Artykuł metodologiczny

Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

DOI:

10.3791/51333

⸱

1 maja 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Physics Department, GAP-Biophotonics, University of Geneva, 3Laboratoire d'Optique Biomédicale (LOB), Faculté des Sciences et Techniques de l'Ingénieur, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 4Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity College Dublin, 5School of Medicine and CRANN, Trinity College Dublin, 6Nikon AG Instruments

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym wizualizowanym eksperymencie, szczegóły protokołu są podane do znakowania in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą nanocząstek drugiej harmonicznej generacji (HNP). Te ostatnie to nowa rodzina sond wprowadzonych niedawno do znakowania próbek biologicznych do obrazowania wielofotonowego. HNP są zdolne do podwojenia częstotliwości światła wzbudzenia w nieliniowym procesie optycznym generowania drugiej harmonicznej bez ograniczeń długości fali wzbudzenia.

Metodologie oparte na wielu fotonach do różnicowania hESC w klastry sercowe (utrzymywane jako długoterminowe hodowle powietrzno-płynne) są szczegółowo przedstawione. W szczególności przedstawiono dowody na to, jak zmaksymalizować intensywną emisję drugiej harmonicznej (SH) izolowanych HNP podczas monitorowania 3D bijącej tkanki serca w 3D. Szczegółowa jest również analiza wynikowych obrazów w celu pobrania wzorców przemieszczeń 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy mikroskopii nieliniowej, dzięki swoim nieodłącznym możliwościom trójwymiarowego cięcia, coraz częściej wywołują popyt na fotostabilne fluorofory z dwufotonowymi pasmami absorpcyjnymi w bliskiej podczerwieni. Dopiero w ciągu ostatnich kilku lat, w celu uzupełnienia prac nad znacznikami opartymi na fluorescencji (barwniki, kropki kwantowe, nanocząstki konwertujące w górę), inna metodologia obrazowania wykorzystuje nową rodzinę z natury nieliniowych nanocząstek jako znaczników, tj. nanocząstek harmonicznych (HNP), które zostały opracowane specjalnie do mikroskopii wielofotonowej. Znaczniki te, oparte na nieorganicznych kryształach niecentrosymetrycznych, wywierają kontrast optyczny, generując SH częstotliwości wzbudzenia: na przykład poprzez przekształcenie frakcji pulsacyjnego światła wzbudzenia w bliskiej podczerwieni (λ = 800 nm) na widzialne światło niebieskie (λ/2 = 400 nm). Kilku autorów w niedalekiej przeszłości testowało różne materiały, w tym jodan żelaza Fe(IO3)3 1, niobian potasu (KNbO3)2, niobian litu (LiNbO3)3, tytanian baru (BaTiO3)4,5, fosforan tytanylu potasu (KTiOPO4, KTP)6-8 i tlenek (ZnO)5,9,10. W porównaniu z sondami fluorescencyjnymi, HNP posiadają szereg atrakcyjnych właściwości, takich jak całkowity brak bielenia i mrugania, wąskie pasma emisji, możliwość przestrajania długości fali wzbudzenia (od ultrafioletu do podczerwieni), zdolność odzyskiwania orientacji i spójna odpowiedź optyczna. Te unikalne właściwości zostały niedawno wyjaśnione w dwóch obszernych pracach przeglądowych11,12. Możliwość pracy w zakresie widma podczerwieni, która zwiększa głębię obrazowania poprzez minimalizację rozpraszania i absorpcji, również drastycznie ogranicza fotodegradację próbki13,14. Co więcej, nieskończenie stabilny sygnał gwarantowany przez HNP sprawia, że są to idealne sondy do długoterminowego śledzenia komórek, co jest szczególnie atrakcyjne w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej15.

W tym wizualizowanym eksperymencie, szczegóły protokołu są podane dla znakowania in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą niefunkcjonalizowanych HNP. Synteza i otrzymywanie zawiesin koloidalnych jest szczegółowo opisana w poprzedniej publikacji oraz w piśmiennictwie16 i wykracza poza zakres niniejszej pracy. Przedstawiono metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe (utrzymywane jako długoterminowe kultury powietrzno-cieczowe). Ludzki ESC może różnicować się w obrębie tzw. ciał zarodkowych (EB) na dwa różne sposoby, albo poprzez tworzenie fragmentów kolonii w zawiesinie, albo alternatywnie, wymuszoną agregację pojedynczych komórek w EB za pomocą płytki Aggrewella, jak pokazano na rysunku 1A. Hodowla bijących klastrów komórek serca na porowatych filtrach z politetrafluoroetylenu (PTFE) ułatwia ich długoterminowe utrzymanie do dalszych badań (na przykład elektrofizjologicznych pomiarów potencjałów czynnościowych).

Źródło wzbudzenia mikroskopu skaningowego powinno być w stanie dostarczyć ultrakrótkie impulsy (o czasie trwania impulsu mniejszym niż 300 fsec na próbce) w celu osiągnięcia szczytowej mocy potrzebnej do wykonania obrazowania drugiej harmonicznej HNP. Na przykład najczęstszym źródłem fsec używanym do obrazowania są przestrajalne lasery Ti:Sapphire. Alternatywnie można zastosować inne ultraszybkie lasery, na przykład erbium ion17, chrome forsterite18 lub pompowane Ti:sapphire optyczne oscylatory parametryczne na podczerwień. Mikroskop może być wyposażony w obiektyw o najlepiej dość dużej aperturze numerycznej. Co bardzo ważne, przed pomiarami i za każdym razem, gdy obiektyw jest wymieniany, konieczne jest zminimalizowanie dyspersji występującej w ustawie (soczewkach) poprzez optymalizację ustawień kompresora wstępnego impulsów laserowych przy wybranej długości fali roboczej. Ta procedura, szczegółowo opisana w protokole, zapewnia, że impuls laserowy jest jak najbardziej zbliżony do ograniczonego czasu trwania transformacji (tj. najkrótszy, jak to możliwe) w płaszczyźnie ogniskowej i maksymalizuje nieliniową odpowiedź próbki.

Celem analizy obrazu opisanej na końcu protokołu jest zidentyfikowanie i śledzenie w 3D HNPs ruchów związanych z rytmicznymi skurczami bijących klastrów sercowych. Śledzenie nanocząstek w płaszczyźnie obrazu odbywa się w prosty sposób poprzez identyfikację ich położenia w kolejnych klatkach filmu. Aby uzyskać informacje o ruchu osiowym, konieczna jest wcześniejsza kalibracja nieliniowej odpowiedzi natężenia w funkcji przemieszczenia osiowego. Należy zauważyć, że w przypadku pomiarów długoterminowych wymagana jest aktywna interferometryczna kontrola położenia osiowego próbki w celu utrzymania ważności krzywej kalibracyjnej w obecności dryftów termicznych i/lub mechanicznych.

Użyte tutaj HNP do śledzenia bijących komórek w agregatach są oparte na tlenku niobianu potasu (KNbO3), ale inne dostępne nieliniowe nanomateriały są szczegółowo analizowane w pracy Staedler et al16.

Nieliniowa wydajność optyczna większości dotychczas badanych nanomateriałów jest bardzo porównywalna. Wybór KNbO3 był zasadniczo motywowany dobrą stabilnością roztworu koloidalnego i jego dobrą biokompatybilnością, testowaną na kilku ludzkich liniach komórkowych nawet przy dość wysokim stężeniu i długim czasie ekspozycji16.

Biorąc pod uwagę nowatorstwo nanomateriału użytego do tej pracy, główne cechy HNP w porównaniu do fluorescencyjnych/luminescencyjnych biomarkerów są pokazane w krótkiej oryginalnej animacji komputerowej zrealizowanej przez autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura i ekspansja ludzkiego ESC

  1. Przygotuj pożywkę do rozmnażania komórek (zwaną PM) zawierającą Knockout DMEM uzupełnioną 20% surowicą nokautową, 1% aminokwasami endogennymi MEM, 1% L-glutaminą 200 mM, 1% penicyliną-streptomycyną i 3,5 μl β-merkaptoetanolu.
  2. Rozmrozić ludzki ESC (hESC) w 8 ml pożywki PM i odwirować je przez 5 minut przy 115 x g, aby odrzucić pożywkę do zamrażania uzupełnioną DMSO.
  3. Dodać 1 ml pożywki PM zawierającej 10 mM inhibitora skał, aby zapobiec apoptozie i poprawić przeżywalność komórek po rozmrożeniu (tylko 24-godzinna inkubacja).
  4. Dodać podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) do PM w żądanym stężeniu (4-10 ng / ml) w celu utrzymania pluripotencji.
  5. Umieścić hESC na napromieniowanych ludzkich komórkach żywiących napletek (γHFF) (Figura 1A), uprzednio posianych w stężeniu 2 x 104 komórek/cm2.
  6. Codziennie zmieniaj podłoże i, jeśli to konieczne, usuwaj porcje kolonii, które zaczynają różnicować się przez aspirację, za pomocą wydłużonej, ostro ściętej pipety Pasteura.
  7. Raz w tygodniu pasuj kolonie enzymatycznie:
    1. Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.
    2. Usunąć PBS i inkubować je z 0,5 ml ciepłej kolagenazy dożylnej na dożylną w dawce 1 mg/ml przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Zebrać fragmenty kolonii w 2 ml nowego PM i odwirować przy 115 x g przez 3 min.
  8. Alternatywnie, kolonie mogą być przepasywane mechanicznie przez skrobanie:
    1. Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.
    2. Ręcznie zeskrob kolonie za pomocą narzędzia do skrobaka rolkowego StemPro EZPassage (Rysunek 1B).
    3. Zebrać fragmenty kolonii i odwirować przez 3 minuty przy 115 x g w celu usunięcia supernatantu.
    4. Umieść fragmenty na γHFF lub przetwórz je w celu różnicowania w ciała zarodkowe (EB).

2. Protokół różnicowania ludzkiego ESC

  1. Przygotuj pożywkę różnicującą (DM) za pomocą Knockout DMEM uzupełnionego 2% surowicą Hyclon, 1,0% aminokwasami endogennymi MEM, 1,0% L-glutaminą 200 mM, 1% penicyliną-streptomycyną, 3,5 μl β-merkaptoetanolem.
  2. Usunąć pożywkę i przemyć kolonie 2 ml PBS.
  3. Tworzenie EB fragmentów kolonii w zawiesinie:
    1. Usunąć PBS i inkubować je z 0,5 ml ciepłej kolagenazy dożylnej na dożylną w dawce 1 mg/ml przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Zebrać fragmenty kolonii w 2 ml nowej masy i odwirować przy 115 x g przez 3 min.
    3. Hodować je w zawiesinie na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim nasadce (2 ml na dołek) przez 4 dni (ryc. 1C).
    4. Zebrać i poszczepić nowo uformowane EB na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach (około 3 EB/dołek) (Rysunek 1D).
  4. Alternatywnie, wymuszona agregacja pojedynczych komórek w EB za pomocą płytki Aggrewell:
    1. Usuń PBS i zdysocjuj kolonie na pojedyncze komórki za pomocą akutazy (0,5 ml / dołek).
    2. Odwirować i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,2 x 106/ml.
    3. Dodać 2 ml na komorę Aggrewell przez 1 dzień (Rysunek 1B').
    4. Zebrać nowo uformowane EB (Rysunek 1C') i umieścić je na 0,1% pokrytych żelatyną płytkach 24-dołkowych (około 3 EB/basenik).
    5. Zmieniaj DM co 2-3 dni, aż do pojawienia się bijących skupisk kardiomiocytów (15-30 dni).

3. Powietrzno-cieczowe kultury 3D ubijania klastrów i etykietowania za pomocą HNP

  1. Zidentyfikuj i ręcznie wypreparuj skupiska bijących kardiomiocytów (ryc. 1D), zwykle pojawiające się po 2-4 tygodniach hodowli, używając wydłużonej, ostro ściętej pipety Pasteura.
  2. Umieść 4 filtry PTFE na wkładkę, która zostanie umieszczona na płytce 6-dołkowej (Rysunek 1F).
  3. Dodaj 1 ml pożywki DM na wierzch każdej studzienki.
  4. Dodać po jednym wypreparowanym klastrze dudnienia na każdym filtrze PTFE (rysunek 1E), maksymalnie 4 dołki, tj. 24 agregaty na płytkę (rysunek 1F').
  5. Zmieniaj medium DM co 2-3 dni.
  6. Aby oznaczyć klastry, wyjmij filtr PTFE zawierający duplikat i umieść go na szklanym naczyniu o grubości 3,5 cm (grubość 170 μm).
  7. Dodawać 1 ml HNP o stężeniu 50 μg/ml przez 30 min.

4. Nieliniowe obrazowanie optyczne

  1. Przygotowanie próbki. Po znakowaniu HNP (patrz krok 3.6) przenieść albo całe różnicujące wczesne hEBs, albo klastry bicia serca (wypreparowane po pojawieniu się skurczu) na filtrach PTFE na naczyniu ze szklanym dnem o grubości 170 μm, zgodnym z odległością roboczą obiektywów o dużej aperturze numerycznej. Alternatywnie, nałóż bezpośrednią warstwę ubitych kiścien na naczynie ze szklanym dnem wstępnie pokrytym 0,1% żelatyną.
  2. Przenieś próbki do mikroskopu typu "wszystko w jednym" wyposażonego w komorę inkubacyjną zapewniającą stabilną temperaturę, wilgotność i kontrolę CO2 przez dłuższy czas.
  3. Po wstępnej inspekcji zobrazuj próbkę za pomocą obrazowania szerokokątnego w oświetleniu światłem białym, aby zidentyfikować interesujące struktury w zróżnicowanych EB lub aktywnych klastrach dudnienia, które zostaną wybrane do dalszych badań.
  4. Jeśli autofluorescencja komórek z NADH i SH z HNP musi być jednocześnie uzyskana, należy ustawić krótszą długość fali wzbudzenia laserowego (tj. 720 nm), aby dopasować ją do absorpcji molekularnej. Do wykrycia SH należy użyć jednego filtra spektralnego wąskoprzepustowego wyśrodkowanego na połowie długości fali wzbudzenia (tj. λ = 360 ± 10 nm), a drugiego do wykrywania autofluorescencji.
  5. Najpierw wykonaj szybkie, trójwymiarowe skanowanie o niskiej rozdzielczości, aby odbudować ogólną morfologię klastra sercowego i wybierz płaszczyznę obrazu w objętości klastra z kilkoma widocznymi HNP.
  6. W razie potrzeby należy swobodnie zmieniać długość fali wzbudzenia, aby jak najlepiej dopasować ją do właściwości optycznych próbki lub uniknąć fotowybielania, fotouszkodzeń i obrazowania głębiej w tkankach za pomocą długości fali IR (tj. 790 nm) i odpowiednio wymienić drugi filtr harmonicznych (tj. 395 nm). Zoptymalizuj ustawienia wstępnego kompresora impulsów laserowych przy wybranej długości fali roboczej, maksymalizując sygnał drugiej harmonicznej HNP osadzonych na próbce.
  7. Aby monitorować skurcze klastra sercowego w czasie rzeczywistym, ustaw skaner optyczny mikroskopu w najszybszym trybie, takim jak tryb rezonansowy, co pozwala na szybką akwizycję obrazów dwuwymiarowych.
  8. Wybierz ustawienia, które są najlepszym kompromisem między kontrastem obrazu a szybkością akwizycji, takie jak:
    • Uśrednianie skanów: 4
    • Czas przebywania piksela: 0,1 μsec
    • Szybkość obrazu: 3,75 klatki na sekundę (fps)
  9. Moc lasera jest dostosowywana w zależności od wielkości plamki ogniskowej i prędkości skanowania. 50 mW (mierzona przy wejściu do obiektywu) to typowa wartość dla czasu przebywania piksela 0,1 μs, a obiektyw Plan APO 20X N.A. 0,75 zachowuje żywotność komórek.

5. Analiza obrazu

  1. Procedura kalibracji osiowej. Wybierz pojedynczy HNP osadzony na gołym podłożu. Dostosuj ostrość (tj. pozycję osiową nanocząstki), aby zmaksymalizować intensywność SH. Zmieniać w kontrolowany sposób położenie osiowe stolika mikroskopu, aby uzyskać krzywą kalibracyjną odnoszącą się do intensywności SH w funkcji przesunięcia HNP od płaszczyzny ogniskowej. Dane wyjściowe tej procedury kalibracji dla obiektywu Plan APO 20X N.A. 0,75 przedstawiono na rysunku 4C.
  2. Wybierz HNP obecne we wszystkich klatkach wideo i określ ich okresowe ruchy. Procedurę tę można łatwo zautomatyzować, na przykład za pomocą niestandardowego kodu wyszukującego punkty o maksymalnej intensywności sygnału w zdefiniowanym obszarze zainteresowania i łączącego je między różnymi ramkami (przedstawiono przykładowy kod napisany w Matlabie R2009 b przy użyciu funkcji 'region props' w Image Processing Toolbox).
  3. Ocenić ilościowe przemieszczenia poza płaszczyzną, związane z niemożliwymi do śledzenia HNP poruszającymi się wzdłuż osi optycznej, poprzez przeliczenie ich modulacji intensywności w różnych układach na przemieszczenie osiowe przy użyciu krzywej kalibracyjnej ustalonej w kroku 5.1. Należy pamiętać, że ta procedura umożliwia dostęp do ruchów osiowych, ale nie może być używana do określania kierunku bezwzględnego (w górę lub w dół).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed oceną aktywności dudnienia za pomocą obrazowania konfokalnego, przeprowadzono staranną charakterystykę nieliniowej odpowiedzi optycznej filtrów PTFE, zarówno samodzielnie, jak i w obecności HNP o wysokim stężeniu (1 mg/ml). Zapewniono, że: i) dwufotonowa fluorescencja wzbudzona na gołym substracie jest bardzo słaba i nie może przeszkodzić w pomiarze odpowiednich próbek biologicznych, oraz ii) emisję SH z izolowanych HNP można łatwo uzyskać poprzez obrazowanie przez podłoże w trybie epidetekcji (Rysunek 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie nanotechnologii w badaniach nad komórkami macierzystymi jest stosunkowo nową, ale szybko rozwijającą się dziedziną. Jak wskazano w różnych artykułach przeglądowych na ten temat, zastosowanie nanocząstek może być stosowane do realizacji różnych zadań badawczych, począwszy od śledzenia komórek (zarówno in vitro , jak i in vivo), po wewnątrzkomórkowe dostarczanie białek i genów, w tym tworzenie biomimetycznych środowisk komórkowych do preferencyjnej stymulacji/hamowania określonych szlaków róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za częściowe dofinansowanie z Europejskiego Projektu Badawczego 7PR NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) oraz projektu INTERREG IV Francja-Szwajcaria NAOMI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw Inkubator MikroskopowyOKO LABUNO (górny stopień)37 ° C, 5% CO2, nawilżany
Mikroskop wielofotonowyNikonAR1-MP
Szybkie skanowanie, cztery detektory bez fotopowielacza Filtry
SHG i autofluorescencjiSemrockFF01-360/12-25
FF01-395/11-25 
FF02-485/20-25
Obiektywy mikroskopoweNikon
CFI Plan Fluor 10XNA 0.30, WD 16 mm,
CFI Plan Apo 20XNA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40XNA 1.25, WD 0.18 mm λ S, Inhibitor Rhock powłoki nanokrystalicznej
 SigmaY-27632
Knockout DMEMInvitrogen10829
Serum do nokautu Invitrogen10828
MEM Aminokwasy endogenne Invitrogen1140
L-glutamina 200 mM Invitrogen25030
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15140
β-merkaptoetanol SigmaM7522
Kolagenaza IV Gibco17104-019
Skrobak rolkowy StemPro EZPassage, Instrukcjaobsługi 23181-010
StemPro Accutase System GibcoS11105-01
Aggrewell StemCell Technologies27845
Serum z hydronu Thermo ScientificSH30070.03
Żelatynowepłytki 6-dołkowe SigmaG9391
 Falcon353046
płytki 24-dołkowe Nunclon142475
Filtry z politetrafluoroetylenu (PTFE)MilliporeNA76/25
WkładyMilliporePICM03050

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
  2. Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
  3. Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
  4. Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
  5. Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
  6. Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
  7. Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
  8. Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
  9. Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
  10. Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
  11. Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
  12. Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
  13. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
  14. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  15. Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
  16. Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
  17. Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
  18. Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
  19. Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
  20. Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
  21. Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
  22. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
  23. Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
  24. Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
  25. Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
  26. Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
  27. Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
  28. Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
  29. Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Harmonic NanoparticlesSecond Harmonic GenerationHuman Embryonic Stem CellsCardiac Beating ClustersMulti Photon Microscopy3D Real Time ImagingEmbryoid Body FormationPTFE Filter CultureNonlinear Optical ImagingMATLAB Image Analysis

Powiązane artykuły