształconych liści tytoniu. Zestaw wektorów BiFC zawierających C-końcowy lub N-końcowy znacznik fluorescencyjny musi być użyty do podejścia BiFC w roślinach¹⁰. Opisany poniżej protokół został wykorzystany do zbadania interakcji cytozolowego białka szoku cieplnego 90 (HSP90) z domeną powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) zawierającą białka dokujące Toc64 i AtTPR7 znajdujące się odpowiednio w zewnętrznej otoczce chloroplastu i retikulum endoplazmatycznym^11-13. W tym celu HSP90 został połączony z C-końcową częścią SCFP (SCFP^C). Znacznik został N-końcowy połączony z opiekunem, aby zapewnić dostęp motywu wiązania C-końcowego MEEVD HSP90 do domen TPR typu zaciskowego. Równolegle N-końcowa część Wenus (Wenus^N) została połączona z cytozolowymi domenami domeny TPR zawierającymi odpowiednio białka dokujące Toc64 i AtTPR7. Jako kontrolę ujemną sklonowaliśmy rozpuszczalną C-końcową część SCFP^C, która znajduje się wyłącznie w cytozolu, a zatem jest odpowiednią kontrolą.

Znaczniki fluorescencyjne badanych białek muszą być zwrócone w stronę tego samego przedziału komórkowego, aby umożliwić zbliżenie się i tym samym odtworzenie sygnału fluorescencyjnego. Aby określić lokalizację odtworzonego sygnału fluorescencyjnego, białko markerowe połączone z innym znacznikiem fluorescencyjnym może zostać przekształcone w celu zademonstrowania subkomórkowej lokalizacji oddziaływania. Białko markerowe ER połączone z mCherrry zostało przekształcone jednocześnie w przypadku ER zlokalizowanego w TPR7¹⁴. Autofluorescencja chlorofilu posłużyła jako marker chloroplastowy w przypadku Toc64. Dzięki temu można nie tylko monitorować in vivo oddziaływanie Toc64 i AtTPR7 odpowiednio z cytozolowym opiekunem HSP90 bezpośrednio w liściach tytoniu, ale także można zbadać subkomórkową lokalizację interakcji.

BiFC dobrze nadaje się jako uzupełnienie innych metod badania oddziaływań białko-białko. W porównaniu na przykład z koimmunoprecypitacją lub eksperymentami in vitro typu pull-down, dla białek będących przedmiotem zainteresowania nie muszą być dostępne żadne specyficzne przeciwciała, a białka nie muszą ulegać rekombinowanej ekspresji in vitro, co może być trudne, zwłaszcza w przypadku białek błonowych. Co więcej, za pomocą BiFC można również monitorować interakcje przejściowe, ponieważ białka są wychwytywane przez interakcję połączonych znaczników fluorescencyjnych¹⁵.

