Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Regina Schweiger; Serena Schwenkert

doi:10.3791/51327

Artykuł metodologiczny

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

DOI:

10.3791/51327

⸱

9 marca 2014

Regina Schweiger¹ , Serena Schwenkert¹

¹Department Biologie I, Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität, München

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek przejściowo oddziałuje z innymi białkami lub jest zintegrowanych w kompleksy wielobiałkowe, aby spełniać swoje biologiczne funkcje. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) to metoda monitorowania takich interakcji in vivo w komórkach roślinnych. W przedstawionym protokole badane białka kandydujące są łączone z komplementarnymi połówkami białek fluorescencyjnych, a odpowiednie konstrukty są wprowadzane do komórek roślinnych w procesie transformacji za pośrednictwem agrobacterium. Następnie białka ulegają przejściowej ekspresji w liściach tytoniu, a przywrócone sygnały fluorescencyjne można wykryć za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w nienaruszonych komórkach. Pozwala to nie tylko na wizualizację samej interakcji, ale także na określenie subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych. W tym celu geny markerowe zawierające znacznik fluorescencyjny mogą być koeksprymowane wraz z konstruktami BiFC, wizualizując w ten sposób struktury komórkowe, takie jak retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, aparat Golgiego lub błona plazmatyczna. Sygnał fluorescencyjny może być monitorowany bezpośrednio w komórkach naskórka liści lub w pojedynczych protoplastach, które można łatwo wyizolować z przekształconych liści tytoniu. BiFC idealnie nadaje się do badania interakcji białko-białko w ich naturalnym otoczeniu w żywej komórce. Należy jednak wziąć pod uwagę, że ekspresja musi być napędzana przez silne promotory i że partnerzy interakcji są modyfikowani w wyniku fuzji stosunkowo dużych znaczników fluorescencyjnych, co może zakłócać mechanizm interakcji. Niemniej jednak BiFC jest doskonałym podejściem uzupełniającym do innych powszechnie stosowanych metod badania interakcji białko-białko, takich jak koimmunoprecypitacja, testy in vitro pull-down lub eksperymenty z drożdżami i dwiema hybrydami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie powstawania kompleksów białkowych i ich lokalizacji w komórkach roślinnych in vivo jest niezbędne do badania sieci komórkowych, sygnalizacji i procesów metabolicznych. BiFC umożliwia wizualizację interakcji białko-białko w ich naturalnym środowisku bezpośrednio w żywej komórce roślinnej^1-5.

W podejściu BiFC uzupełnienie dwóch niefluorescencyjnych N- i C-końcowych fragmentów białka fluorescencyjnego prowadzi do odtworzonego białka fluorescencyjnego. Do wykrywania oddziaływań białkowych wykorzystano fragmenty wielu różnych białek fluorescencyjnych, np. białka zielonej fluorescencji (GFP), którego chromofor....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformacja konstruktów BiFC w agrobakteriach

Klonowanie konstruktów BiFC
1. Amplifikować interesujący nas gen z odpowiedniej matrycy za pomocą oligonukleotydów zawierających flankujące miejsca attB. Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy korektoracyjnej. Dostosuj długość etapu wyżarzania do zaprojektowanej kombinacji podkładu, a długość etapu wydłużania do wielkości fragmentu. Sprawdź produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyść go za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
2. Przeprowadź reakcję BP z otrzymanym fragmentem i wektorem wejściowym za pomocą rekombinazy BP. Zmieszać 15-150 ng produktu attB-PCR ze 150 ng wektora ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przykładzie użyliśmy metody BiFC do monitorowania interakcji cytozolowego molekularnego białka opiekuńczego HSP90 z białkami dokującymi błonę AtTPR7 i Toc64. AtTPR7 jest częścią translokonu Sec i oddziałuje z cytozolowymi białkami opiekuńczymi, które prawdopodobnie dostarczają preproteiny wydzielnicze do translokacji potranslacyjnej do błony ER. Podobnie, Toc64 na zewnętrznej otoczce chloroplastu działa w imporcie potranslacyjnym, odbierając preproteiny chloroplastowe związane z HSP90. Oba białka zawierają cytozolo.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planując eksperyment BiFC, należy wziąć pod uwagę kilka punktów. Chociaż nie są wymagane żadne informacje strukturalne o białkach będących przedmiotem zainteresowania, topologia musi być znana podczas pracy z białkami obejmującymi błonę. Białka fluorescencyjne muszą znajdować się w tym samym przedziale subkomórkowym lub być skierowane po tej samej stronie błony, aby umożliwić interakcję. Oczywiście, analizując białka, które wymagają N-końcowej sekwencji docelowej, można wziąć pod uwagę tylko znacznik C-końcowy. Ponieważ .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Jürgenowi Sollowi za pomocne dyskusje i Chrisowi Carrie za krytyczną lekturę rękopisu. Projekt ten został sfinansowany przez DFG i Fonds der chemischen Industrie (granty o numerach SFB 1035, projekt A04 dla S.S. i Do 187/22 dla R.S.).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3',5'-Dimetoksy-4'-hydroksyacetofenon	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	od Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	firmy Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-^GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)^GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)^GW	Invitrogen		Gateway-cloning

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
Schutze, K., Harter, K., Chaban, C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalna transformacja Agrobacterium detekcja fluorescencji lokalizacja subkom rkowa izolacja protoplast w markery fluorescencyjne skanowanie laserowe

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły