Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

37.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51328

⸱

7 lipca 2014

 ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Streszczenie

Wysoki poziom reaktywnych form tlenu (ROS) może spowodować zmianę komórkowego stanu redoks w kierunku stresu oksydacyjnego. Taka sytuacja powoduje utlenianie cząsteczek (lipidów, DNA, białek) i prowadzi do śmierci komórki. Stres oksydacyjny wpływa również na postęp kilku stanów patologicznych, takich jak cukrzyca, retinopatie, neurodegeneracja i rak. Dlatego tak ważne jest zdefiniowanie narzędzi do badania warunków stresu oksydacyjnego nie tylko na poziomie pojedynczych komórek, ale także w kontekście całych organizmów. W tym przypadku uważamy zarodek danio pręgowanego za przydatny system do przeprowadzania takich badań i przedstawiania protokołu pomiaru stresu oksydacyjnego in vivo. Korzystając z fluorescencyjnych sond ROS i transgenicznych linii fluorescencyjnych zebry danio pręgowanego, opracowujemy dwie różne metody pomiaru stresu oksydacyjnego in vivo: i) "metodę wykrywania ROS całego zarodka" do jakościowego pomiaru stresu oksydacyjnego oraz ii) "metodę wykrywania ROS w pojedynczej komórce" do ilościowych pomiarów stresu oksydacyjnego. W niniejszym artykule wykazujemy skuteczność tych procedur poprzez zwiększenie stresu oksydacyjnego w tkankach za pomocą środków utleniających oraz metod fizjologicznych lub genetycznych. Protokół ten jest podatny na badania genetyczne i pomoże rozwiązać związki przyczynowo-skutkowe ROS w modelach zwierzęcych patologii związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak zaburzenia neurologiczne i nowotwory.

Wprowadzenie

Stres oksydacyjny jest konkretnie zdefiniowany jako stan, który wynika z niezrównoważonego komórkowego stanu redoks. Złożone reakcje redoks, które rutynowo zachodzą wewnątrz komórek, określają komórkowy stan redoks. Reakcje redoks obejmują wszystkie reakcje chemiczne, które polegają na przenoszeniu elektronów między atomami cząsteczek biologicznych, powodując redukcję i utlenianie cząsteczek (tj. reakcje redoks). Reakcje te są katalizowane przez formy aktywowane elektronicznie (tj. formy prooksydacyjne), które charakteryzują się skrajną niestabilnością strukturalną i spontaniczną aktywacją niezrównoważonych elektronów, które wymieniają się z sąsiednimi biomolekułami. Te nieregularne reakcje prowadzą do uszkodzenia DNA, karboksylacji białek i utleniania lipidów, a ostatecznie prowadzą do śmierci komórki1. Zwiększony poziom stresu oksydacyjnego jest związany ze starzeniem się i postępem różnych stanów patologicznych2. Doniesiono, że stres oksydacyjny jest odpowiedzialny za zmiany naczyniowe w cukrzycy i chorobach sercowo-naczyniowych3,4. Odgrywa również kluczową rolę w zwyrodnieniu neuronów w chorobie Alzheimera i chorobie Parkinsona5. Ponadto wykazano, że stres oksydacyjny jest kluczowym czynnikiem regulującym progresję raka i przerzuty6,7. Ponadto stan zapalny i reakcje immunologiczne mogą wywoływać i dodatkowo wspierać stres oksydacyjny8.