Protokół

1. Transformacja konstruktów BiFC w agrobakteriach

1. Klonowanie konstruktów BiFC
   1. Amplifikować interesujący nas gen z odpowiedniej matrycy za pomocą oligonukleotydów zawierających flankujące miejsca attB. Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy korektoracyjnej. Dostosuj długość etapu wyżarzania do zaprojektowanej kombinacji podkładu, a długość etapu wydłużania do wielkości fragmentu. Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyść go za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
   2. Przeprowadź reakcję BP z otrzymanym fragmentem i wektorem wejściowym za pomocą rekombinazy BP. Zmieszać 15-150 ng produktu attB-PCR ze 150 ng wektora wejściowego, dodać 2 μl rekombinazy BP i wypełnić buforem TE do całkowitej objętości 8 μl. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję, dodając 2 μl proteinazy K przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Przekształć całą reakcję w kompetentne komórki DH5α E. coli i przebadaj uzyskane kolonie za pomocą PCR kolonii pod kątem prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA do wektora. Sekwencjonowanie DNA plazmidów dodatnich przeprowadza się w celu sprawdzenia braku mutacji.
   4. Użyj uzyskanego klonu wejściowego do rekombinacji LR z odpowiednim wektorem docelowym za pomocą rekombinazy LR. Zmieszać 50-150 ng wektora wejściowego ze 150 ng wektora docelowego, dodać 1 μl rekombinazy LR i wypełnić buforem TE do całkowitej objętości 5 μl. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję, dodając 1 μl proteinazy K przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
   5. Przekształć całą reakcję w kompetentne komórki E. coli DH5α i przebadaj uzyskane kolonie za pomocą PCR kolonii w celu prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA do wektora. Na tym etapie sekwencjonowanie DNA nie jest konieczne.
   6. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu plazmidu Mini, aby zapewnić wysoki stopień czystości.
2. Przygotowanie chemicznie kompetentnych agrobakterii (szczep AGL1, odporność na ryfampicynę i karbenicylinę)
   1. Usunąć agrobakterie z kultury podstawowej i rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.
   2. Zaszczepić 5 ml pożywki LB pojedynczą kolonią i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C.
   3. Zaszczepić 50 ml pożywki LB 2 ml kultury na noc i rosnąć przez około 4 godziny w temperaturze 28 °C do OD₆₀₀ 1,0.
   4. Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 1 ml wysterylizowanego, lodowatego CaCl₂ (10 mM). Po tym kroku utrzymuj komórki na lodzie.
   5. Przygotować podwielokrotności (100 μl) komórek, natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Transformacja chemicznie kompetentnych agrobakterii
   1. Rozmrozić jedną podwielokrotność kompetentnych komórek AGL1 na lodzie. Dodaj 1-2 μg plazmidowego DNA do komórek. Inkubować przez 5 minut na lodzie, 5 minut w ciekłym azocie i 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 600 μl pożywki LB do komórek i wstrząsać z prędkością 650 obr./min przez 4 godziny w temperaturze 28 °C.
   2. Odwirować komórki przez 1 minutę przy 8 000 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 50 μl pozostałej pożywki LB i ułożyć ją na płytkach LB zawierających odpowiednie antybiotyki. Uszczelnić płytki i inkubować przez 2 dni w temperaturze 28 °C. Przesiać kolonie na obecność plazmidu metodą PCR kolonii.
   3. Zaszczepić jedną dodatnią kolonię w 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki i inkubować w temperaturze 28 °C przez noc. Zmieszać 500 μl nocnej kultury z 500 μl 50% wysterylizowanego glicerolu i zamrozić w temperaturze -80 °C.
   4. Zaszczepić agrobakterie w pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki bezpośrednio z glicerolu do przejściowej przemiany liści tytoniu.

2. Przejściowa przemiana liści tytoniu

1. Wzrost agrobakterii
   1. Przygotować następujące roztwory podstawowe: acetosyringon (150 mM, rozpuścić w 70% EtOH), przechowywać w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 °C. MES/KOH (0,1 M) pH 5,7, przechowywać w temperaturze 4 °C (sterylny filtr przez filtr 0,2 μM, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas dłuższego przechowywania), MgCl₂ (1 M), przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Zaszczepić 10 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki 50 μl podstawowej kultury glicerolu AGL1 zawierającej plazmid będący przedmiotem zainteresowania w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i inkubować w temperaturze 28 °C przez co najmniej 24 godziny, wytrząsając z prędkością 190 obr./min, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ między 1,0-2,0
   .
   3. Odwirować bakterie przy 3 000 x g przez 15 min. Zawiesić osad w świeżo przygotowanym podłożu infiltracyjnym [MgCl₂ (10 mM), MES/KOH (10 mM) pH 5,7, acetosyringon (150 μM)] i dostosować zawiesinę do OD₆₀₀ 1,0.
   4. Inkubuj komórki agrobakterii w wytrząsarce nad głową przez 2 godziny w ciemności. Komórki mogą być następnie wykorzystane do infiltracji.
2. Infiltracja liści tytoniu
   1. Używaj trzytygodniowych sadzonek tytoniu (Nicotiana benthamiana). Wybierz kilka starszych liści do infiltracji.
   2. Wymieszać równe objętości agrobakterii przenoszących interesujące nas konstrukty (po 3 ml każdy). Weź strzykawkę o pojemności 5 ml bez igły do infiltracji. Zawiesinę komórkową należy ostrożnie wprowadzić do liści tytoniu, naciskając strzykawkę na spodniej stronie liści w kilku miejscach.
   3. Podlej rośliny i pozostaw je w ciemności na dwa dni.

