Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Stres oksydacyjny jest konkretnie zdefiniowany jako stan, który wynika z niezrównoważonego komórkowego stanu redoks. Złożone reakcje redoks, które rutynowo zachodzą wewnątrz komórek, określają komórkowy stan redoks. Reakcje redoks obejmują wszystkie reakcje chemiczne, które polegają na przenoszeniu elektronów między atomami cząsteczek biologicznych, powodując redukcję i utlenianie cząsteczek (tj. reakcje redoks). Reakcje te są katalizowane przez formy aktywowane elektronicznie (tj. formy prooksydacyjne), które charakteryzują się skrajną niestabilnością strukturalną i spontaniczną aktywacją niezrównoważonych elektronów, które wymieniają się z sąsiednimi biomolekułami. Te nieregularne reakcje prowadzą do uszkodzenia DNA, karboksylacji białek i utleniania lipidów, a ostatecznie prowadzą do śmierci komórki¹. Zwiększony poziom stresu oksydacyjnego jest związany ze starzeniem się i postępem różnych stanów patologicznych². Doniesiono, że stres oksydacyjny jest odpowiedzialny za zmiany naczyniowe w cukrzycy i chorobach sercowo-naczyniowych^3,4. Odgrywa również kluczową rolę w zwyrodnieniu neuronów w chorobie Alzheimera i chorobie Parkinsona⁵. Ponadto wykazano, że stres oksydacyjny jest kluczowym czynnikiem regulującym progresję raka i przerzuty^6,7. Ponadto stan zapalny i reakcje immunologiczne mogą wywoływać i dodatkowo wspierać stres oksydacyjny⁸.

W żywych komórkach prooksydacyjne formy pochodzą z tlenu (ROS; reaktywne formy tlenu) lub azotu (RNS; reaktywne formy azotu). ROS obejmują rodnik hydroksylowy (^.OH), anion ponadtlenkowy (_O2^-) i nadtlenek wodoru (_H2O2). Podstawowym RNS jest podtlenek azotu (NO). Szereg wtórnych form reaktywnych może być generowany przez spontaniczne interakcje między ROS i RNS lub jonami wolnych metali⁹. Na przykład anion ponadtlenkowy reaguje z podtlenkiem azotu, tworząc nadtlenoazotan (^ONOO-), podczas gdy_H2O2 reagując z Fe²⁺ generuje rodniki hydroksylowe. ROS i RNS, ze względu na swoją zdolność do reagowania z kilkoma biomolekułami, są uważane za niebezpieczne zagrożenie dla utrzymania fizjologicznego stanu redoks¹⁰. Aby utrzymać stan redoks, komórki są wyposażone w szereg detoksykujących cząsteczek przeciwutleniających i enzymów. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza, peroksydaza glutationowa i peroksyredoksyny zasadniczo stanowią przeciwutleniacz enzymatyczny, który zapewnia ochronę komórkową przed formami prooksydacyjnymi, w tym_H2O2, . OH i OONO^{- 11}. Również cząsteczki przeciwutleniające, takie jak witamina C i E, polifenole i koenzym Q10 (CoQ10) mają kluczowe znaczenie dla wygaszania ROS i ich niebezpiecznych pochodnych^12,13. Jednak nadmierna produkcja ROS i RNS lub dysfunkcja systemu przeciwutleniającego przesuwa komórkowy stan redoks w kierunku stresu oksydacyjnego¹⁴.

Oprócz negatywnych konotacji, ROS mogą odgrywać różne fizjologiczne role w komórkach różnego pochodzenia. Komórki normalnie wytwarzają ROS jako cząsteczki sygnałowe, które pośredniczą w normalnych zdarzeniach biologicznych, takich jak obrona gospodarza i gojenie ran^15-17. Formy reaktywne są zwykle wytwarzane w komórkach przez enzymy wewnątrzkomórkowe, takie jak NOX (oksydaza NADPH) i XO (oksydaza ksantynowa) w odpowiedzi na czynniki sygnałowe, czynniki wzrostu i wewnątrzkomórkowe wahania poziomu wapnia^18,19. Doniesiono, że ROS może w różny sposób modulować aktywność ważnych czynników jądrowych, takich jak p53 lub składników komórkowych, takich jak kinaza ATM, główny regulator odpowiedzi na uszkodzenie DNA²⁰. Analogicznie ROS silnie wpływają na sygnalizację komórkową, pośrednicząc w utlenianiu i inaktywacji białkowych fosfataz tyrozynowych (PTP), które są ustalane jako krytyczne regulatory transdukcji sygnału²¹. Co więcej, metodologie oparte na proteomice pokazują, że RNS są również odpowiedzialne za specyficzne modyfikacje białek i zmiany sygnalizacji molekularnej. RNS reagują z grupami cysteinowo-tiolowymi, modyfikując je w S-nitrotiole (SNO) i uruchamiając szlaki molekularne współistniejące ze stanami patologicznymi, takimi jak choroby zapalne i autoimmunologiczne^22,23.

Ponieważ eksperymenty z hodowlą komórkową tylko częściowo odtwarzają mnogość czynników działających in vivo, bardzo interesujące jest przeprowadzenie badań redoks na modelach zwierzęcych^24,25. Aby to osiągnąć, danio pręgowany został uznany za odpowiedni model zwierzęcy kręgowców do badania dynamiki stresu oksydacyjnego²⁶. Danio pręgowany to nowy system modelowy, który daje kilka korzyści w badaniu zdarzeń komórkowych i genetycznych podczas rozwoju i choroby kręgowców. Duże skupiska zarodków mogą być generowane i dostępne co tydzień do celów eksperymentalnych. Co więcej, niezwykła przejrzystość optyczna zarodków danio pręgowanego, a także ich niewielkie rozmiary, umożliwiają obrazowanie pojedynczych komórek i dynamiczne śledzenie w całych organizmach²⁷. W ciągu ostatniej dekady wygenerowano znaczną liczbę mutantów danio pręgowanego w celu modelowania stanów patologicznych człowieka, takich jak rak i choroby genetyczne^28-31. Co najważniejsze, wyprodukowano wiele linii transgenicznych, które dają szerokie możliwości manipulacji genetycznych i biologicznych³². Na przykład transgeniczne linie danio pręgowanego specyficzne dla tkanek są regularnie wykorzystywane do badań in vivo. Linie te wyrażają białko fluorescencyjne pod kontrolą wybranego promotora, oferując możliwość identyfikacji pojedynczych komórek in vivo, a także budowy anatomicznej, z której się składają.

Kilka badań toksykologicznych już wykorzystało danio pręgowanego do oceny wpływu in vivo substancji chemicznych na homeostazę redoks, sugerując przydatność tego kręgowca jako modelu zwierzęcego dla dziedziny odkrywania leków i stresu oksydacyjnego^33-35. Mimo że niektóre sondy fluorescencyjne zostały przetestowane w celu monitorowania stresu oksydacyjnego u larw danio pręgowanego^36,37, nie ma ustalonych testów do wykrywania i mierzenia poziomu stresu oksydacyjnego w tkankach danio pręgowanego i żywych komórkach. W tym artykule opisano procedurę ilościowego oznaczania in vivo stresu oksydacyjnego w żywych komórkach zarodków danio pręgowanego. Narzędzia do obrazowania, sortowanie FACS, sondy fluorescencyjne i warunki prooksydacyjne zostały połączone w celu stworzenia prostego testu do wykrywania i ilościowego oznaczania gatunków utleniających w zarodkach i tkankach danio pręgowanego.

1. Przygotowanie instrumentów i roztworów roboczych

1. Przygotuj roztwór wodny dla ryb. Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 2 g soli morskiej "Instant Ocean" w 50 ml wody destylowanej. Dodać 1,5 ml bulionu rybnego do 1 l wody destylowanej, aby przygotować gotową do użycia wodę dla ryb (końcowe stężenie 60 μg/ml soli morskich). Autoklaw gotowej do użycia wody dla ryb przed użyciem. Roztwór ten jest stosowany jako pożywka dla zarodków danio pręgowanego.
2. Przygotować metylocelulozę do montażu zarodka. Rozpuścić 1,5 g metylocelulozy w 50 ml sterylnej wody dla ryb. Ułatw rozpuszczanie za pomocą magnesu umieszczonego na płytce mieszającej. Całkowite rozpuszczenie proszku może zająć kilka godzin. Sprawdzić klarowność roztworu i podzielić go na małe probówki. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy i rozmrozić porcje po użyciu. Odwirować metylocelulozę przy 950 x g przez 5 minut przed użyciem. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania podwielokrotności.
3. Przygotować 50 ml soli metanosulfonianu trikainy/3-aminobenzoesanu etylu (roztwór podstawowy), rozpuszczając 200 mg tricainy w 100 ml wody i dostosować pH do 7,0 za pomocą Tris-HCl 1 M (pH 9). Przechowywać ten bulion w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 30 dni. UWAGA: trikaina jest toksyczna. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
4. Wywoływanie stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego
   1. Przygotować roztwór utleniacza do ogólnej indukcji stresu oksydacyjnego: Przygotować 50 ml roztworu utleniacza, dodając roztwór podstawowy_H2O2(nadtlenek wodoru; 100 mM) do wody dla ryb. Użyć_H2O2o końcowym stężeniu od 2 mM do 100 μM. Przygotować ten roztwór na krótko przed użyciem. Roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROS w całej instalacji, jak i do wykrywania ROS w pojedynczych komórkach. Nie przechowuj tego roztworu. UWAGA:_H2O2jest niebezpieczny i szkodliwy przez drogi oddechowe i po połknięciu. Kontakt z materiałem palnym może spowodować pożar. Przechowywać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
   2. Przygotować roztwór utleniacza do indukcji stresu oksydacyjnego pochodzącego z mitochondriów: Przygotować roztwór podstawowy utleniacza (5 mM), rozpuszczając 3,9 mg rotenonu w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać ten roztwór w temperaturze pokojowej w ciemności.
      1. Rozpuścić roztwór podstawowy rotenonu w 10 ml wody dla ryb, aby uzyskać roztwór gotowy do użycia. Stosować rotenon w stężeniu od 5 do 50 μM. Nie należy stosować rotenonu w stężeniach wyższych niż 100 μM. W odpowiednich stężeniach ten roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROM w całej instalacji, jak i do wykrywania ROM w pojedynczych komórkach. UWAGA: Rotenon jest toksyczny i niebezpieczny. Postępuj zgodnie z odpowiednimi zwrotami środków ostrożności.
   3. Indukuj stres oksydacyjny przez knock-down: Knock-down ekspresja genu nrf2a w zarodkach danio pręgowanego przez mikroiniekcję morfolino, jak wcześniej zgłoszono przez Timme-Laragy A. i in., 2012³⁸.
   4. Indukuj stres oksydacyjny po uszkodzeniu tkanki: wygeneruj brzeg rany na płetwie ogonowej zarodków danio pręgowanego przy 72 hpf, jak wcześniej opisali Niethammer i wsp., 2009³⁹.
5. Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROM do metody wykrywania ROM w pojedynczych komórkach:
   1. Rozwiązanie do ogólnego wykrywania ROS: Rozpuść generyczną sondę molekularną wrażliwą na ROS w HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa) w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM). Roztwór ten należy przygotować na krótko przed użyciem.
   2. Rozwiązanie do specyficznego wykrywania ROS indukowanego przez mitochondria: Na krótko przed użyciem rozpuść mitochondrialną sondę wrażliwą na ROM za pomocą DMSO, tworząc roztwór podstawowy o stężeniu 5 mM. Rozpuścić roztwór podstawowy w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM).
      UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło i tlen roztworów roboczych do wykrywania ROS i ich odpowiednich roztworów podstawowych. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Nie przechowywać ani nie używać ponownie sond rozpuszczonych w HBSS. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze -20 °C przez miesiąc.
      UWAGA: Z sondami molekularnymi i DMSO należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.
6. Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROS dla całej metody wykrywania ROS podczas montażu: Rozpuścić ogólny roztwór podstawowy sondy wrażliwej na ROS (ustabilizowany w DMSO) w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-5 μM). Unikaj ekspozycji na światło i tlen. Chroń rurkę przed światłem. Przygotuj ten roztwór przed użyciem. Nie przechowuj ani nie używaj ponownie tego roztworu. UWAGA: Z sondami molekularnymi należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.
7. Przygotować 25 ml roztworu zatrzymującego, dodając 10 ml płodowej surowicy bydlęcej do 15 ml PBS 1x. Utrzymuj roztwór w sterylnej formie. Przechowywać ten roztwór w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie jest wymagane tylko dla pojedynczej komórki - metoda detekcji ROS.
8. Ustawić inkubator powietrza danio pręgowanego na temperaturę 28 °C.
9. Ustawić wirówkę na 4 °C dla metody wykrywania ROM w jednej komórce.

2. Krycie dorosłych ryb i selekcja zarodków danio pręgowanego

1. Ustaw krzyżówki par dorosłych danio pręgowanego zgodnie ze standardowymi protokołami⁴⁰. Wybierz odpowiednią linię transgeniczną zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.
2. Zbierz jaja i umieść je w naczyniu o średnicy 90 mm z wodą rybną/pożywką z zarodków. Jaja należy przechowywać w temperaturze 28 °C, aż zarodki rozwiną się i osiągną pożądany etap rozwoju (np. 48 hpf, 72 hpf; hpf: godziny po zapłodnieniu).
3. Badanie przesiewowe w kierunku rozwijających się zarodków. Wyklucz wszystkie niezapłodnione jaja lub słabo rozwinięte zarodki.
4. Znieczulenie zarodków należy dodać 1 ml trikainy (roztwór podstawowy) do 50 ml wody dla ryb.
5. Wybierz fluorescencyjne zarodki Tg pod mikroskopem stereoskopowym.

3. Leczenie zarodków utleniaczem

1. Użyj co najmniej 30 zarodków o stężeniu od 48 hpf do 72 hpf na różne warunki. Umyj zarodki dwukrotnie świeżą wodą rybną w celu usunięcia tricainy.
2. Podziel fluorescencyjne zarodki na trzy naczynia. Umieść nie więcej niż 30 zarodków na naczynie.
3. Usunąć roztwór myjący i dodać 10 ml roztworu utleniacza lub 10 ml wody dla ryb jako roztwór kontrolny.
4. Inkubować zarodki przez 10 minut do 1 godziny w temperaturze 28 °C. Okres inkubacji zależy od poziomu stresu oksydacyjnego, który ma być wywołany w określonych tkankach. Krótkie okresy są najlepsze, ponieważ komórki dotknięte stresem oksydacyjnym stopniowo ulegają śmierci komórkowej.
5. Przenieś zarodki do nowego naczynia zawierającego HBSS i umyj zarodki przez wirowanie. Wstępnie podgrzany HBSS w temperaturze 28 °C.

4. Metoda wykrywania ROS całego montażu

1. Zbierz zarodki po leczeniu utleniaczem i umieść nie więcej niż 10 zarodków w małej probówce. Spłucz HBSS tak bardzo, jak to możliwe. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
2. Dodać 1 ml roztworu do wykrywania ROS do każdej probówki.
3. Inkubować zarodki w ciemności przez 15 minut w temperaturze 28 °C, aby uniknąć ekspozycji na światło.
4. W czasie inkubacji należy przygotować szkiełko podstawowe do analizy całego zarodka. Umieść 300 μl metylocelulozy na szkiełku szkiełkowym "wgłębnym" i rozprowadź na powierzchni szkła za pomocą końcówki pipety. Unikaj pęcherzyków podczas uwalniania metylocelulozy.
5. Pod koniec czasu inkubacji natychmiast usunąć roztwór wykrywający ROS i przemyć dwukrotnie 2 ml HBSS. Umyj zarodki, kilkakrotnie odwracając rurkę. Nie pipetować ani nie wirować.
6. Odessać zarodki do szklanej pipety Pasteura. Umieść zarodki w pobliżu otworu pipety i delikatnie wyrzuć je do metylocelulozy. Odpowiednio ułóż zarodki za pomocą cienkiej nylonowej linii.
7. Porównaj fluorescencję zarodków kontrolnych z zarodkami poddanymi działaniu środka. Alternatywnie, należy ustalić parametry stereomikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego tak, aby wszystkie zarodki były obrazowane przy użyciu tych samych ustawień obrazowania.