W żywych komórkach prooksydacyjne formy pochodzą z tlenu (ROS; reaktywne formy tlenu) lub azotu (RNS; reaktywne formy azotu). ROS obejmują rodnik hydroksylowy (.OH), anion ponadtlenkowy (O2-) i nadtlenek wodoru (H2O2). Podstawowym RNS jest podtlenek azotu (NO). Szereg wtórnych form reaktywnych może być generowany przez spontaniczne interakcje między ROS i RNS lub jonami wolnych metali9. Na przykład anion ponadtlenkowy reaguje z podtlenkiem azotu, tworząc nadtlenoazotan (ONOO-), podczas gdyH2O2 reagując z Fe2+ generuje rodniki hydroksylowe. ROS i RNS, ze względu na swoją zdolność do reagowania z kilkoma biomolekułami, są uważane za niebezpieczne zagrożenie dla utrzymania fizjologicznego stanu redoks10. Aby utrzymać stan redoks, komórki są wyposażone w szereg detoksykujących cząsteczek przeciwutleniających i enzymów. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza, peroksydaza glutationowa i peroksyredoksyny zasadniczo stanowią przeciwutleniacz enzymatyczny, który zapewnia ochronę komórkową przed formami prooksydacyjnymi, w tymH2O2, . OH i OONO- 11. Również cząsteczki przeciwutleniające, takie jak witamina C i E, polifenole i koenzym Q10 (CoQ10) mają kluczowe znaczenie dla wygaszania ROS i ich niebezpiecznych pochodnych12,13. Jednak nadmierna produkcja ROS i RNS lub dysfunkcja systemu przeciwutleniającego przesuwa komórkowy stan redoks w kierunku stresu oksydacyjnego14.

Oprócz negatywnych konotacji, ROS mogą odgrywać różne fizjologiczne role w komórkach różnego pochodzenia. Komórki normalnie wytwarzają ROS jako cząsteczki sygnałowe, które pośredniczą w normalnych zdarzeniach biologicznych, takich jak obrona gospodarza i gojenie ran15-17. Formy reaktywne są zwykle wytwarzane w komórkach przez enzymy wewnątrzkomórkowe, takie jak NOX (oksydaza NADPH) i XO (oksydaza ksantynowa) w odpowiedzi na czynniki sygnałowe, czynniki wzrostu i wewnątrzkomórkowe wahania poziomu wapnia18,19. Doniesiono, że ROS może w różny sposób modulować aktywność ważnych czynników jądrowych, takich jak p53 lub składników komórkowych, takich jak kinaza ATM, główny regulator odpowiedzi na uszkodzenie DNA20. Analogicznie ROS silnie wpływają na sygnalizację komórkową, pośrednicząc w utlenianiu i inaktywacji białkowych fosfataz tyrozynowych (PTP), które są ustalane jako krytyczne regulatory transdukcji sygnału21. Co więcej, metodologie oparte na proteomice pokazują, że RNS są również odpowiedzialne za specyficzne modyfikacje białek i zmiany sygnalizacji molekularnej. RNS reagują z grupami cysteinowo-tiolowymi, modyfikując je w S-nitrotiole (SNO) i uruchamiając szlaki molekularne współistniejące ze stanami patologicznymi, takimi jak choroby zapalne i autoimmunologiczne22,23.

Ponieważ eksperymenty z hodowlą komórkową tylko częściowo odtwarzają mnogość czynników działających in vivo, bardzo interesujące jest przeprowadzenie badań redoks na modelach zwierzęcych24,25. Aby to osiągnąć, danio pręgowany został uznany za odpowiedni model zwierzęcy kręgowców do badania dynamiki stresu oksydacyjnego26. Danio pręgowany to nowy system modelowy, który daje kilka korzyści w badaniu zdarzeń komórkowych i genetycznych podczas rozwoju i choroby kręgowców. Duże skupiska zarodków mogą być generowane i dostępne co tydzień do celów eksperymentalnych. Co więcej, niezwykła przejrzystość optyczna zarodków danio pręgowanego, a także ich niewielkie rozmiary, umożliwiają obrazowanie pojedynczych komórek i dynamiczne śledzenie w całych organizmach27. W ciągu ostatniej dekady wygenerowano znaczną liczbę mutantów danio pręgowanego w celu modelowania stanów patologicznych człowieka, takich jak rak i choroby genetyczne28-31. Co najważniejsze, wyprodukowano wiele linii transgenicznych, które dają szerokie możliwości manipulacji genetycznych i biologicznych32. Na przykład transgeniczne linie danio pręgowanego specyficzne dla tkanek są regularnie wykorzystywane do badań in vivo. Linie te wyrażają białko fluorescencyjne pod kontrolą wybranego promotora, oferując możliwość identyfikacji pojedynczych komórek in vivo, a także budowy anatomicznej, z której się składają.

Kilka badań toksykologicznych już wykorzystało danio pręgowanego do oceny wpływu in vivo substancji chemicznych na homeostazę redoks, sugerując przydatność tego kręgowca jako modelu zwierzęcego dla dziedziny odkrywania leków i stresu oksydacyjnego33-35. Mimo że niektóre sondy fluorescencyjne zostały przetestowane w celu monitorowania stresu oksydacyjnego u larw danio pręgowanego36,37, nie ma ustalonych testów do wykrywania i mierzenia poziomu stresu oksydacyjnego w tkankach danio pręgowanego i żywych komórkach. W tym artykule opisano procedurę ilościowego oznaczania in vivo stresu oksydacyjnego w żywych komórkach zarodków danio pręgowanego. Narzędzia do obrazowania, sortowanie FACS, sondy fluorescencyjne i warunki prooksydacyjne zostały połączone w celu stworzenia prostego testu do wykrywania i ilościowego oznaczania gatunków utleniających w zarodkach i tkankach danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów i roztworów roboczych

  1. Przygotuj roztwór wodny dla ryb. Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 2 g soli morskiej "Instant Ocean" w 50 ml wody destylowanej. Dodać 1,5 ml bulionu rybnego do 1 l wody destylowanej, aby przygotować gotową do użycia wodę dla ryb (końcowe stężenie 60 μg/ml soli morskich). Autoklaw gotowej do użycia wody dla ryb przed użyciem. Roztwór ten jest stosowany jako pożywka dla zarodków danio pręgowanego.
  2. Przygotować metylocelulozę do montażu zarodka. Rozpuścić 1,5 g metylocelulozy w 50 ml sterylnej wody dla ryb. Ułatw rozpuszczanie za pomocą magnesu umieszczonego na płytce mieszającej. Całkowite rozpuszczenie proszku może zająć kilka godzin. Sprawdzić klarowność roztworu i podzielić go na małe probówki. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy i rozmrozić porcje po użyciu. Odwirować metylocelulozę przy 950 x g przez 5 minut przed użyciem. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania podwielokrotności.
  3. Przygotować 50 ml soli metanosulfonianu trikainy/3-aminobenzoesanu etylu (roztwór podstawowy), rozpuszczając 200 mg tricainy w 100 ml wody i dostosować pH do 7,0 za pomocą Tris-HCl 1 M (pH 9). Przechowywać ten bulion w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 30 dni. UWAGA: trikaina jest toksyczna. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
  4. Wywoływanie stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego
    1. Przygotować roztwór utleniacza do ogólnej indukcji stresu oksydacyjnego: Przygotować 50 ml roztworu utleniacza, dodając roztwór podstawowyH2O2(nadtlenek wodoru; 100 mM) do wody dla ryb. UżyćH2O2o końcowym stężeniu od 2 mM do 100 μM. Przygotować ten roztwór na krótko przed użyciem. Roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROS w całej instalacji, jak i do wykrywania ROS w pojedynczych komórkach. Nie przechowuj tego roztworu. UWAGA:H2O2jest niebezpieczny i szkodliwy przez drogi oddechowe i po połknięciu. Kontakt z materiałem palnym może spowodować pożar. Przechowywać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Przygotować roztwór utleniacza do indukcji stresu oksydacyjnego pochodzącego z mitochondriów: Przygotować roztwór podstawowy utleniacza (5 mM), rozpuszczając 3,9 mg rotenonu w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać ten roztwór w temperaturze pokojowej w ciemności.
      1. Rozpuścić roztwór podstawowy rotenonu w 10 ml wody dla ryb, aby uzyskać roztwór gotowy do użycia. Stosować rotenon w stężeniu od 5 do 50 μM. Nie należy stosować rotenonu w stężeniach wyższych niż 100 μM. W odpowiednich stężeniach ten roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROM w całej instalacji, jak i do wykrywania ROM w pojedynczych komórkach. UWAGA: Rotenon jest toksyczny i niebezpieczny. Postępuj zgodnie z odpowiednimi zwrotami środków ostrożności.
    3. Indukuj stres oksydacyjny przez knock-down: Knock-down ekspresja genu nrf2a w zarodkach danio pręgowanego przez mikroiniekcję morfolino, jak wcześniej zgłoszono przez Timme-Laragy A. i in., 201238.
    4. Indukuj stres oksydacyjny po uszkodzeniu tkanki: wygeneruj brzeg rany na płetwie ogonowej zarodków danio pręgowanego przy 72 hpf, jak wcześniej opisali Niethammer i wsp., 200939.
  5. Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROM do metody wykrywania ROM w pojedynczych komórkach:
    1. Rozwiązanie do ogólnego wykrywania ROS: Rozpuść generyczną sondę molekularną wrażliwą na ROS w HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa) w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM). Roztwór ten należy przygotować na krótko przed użyciem.
    2. Rozwiązanie do specyficznego wykrywania ROS indukowanego przez mitochondria: Na krótko przed użyciem rozpuść mitochondrialną sondę wrażliwą na ROM za pomocą DMSO, tworząc roztwór podstawowy o stężeniu 5 mM. Rozpuścić roztwór podstawowy w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM).
      UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło i tlen roztworów roboczych do wykrywania ROS i ich odpowiednich roztworów podstawowych. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Nie przechowywać ani nie używać ponownie sond rozpuszczonych w HBSS. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze -20 °C przez miesiąc.
      UWAGA: Z sondami molekularnymi i DMSO należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.
  6. Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROS dla całej metody wykrywania ROS podczas montażu: Rozpuścić ogólny roztwór podstawowy sondy wrażliwej na ROS (ustabilizowany w DMSO) w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-5 μM). Unikaj ekspozycji na światło i tlen. Chroń rurkę przed światłem. Przygotuj ten roztwór przed użyciem. Nie przechowuj ani nie używaj ponownie tego roztworu. UWAGA: Z sondami molekularnymi należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.
  7. Przygotować 25 ml roztworu zatrzymującego, dodając 10 ml płodowej surowicy bydlęcej do 15 ml PBS 1x. Utrzymuj roztwór w sterylnej formie. Przechowywać ten roztwór w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie jest wymagane tylko dla pojedynczej komórki - metoda detekcji ROS.
  8. Ustawić inkubator powietrza danio pręgowanego na temperaturę 28 °C.
  9. Ustawić wirówkę na 4 °C dla metody wykrywania ROM w jednej komórce.