3. Przygotowanie Protoplastu

Preparat protoplastowy z liści tytoniu został zaadaptowany z Koop et al.¹⁶ i nieznacznie zmodyfikowane.

1. Przygotowanie buforu
   1. Przygotować pożywkę F-PCN: makrosole [KNO₃ (1012 μg/ml), CaCl₂•2H₂O (440 μg/ml), MgSO₄•7H₂O (370 μg/ml), KH₂PO₄ (170 μg/ml), NH 4-bursztynian [(20 mM; przygotować 2 M roztwór podstawowy (bursztynian (236 μg/ml) i NH₄Cl (106 μg/ml), dostosować do pH 5,8 do rozpuszczenia)], Mikrosole [EDTA-Fe(III) x Na-sól (40 μg/ml), KJ (0,75 μg/ml), H₃BO₃ (3 μg/ml), MnSO₄•H₂O (10 μg/ml), ZnSO₄•7H₂O (2 μg/ml), Na₂MoO₄•7H₂O (0,25 μg/ml), CuSO₄•5H₂O (0,025 μg/ml), CoCl₂•6H₂O (0,025 μg/ml)], MES (390 μg/ml), glukoza (około 80 μg/ml), osmolarność 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotuj pożywkę F-PIN: Wszystkie składniki jako F-PCN, ale zamiast glukozy użyj sacharozy (około 110 μg/ml), osmolarność 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotować pożywkę W5: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolarność 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C (sterylny filtr przez filtr 0,2 μm, aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas dłuższego przechowywania).
   4. Przygotować świeży roztwór enzymu do izolacji protoplastów (0,1 g celulazy, 0,03 g macerozymu w 10 ml F-PIN). Inkubować roztwór w temperaturze 55 °C przez 10 minut i schłodzić do temperatury suchej. Dodać 100 μl 10% BSA do 10 ml roztworu.
2. Izolacja protoplastów
   1. Umieść jeden naciekany liść na szalce Petriego i dodaj świeży roztwór enzymu. Użyj nowej żyletki, aby pokroić liść na około 0,5 cm² kawałki. Przenieść kawałki liści z roztworem enzymu do kolby do infiltracji próżniowej i infiltrować próżniowo przez około 20 sekund, aż z liści wyłonią się pęcherzyki powietrza (bardzo ostrożnie uwolnić próżnię).
   2. Potrząsać kolbą przez 90 minut przy 40 obr./min w ciemności.
   3. Uwolnić protoplasty, wstrząsając przez 1 minutę przy 90 obr./min. Przefiltrować roztwór przez gazę (100 μM) do 15 ml probówki wirówkowej (okrągłe dno).
   4. Nałożyć roztwór protoplastu na 2 ml buforu F-PCN i odwirowywać przez 10 minut przy 70 x g (powolne przyspieszanie i zwalnianie) w temperaturze pokojowej.
   5. Nienaruszone protoplasty gromadzą się na granicy faz roztworu enzymatycznego i F-PCN. Weź końcówkę pipety o pojemności 1 ml z szerokim otworem, aby przenieść nienaruszone protoplasty do świeżej probówki wirówkowej i napełnić buforem W5. Wirować przez 2 minuty przy 100 x g (powolne przyspieszanie i zwalnianie) w celu osadzania protoplastów.
   6. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i zawiesić osad w buforze W5 o pojemności około 200 μl, w zależności od ilości protoplastów.
   7. Zawsze używaj końcówek kryz z szerokimi otworami, aby zapobiec pękaniu nienaruszonych protoplastów.