5. Metoda wykrywania ROM w pojedynczej komórce

1. Zacznij od kroku: 3.5. Upewnij się, że masz co najmniej 35 zarodków na każdy stan.
2. Przenieś zarodki do nowego naczynia. Usuń wodę z ryb tak bardzo, jak to możliwe. Dodaj 10 ml lodowatego PBS 1x i 400 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ręcznie odcięć zarodki za pomocą kleszczy i usunąć worek z żółtkiem za pomocą cienkiej igły. Uwaga: Wyjęcie worka z żółtkiem zapewnia czyste próbki do następnej analizy FACS. Tego kroku można uniknąć zgodnie z instrumentem FACS.
3. Przenieść pozbawione żółtek zarodki do 24-dołkowej płytki wielodołkowej (15 zarodków/dołek) i usunąć całą wodę z ryb.
4. Dodać 300 μl HBSS, 30 μl kolagenazy P, 50 μl trypsyny-EDTA do każdej studzienki.
5. Homogenizować zarodki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą ciasnej końcówki pipety (1 000 μl).
6. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 20 minut i homogenizować próbki, pipetując co 5 minut.
7. Sprawdzić rozerwanie tkanki, obserwując podwielokrotność homogenatu pod mikroskopem złożonym. Ułatwić zawiesinę pojedynczych komórek poprzez pipetowanie. Nie wysiadywać zarodków dłużej niż 30 minut.
8. Zatrzymaj reakcję, dodając 200 μl roztworu zatrzymującego. Wymieszać delikatnie pipetując.
9. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej rurki ze szczelnym dnem. Trzymaj rurkę na lodzie i unikaj ekspozycji na światło.
10. Wirować przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C.
11. Usunąć górną fazę i ponownie zawiesić komórki za pomocą lodowatego HBSS, delikatnie pipetując.
12. Policz komórki i upewnij się, że we wszystkich próbkach jest taka sama liczba komórek. Nie używaj mniej niż 2 x 10⁶ komórek.
13. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.
14. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 1 ml lodowato schłodzonego HBSS zawierającego sondę czułą na ROS.
15. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w ciemności. Zmieniaj czas inkubacji w zależności od poziomu stresu oksydacyjnego i czułości sondy.
16. Przenieś komórki do probówki FACS. Utrzymuj probówki na lodzie i unikaj ekspozycji na światło przed analizą FACS.
17. Sortuj komórki za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Ustaw długości fal zgodnie z fluorescencją tkanek Tg (np. GFP) i widmami wzbudzenia/emisji sondy molekularnej używanej do wykrywania ROS (np. specyficzne mitochondrialne sondy wrażliwe na ROS, ogólne sondy wrażliwe na ROS).
18. Dla każdego warunku zmierz wszystkie próbki w tej samej sesji eksperymentalnej, stosując te same ustawienia FACS. Obliczyć procent komórek fluorescencyjnych jako średnią różnych kontrprób biologicznych. Przeanalizuj co najmniej dwie repliki dla każdego warunku.

Stosując opisaną tutaj metodę, możemy łatwo zmierzyć i wykryć stres oksydacyjny (i poziomy ROS) w tkankach embrionalnych danio pręgowanego. Po skrzyżowaniu z dorosłymi rybami danio pręgowanego zbiera się jaja i pozostawia do rozwoju w temperaturze od 28 °C do 72 godzin po zapłodnieniu (hpf). W celu wywołania stresu oksydacyjnego proponujemy dwa różne podejścia: 1) leczenie zarodków silnymi odczynnikami prooksydacyjnymi lub 2) promowanie tworzenia ROS po uszkodzeniu tkanki.

W pierwszym podejściu użyliśmy dwóch różnych odczynników w zależności od konkretnych potrzeb: nadtlenku wodoru (H2O2), jako ogólnego komórkowego czynnika tworzącego ROS, oraz rotenonu, jako specyficznego mitochondrialnego sterownika ROS. Rotenon jest inhibitorem kompleksu I ETC, którego deregulacja jest przyczyną stresu oksydacyjnego41.

W drugim podejściu, wywołaliśmy akumulację ROS poprzez stworzenie rany na płetwie ogonowej zarodka danio pręgowanego39. Alternatywnie, warunki stresu oksydacyjnego mogą być promowane w tkankach danio pręgowanego poprzez osłabienie za pomocą wstrzyknięcia morfolino szlaku odpowiedzi przeciwutleniającej Nrf2, który jest podstawową obroną komórkową przed cytotoksycznymi skutkami stresu oksydacyjnego38.

Gdy stres oksydacyjny zostanie wywołany w zarodkach danio pręgowanego, akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) może być mierzona za pomocą ogólnych lub specyficznych dla mitochondriów sond wrażliwych na ROS, które stają się fluorescencyjne po aktywacji (tj. utlenieniu).

Leczone zarodki mogą być analizowane za pomocą metody wykrywania ROS za pomocą całego montażu lub za pomocą metody wykrywania ROS za pomocą pojedynczej komórki, jak podsumowano na rysunku 1. Wybór pomiędzy metodami opiera się na konieczności wykonania jakościowego lub ilościowego pomiaru stresu oksydacyjnego. Reprezentatywne wyniki obu metod przedstawiono na rysunkach 2 i 3.

Cała metoda wykrywania ROS

Rysunek 2 pokazuje zastosowanie metody wykrywania ROS metodą całego montażu do obrazowania in vivo stresu oksydacyjnego. W szczególności metoda ta została zastosowana do śledzenia zarówno "silnego" stresu oksydacyjnego generowanego przez egzogenne zabiegi prooksydacyjne, jak i "niskiego" stresu oksydacyjnego generowanego przez bardziej fizjologiczne warunki, takie jak urazy ran lub delecja genów.

Fizjologiczne poziomy gatunków utleniających są indukowane przez generowanie mikro urazu lub szerokiej rany na płetwie ogonowej żywego zarodka danio pręgowanego przy 72 hpf. Wykazano, że po urazieH2O2gromadzi się na brzegu rany 20 min po ranie 39 . Aby uwidocznić akumulację stresu oksydacyjnego na brzegu rany, zarodki inkubowano za pomocą generycznej sondy czułej na ROM i obrazowano po 20 minutach od zranienia39. Porównując nienaruszone płetwy ogonowe z uszkodzonymi ogonami, można odróżnić nagromadzenie sondy fluorescencyjnej na brzegu rany (ryc. 2A). Niespecyficzny słaby sygnał fluorescencyjny jest wykrywany wokół tkanki płetwy ogonowej w obu warunkach.

Aby potwierdzić specyficzne nagromadzenie sondy wrażliwej na ROS na brzegu rany, poziomy H2O2 na ranie zostały obniżone za pomocą podejścia farmakologicznego. Ponieważ wykazano, że akumulacjaH2O2na brzegu rany jest niezwykle wrażliwa na inhibitor DUOX VAS287039, zarodki przed zranieniem poddano wstępnej terapii tym inhibitorem. Porównanie fluorescencji sondy wrażliwej na ROS, pochodzących z zarodków poddanych wstępnej terapii VAS i odpowiednich kontroli, wskazuje, że sygnał jest zależny od akumulacji ROS (tj. H2O2) (Figura 2B).

Ponadto, uzyskaliśmy wysoki poziom utleniających gatunków w tkankach danio pręgowanego, traktując zarodki danio pręgowanego rotenonem. Zarodki i grupy kontrolne poddane działaniu rotenonu inkubowano za pomocą generycznej sondy wrażliwej na ROS w celu specyficznego wykrycia gatunków ROS. Następnie sonda została wypłukana, a zarodki zobrazowano pod mikroskopem fluorescencyjno-stereoskopowym. Stres oksydacyjny wykryto w całym ciele zarodków (ryc. 2C). Obrazy w dużym powiększeniu pokazują obszary anatomiczne, w których sonda jest pomyślnie metabolizowana (ryc. 2D). Obrazy jasnego pola (górne panele) rozróżniają struktury anatomiczne, podczas gdy obrazy fluorescencyjne (dolne panele) wskazują na komórki ROS-dodatnie. Jak pokazują obrazy fluorescencyjne, wyniki są głównie jakościowym raportem wykrywania stresu oksydacyjnego, co osiąga się poprzez porównanie kontroli z leczonymi zarodkami.

Metoda wykrywania ROS z pojedynczą komórką

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wykresy FACS i kwantyfikację stresu oksydacyjnego poprzez zastosowanie metody wykrywania ROS pojedynczej komórki. Metoda ta została dostosowana do pomiaru poziomu stresu oksydacyjnego w komórkach danio pręgowanego, które zostały poddane warunkom prooksydacyjnym, jak opisano w protokole i szczegółowo opisano w legendach rycin. Jak opisano, stres oksydacyjny mierzono poprzez inkubację tkanek danio pręgowanego zdysocjowanych na pojedyncze komórki za pomocą sondy molekularnej czułej na ROS. Ponieważ procedura dysocjacji i sam FACS mogą powodować uszkodzenie komórek, analiza próbek wymaga, aby do oceny ilościowej stresu oksydacyjnego brane były pod uwagę tylko "żywe komórki". W związku z tym zdysocjowane komórki są analizowane poprzez wybór frakcji komórek wykazujących parametry fizyczne "żywej komórki" (Rysunek 3A) i wykluczenie martwych komórek (Rysunek 3B). W związku z tym próbki są oznaczane ilościowo pod kątem poziomów stresu oksydacyjnego zgodnie z fluorescencją sondy wrażliwej na ROS oraz w celu wykazania endogennej fluorescencji, takiej jak dodatnia dla GFP (Figura 3C). Należy dołączyć ujemną próbkę kontrolną dla sondy wrażliwej na ROS w celu oceny stresu oksydacyjnego wywołanego procedurami obchodzenia się i procedurami technicznymi (rysunek 3C; panel: Kontrola -). Względna kwantyfikacja wykresu FACS pokazana na histogramach przedstawiających pomiary różnych kontrprób biologicznych (ryc. 3D-E).

Oprócz ilościowego określania poziomu stresu oksydacyjnego po leczeniu nadtlenkiem wodoru, ta metoda została zastosowana do ilościowego określania poziomu stresu oksydacyjnego w warunkach fizjologicznych, takich jak morfanty nrf2a i odpowiednie kontrole (Rysunek 3F).

Ponadto, łącząc metodę wykrywania ROS pojedynczej komórki ze specyficznymi sondami wrażliwymi na ROS, takimi jak mitochondrialne sondy wrażliwe na ROS, możliwe jest również mierzenie stresu oksydacyjnego w kontekście specyficznych terapii prooksydacyjnych ukierunkowanych na mitochondria (Rysunek 3G).

Rysunek 1. Schematyczny rysunek metody pomiaru poziomów ROS w zarodkach danio pręgowanego. Dorosłe osobniki danio pręgowanego krzyżuje się w odpowiednich zbiornikach hodowlanych. Zapłodnione jaja są następnie zbierane do szalek i przechowywane w temperaturze 28 °C, aby umożliwić zarodkowi pełny rozwój. Indukcja stresu oksydacyjnego może być osiągnięta na różne sposoby, albo przez leczenie farmakologiczne, albo przez genetyczne lub fizyczne zniewagi. Alternatywnie, w przypadku analizy mutanta genetycznego, możliwe jest pominięcie tej inkubacji i przejście do przodu. W tym momencie możliwe jest postępowanie zgodnie z dwiema różnymi metodami. Zgodnie z metodą "wykrywania ROS przez całe mocowanie" (po lewej), zarodki danio pręgowanego są natychmiast inkubowane za pomocą fluorescencyjnej sondy wrażliwej na ROS (1), a następnie analizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego (2). W metodzie "wykrywania ROM przez pojedyncze komórki" (po prawej) zarodki danio pręgowanego są dysocjowane na pojedyncze komórki (1), inkubowane za pomocą fluorescencyjnej sondy wrażliwej na ROS (2) i analizowane przez FACS w celu wykrycia fluorescencji i oceny ilościowej (3). Podczas gdy metoda "wykrywania całego mount-ROS" umożliwia wykrywanie stresu oksydacyjnego u żywych zarodków przede wszystkim jako test jakościowy, metoda "oparta na pojedynczych komórkach" umożliwia zarówno jakościowe, jak i ilościowe pomiary poziomu stresu oksydacyjnego.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki całej metody detekcji ROS podczas montażu. A) Zarodki danio pręgowanego w temperaturze 72 hpf zostały poddane zranieniu, jak wcześniej opisali Niethammer i in., 200939. Reprezentatywne obrazy konfokalne pokazują akumulację gatunków prooksydacyjnych (ROS) (grot strzały) na brzegu rany zranionej płetwy ogonowej. Formy utleniające wykryto za pomocą generycznej sondy ROS (CellROX; 2,5 μM) 20 minut po wykonaniu rany. Podziałka 20 μm. B) Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiające brzeg rany zarodków danio pręgowanego przy 72 hpf. Zarodki były wstępnie traktowane VAS2870 (20 μM) lub DMSO przez 90 minut przed wykonaniem rany. ROS wykryto za pomocą ogólnej sondy czułej na ROS (CellROX; 2,5 μM) 20 minut po nawinięciu. Podziałka 20 μm. C) Obraz całego ciała przedstawiający stres oksydacyjny wywołany rotenonem w zarodkach danio pręgowanego. Stres oksydacyjny jest silnie wykrywany w okolicy ogonowej zarodków, jak pokazano w panelu D). Rotenon jest silnym inhibitorem mitochondrialnego ETC wpływającego głównie na komórki mięśni szkieletowych u danio pręgowanego. Podziałka liniowa, 180 μm.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki metody detekcji ROM pojedynczych komórek. A) Reprezentatywny wykres FACS przedstawiający typową próbkę zarodków danio pręgowanego zdysocjowanych na pojedyncze komórki. Żywe komórki są bramkowane w regionie R1 zgodnie z parametrami FSC-H i SSC-H. SSC-H: 539 (Napięcie), 1.0 (AmpGain), Tryb: liniowy; FSC-H: E00 (napięcie), 2.1 (AmpGain). B) Reprezentatywny wykres FACS przedstawiający typową próbkę zarodków danio pręgowanego zdysocjowanych na pojedyncze komórki. Przed analizą FACS próbkę inkubuje się z jodkiem propidyny (PI; 1 μg/ml) przez 5 minut. Martwe komórki są bramkowane w regionie R2 zgodnie z fluorescencją PI (kanał FL2-H). FSC-H: E00 (napięcie), 2.1 (AmpGain), Tryb: liniowy, SSC-H: 539 (Napięcie), 1.0 (AmpGain), Tryb: liniowy. Kanały napięciowe: FL-2: 613 Log. C) Reprezentatywne wykresy FACS przedstawiające zdysocjowane zarodki drobnego pręgowanego poddane działaniu prooksydantów (H2O2) i odpowiednie kontrole. Komórki śródbłonka są wizualizowane przez kanał GFP. Wykresy FACS reprezentują wszystkie komórki dotknięte stresem oksydacyjnym (ROS) na UL i UR. Komórki ujemne są wykreślane w dolnych kwadrantach (LL i LR). Zarodki danio pręgowanego Tg(Kdrl:GFP)s843 w temperaturze 48hpf inkubowano z H2O2 (2 mM) lub H2O jako kontrolą przez 10 minut. Przed analizą FACS zarodki są przetwarzane zgodnie z opisem w protokole. Komórki dotknięte stresem oksydacyjnym są wykrywane za pomocą generycznej sondy fluorescencyjnej wrażliwej na ROS (CellROX; 2,5 μM). Próbka, która nie była inkubowana za pomocą sondy wrażliwej na ROS, została włączona jako kontrola ujemna. Porównując próbkę poddaną działaniu prooksydantu z odpowiednią kontrolą, liczba komórek wykreślonych w górnych kwadrantach (UL+UR) jest większa. Ustawienia akwizycji FACS były następujące: Kanały napięciowe: FL-1: 582 Log; FL-4: 410 Log. D) Histogram przedstawiający odsetek komórek (UL+UR) dotkniętych stresem oksydacyjnym w zarodkach poddanych działaniuH2O2i odpowiedniej kontroli. Pomiary odnoszą się do próbek pokazanych w C. Komórki dotknięte stresem oksydacyjnym są wykrywane za pomocą generycznej sondy fluorescencyjnej wrażliwej na ROS (CellROX; 2,5 μM). Wyniki są średnią z n=2 różnych kontrprób biologicznych ± SD. E) Histogram przedstawiający odsetek komórek śródbłonka (GFP+) dotkniętych stresem oksydacyjnym (ROS+) w zarodkach traktowanych H2O2 i odpowiedniej kontroli. Pomiary odnoszą się do próbek pokazanych w C. Wyniki są średnią z n=2 różnych kontrprób biologicznych ± SD. F) Histogram przedstawiający odsetek komórek dotkniętych stresem oksydacyjnym (ROS+) w morfantach nrf2a (nrf2a MO) i odpowiednich kontrolach (ctrl MO) przy 24 hpf. Wyniki są średnią z n=2 różnych kontrprób biologicznych ± SD. G) Histogram przedstawiający odsetek komórek dotkniętych mitochondrialnym stresem oksydacyjnym w leczonych zarodkach (rotenon; 10 μM) i odpowiednich kontrolach (Ctrl; DMSO) przy 72 hpf. Po dysocjacji zarodków na pojedyncze komórki, mitochondrialny stres oksydacyjny (mitochondrialny ROS+) mierzono za pomocą specyficznej dla mitochondriów sondy (MitoSOX; 5 μM). Wyniki są średnią z n=3 różnych kontrprób biologicznych ± SD.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.