2. Krycie dorosłych ryb i selekcja zarodków danio pręgowanego

  1. Ustaw krzyżówki par dorosłych danio pręgowanego zgodnie ze standardowymi protokołami40. Wybierz odpowiednią linię transgeniczną zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.
  2. Zbierz jaja i umieść je w naczyniu o średnicy 90 mm z wodą rybną/pożywką z zarodków. Jaja należy przechowywać w temperaturze 28 °C, aż zarodki rozwiną się i osiągną pożądany etap rozwoju (np. 48 hpf, 72 hpf; hpf: godziny po zapłodnieniu).
  3. Badanie przesiewowe w kierunku rozwijających się zarodków. Wyklucz wszystkie niezapłodnione jaja lub słabo rozwinięte zarodki.
  4. Znieczulenie zarodków należy dodać 1 ml trikainy (roztwór podstawowy) do 50 ml wody dla ryb.
  5. Wybierz fluorescencyjne zarodki Tg pod mikroskopem stereoskopowym.

3. Leczenie zarodków utleniaczem

  1. Użyj co najmniej 30 zarodków o stężeniu od 48 hpf do 72 hpf na różne warunki. Umyj zarodki dwukrotnie świeżą wodą rybną w celu usunięcia tricainy.
  2. Podziel fluorescencyjne zarodki na trzy naczynia. Umieść nie więcej niż 30 zarodków na naczynie.
  3. Usunąć roztwór myjący i dodać 10 ml roztworu utleniacza lub 10 ml wody dla ryb jako roztwór kontrolny.
  4. Inkubować zarodki przez 10 minut do 1 godziny w temperaturze 28 °C. Okres inkubacji zależy od poziomu stresu oksydacyjnego, który ma być wywołany w określonych tkankach. Krótkie okresy są najlepsze, ponieważ komórki dotknięte stresem oksydacyjnym stopniowo ulegają śmierci komórkowej.
  5. Przenieś zarodki do nowego naczynia zawierającego HBSS i umyj zarodki przez wirowanie. Wstępnie podgrzany HBSS w temperaturze 28 °C.

4. Metoda wykrywania ROS całego montażu

  1. Zbierz zarodki po leczeniu utleniaczem i umieść nie więcej niż 10 zarodków w małej probówce. Spłucz HBSS tak bardzo, jak to możliwe. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
  2. Dodać 1 ml roztworu do wykrywania ROS do każdej probówki.
  3. Inkubować zarodki w ciemności przez 15 minut w temperaturze 28 °C, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  4. W czasie inkubacji należy przygotować szkiełko podstawowe do analizy całego zarodka. Umieść 300 μl metylocelulozy na szkiełku szkiełkowym "wgłębnym" i rozprowadź na powierzchni szkła za pomocą końcówki pipety. Unikaj pęcherzyków podczas uwalniania metylocelulozy.
  5. Pod koniec czasu inkubacji natychmiast usunąć roztwór wykrywający ROS i przemyć dwukrotnie 2 ml HBSS. Umyj zarodki, kilkakrotnie odwracając rurkę. Nie pipetować ani nie wirować.
  6. Odessać zarodki do szklanej pipety Pasteura. Umieść zarodki w pobliżu otworu pipety i delikatnie wyrzuć je do metylocelulozy. Odpowiednio ułóż zarodki za pomocą cienkiej nylonowej linii.
  7. Porównaj fluorescencję zarodków kontrolnych z zarodkami poddanymi działaniu środka. Alternatywnie, należy ustalić parametry stereomikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego tak, aby wszystkie zarodki były obrazowane przy użyciu tych samych ustawień obrazowania.

5. Metoda wykrywania ROM w pojedynczej komórce

  1. Zacznij od kroku: 3.5. Upewnij się, że masz co najmniej 35 zarodków na każdy stan.
  2. Przenieś zarodki do nowego naczynia. Usuń wodę z ryb tak bardzo, jak to możliwe. Dodaj 10 ml lodowatego PBS 1x i 400 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ręcznie odcięć zarodki za pomocą kleszczy i usunąć worek z żółtkiem za pomocą cienkiej igły. Uwaga: Wyjęcie worka z żółtkiem zapewnia czyste próbki do następnej analizy FACS. Tego kroku można uniknąć zgodnie z instrumentem FACS.
  3. Przenieść pozbawione żółtek zarodki do 24-dołkowej płytki wielodołkowej (15 zarodków/dołek) i usunąć całą wodę z ryb.
  4. Dodać 300 μl HBSS, 30 μl kolagenazy P, 50 μl trypsyny-EDTA do każdej studzienki.
  5. Homogenizować zarodki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą ciasnej końcówki pipety (1 000 μl).
  6. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 20 minut i homogenizować próbki, pipetując co 5 minut.
  7. Sprawdzić rozerwanie tkanki, obserwując podwielokrotność homogenatu pod mikroskopem złożonym. Ułatwić zawiesinę pojedynczych komórek poprzez pipetowanie. Nie wysiadywać zarodków dłużej niż 30 minut.
  8. Zatrzymaj reakcję, dodając 200 μl roztworu zatrzymującego. Wymieszać delikatnie pipetując.
  9. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej rurki ze szczelnym dnem. Trzymaj rurkę na lodzie i unikaj ekspozycji na światło.
  10. Wirować przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C.
  11. Usunąć górną fazę i ponownie zawiesić komórki za pomocą lodowatego HBSS, delikatnie pipetując.
  12. Policz komórki i upewnij się, że we wszystkich próbkach jest taka sama liczba komórek. Nie używaj mniej niż 2 x 106 komórek.
  13. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.
  14. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 1 ml lodowato schłodzonego HBSS zawierającego sondę czułą na ROS.
  15. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w ciemności. Zmieniaj czas inkubacji w zależności od poziomu stresu oksydacyjnego i czułości sondy.
  16. Przenieś komórki do probówki FACS. Utrzymuj probówki na lodzie i unikaj ekspozycji na światło przed analizą FACS.
  17. Sortuj komórki za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Ustaw długości fal zgodnie z fluorescencją tkanek Tg (np. GFP) i widmami wzbudzenia/emisji sondy molekularnej używanej do wykrywania ROS (np. specyficzne mitochondrialne sondy wrażliwe na ROS, ogólne sondy wrażliwe na ROS).
  18. Dla każdego warunku zmierz wszystkie próbki w tej samej sesji eksperymentalnej, stosując te same ustawienia FACS. Obliczyć procent komórek fluorescencyjnych jako średnią różnych kontrprób biologicznych. Przeanalizuj co najmniej dwie repliki dla każdego warunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisaną tutaj metodę, możemy łatwo zmierzyć i wykryć stres oksydacyjny (oraz poziom ROS) w tkankach embrionalnych danio pręgowanego. Po skrzyżowaniu dorosłych osobników danio pręgowanego, zbiera się ikrę i pozwala jej rozwijać się w temperaturze 28 °C do 72 hr hpf (godzin po zapłodnieniu). W celu indukcji stresu oksydacyjnego proponujemy dwa różne podejścia: 1) traktowanie embrionów silnymi odczynnikami prooksydacyjnymi lub 2) stymulowanie powstawania ROS po uszkodzeniu tkanek.

W pier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne

Opisana tu procedura wykrywania stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego obejmuje dwie różne metody. Cała metoda wykrywania ROS jest głównie testem jakościowym do wykrywania ROS, podczas gdy metoda wykrywania ROS w pojedynczej komórce pozwala na bardziej szczegółowe pomiary ilościowe (rysunek 1). Obie metody oferują szybki i łatwy sposób oceny wykrywania ROS in vivo na zarodkach danio pręgowanego. Jednak oba przedstawiają pewne krytyczne kroki....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie w laboratorium Massimo Santoro pochodzi od HFSP, Marie Curie Action, Telethon i AIRC. Dziękujemy Dafne Gays i Emiliano Panieri za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór nadtlenku wodoruSIGMA516813NIE PRZECHOWYWAĆ ROZCIEŃCZEŃ
Zbilansowany roztwór soli Hanka 1xGIBCO14025
MetylocelulozaSIGMAM0387
Błyskawiczna mieszanina soli morskiej do akwarium oceanicznegoINSTANT OCEANSS15-10
TrikainaSIGMAA5040
Ogólna sonda wrażliwa na ROS: Odczynnik CellROX Deep RedINVITROGENC10422
Sonda wrażliwa na ROS specyficzna dla mitochondriów: MitoSOX INVITROGENM36008rozpuścić jedną fiolkę z 13 μ l DMSO
HydroethidineINVITROGEND23107
RotenonSIGMAR8875Przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO. 
Sulfotlenek dimetyluSIGMAD2650
VAS2870; 3-benzylo-7-(2-benzoksazolylo)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirymidynaEnzoLifeScienceBML-EI395rozpuścić proszek w DMSO; rozcieńczyć w wodzie dla ryb
Jodek propidyny Sondy molekularne
(Life Technologies)		P3566
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD) Sondy molekularne
(Life Technologies)		A1310
Nrf2a MorpholinoGeneTools5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'Ref		: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Kolagenaza PROCHE11213857001Rozpuścić proszek w stężeniu 100 mg/ml w sterylnym HBSS. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)GIBCO10010-056
Surowica bydlęca płodu GIBCO10082-147
Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazyROCHERozpuść jedną tabletkę w 1 ml wody
0,5% Trypsyna-EDTA (10x), bez czerwieni fenolowejGIBCO15400-054Przygotuj 1x roztwór roboczy przed użyciem
Mikroskop złożony ZEISS
z oświetleniem fluorescencyjnymAparat fotograficzny NikonAZ100
ZEISSAxioCamMRm
do akwizycji obrazów fluorescencyjnychZEISSZEN 2011
Aktywowany fluorescencją sortownik komórekBD FACSCalibur
Wirówka Rury Eppendorf5417R
FACS Płytka342065
 BD Falcon353047
Sterylizowane, nieobrobione szalki Petriego 90 mmVWR391-1915
Mikroskop konfokalnyLeicaLeica SP5
Mikroskop stereoskopowy Oprogramowanie wielodołkowa BD

Bibliografia

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie ROSmetoda ca ego preparatumetoda pojedynczych kom rekmikroskopia konfokalnacytometria przep ywowasondy fluorescencyjnedysocjacja tkanekprzesiewy genetyczne
Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.