4. Laserowa mikroskopia skaningowa

1. Przygotowanie próbki
   1. Wklej dwa małe paski szczeliwa wokół szkiełka mikroskopowego (w odległości 2 cm od siebie). Umieść 20 μl roztworu protoplastu między paskami i ostrożnie umieść na nich szklankę nakrywającą. Paski szczeliwa zapewniają, że protoplasty nie zostaną zgniecione przez szkło nakrywkowe.
   2. Aby uzyskać całkowitą ilość próbek liści, odetnij 1 cm kawałek od liścia i umieść go na szkiełku mikroskopowym dolną stroną liścia skierowaną do góry. Dodać około 30 μl H₂O, umieścić szklankę nakrywkową na wierzchu i mocno przymocować taśmą klejącą po obu stronach.
2. Obrazowanie konfokalne i ustawienia mikroskopu
   1. Obrazowanie wykonywane jest za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego firmy Leica, typu: TCS SP5. Do powiększenia należy użyć soczewki obiektywowej (HCX, PL, APO, CS) o jasności 63X z glicerolem jako medium obrazowania. Ustaw przysłonę numeryczną na 1,3. Do oceny należy użyć pakietu Leica Application Suite/Advanced Fluorescence (patrz Dane uzupełniające S1).
   2. Ustaw laser argonowy na 30%, a moc lasera na 488 nm na intensywność 18%, aby monitorować odtworzony sygnał BiFC przy 515 nm i ustaw szerokość pasma emisji jednego detektora PMT w zakresie 495-550.
   3. Aby monitorować autofluorescencję chlorofilu, ustaw szerokość pasma emisji drugiego detektora PMT w zakresie 650-705.
   4. Do monitorowania sygnału mCherry użyj lasera HeNe 561, ustaw intensywność lasera 561 na 18%, a pasmo emisji trzeciego detektora PMT od 587-610.
   5. Upewnij się, że zdjęcia wszystkich kanałów detektora PMT są wykonane z tymi samymi ustawieniami wzmocnienia (wzmocnienie powinno wynosić od 800 do 900, aby wykluczyć sygnały tła).
   6. Rób zdjęcia w formacie szerokość/wysokość 1024 x 1024 pikseli z prędkością skanowania 100 Hz.
   7. W przypadku układania w stosy w kształcie litery Z należy zachować maksymalną odległość 0,5 μm między każdym stosem.

Wyniki

W niniejszym przykładzie zastosowaliśmy metodę BiFC do monitorowania oddziaływania cytozolowego chaperonu molekularnego HSP90 z białkami dokującymi błony AtTPR7 i Toc64. AtTPR7 jest częścią translokonu Sec i oddziałuje z chaperonami cytozolowymi, które prawdopodobnie dostarczają preprotein sekrecyjnych do translokacji potranslacyjnej do błony ER. Podobnie białko Toc64 w zewnętrznej osłonce chloroplastów uczestniczy w imporcie potranslacyjnym, przyjmując powiązane z HSP90 preproteiny chloroplastowe. Oba białka posiadają w...

Dyskusja

Planując eksperyment BiFC, należy wziąć pod uwagę kilka punktów. Chociaż nie są wymagane żadne informacje strukturalne o białkach będących przedmiotem zainteresowania, topologia musi być znana podczas pracy z białkami obejmującymi błonę. Białka fluorescencyjne muszą znajdować się w tym samym przedziale subkomórkowym lub być skierowane po tej samej stronie błony, aby umożliwić interakcję. Oczywiście, analizując białka, które wymagają N-końcowej sekwencji docelowej, można wziąć pod uwagę tylko znacznik C-końcowy. Ponieważ ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3',5'-Dimetoksy-4'-hydroksyacetofenon	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	od Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	firmy Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning