Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51340

⸱

23 lipca 2014

 ,  ,  , 
1The School of Plant Sciences, University of Arizona, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, 3The Institute for Sustainable and Renewable Resources, The Institute for Advanced Learning and Research, 4Department of Plant, Soil and Microbial Sciences, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Streszczenie

Aby ułatwić wykorzystanie biomasy lignocelulozowej jako alternatywnego źródła bioenergii, podczas procesów konwersji biologicznej, potrzebny jest etap wstępnej obróbki, aby otworzyć strukturę ściany komórkowej rośliny, zwiększając dostępność węglowodanów w ścianie komórkowej. Wiadomo, że lignina, materiał polifenolowy obecny w wielu typach ścian komórkowych, stanowi istotną przeszkodę w dostępie enzymów. Zmniejszenie zawartości ligniny do poziomu, który nie ingeruje w integralność strukturalną i system obronny rośliny, może być cennym krokiem w kierunku obniżenia kosztów produkcji bioetanolu. W tym badaniu przeprowadziliśmy genetycznie obniżoną regulację jednego z genów związanych z biosyntezą ligniny, reduktazy cynamonowo-CoA (ZmCCR1) za pomocą techniki interferencji dwuniciowego RNA. Konstrukt ZmCCR1_RNAi został zintegrowany z genomem kukurydzy przy użyciu metody bombardowania cząstkami. Transgeniczne rośliny kukurydzy rosły normalnie w porównaniu z roślinami kontrolnymi typu dzikiego, bez ingerencji we wzrost biomasy lub mechanizmy obronne, z wyjątkiem wykazywania brązowego zabarwienia w roślinach transgenicznych, środkowych żebrach, łupinach i łodygach. Analizy mikroskopowe, w połączeniu z testem histologicznym, wykazały, że włókna sklerenchymy liści były cieńsze, ale struktura i rozmiar innych głównych elementów układu naczyniowego nie uległy zmianie. Zawartość ligniny w kukurydzy transgenicznej zmniejszyła się o 7-8,7%, zawartość celulozy krystalicznej wzrosła w odpowiedzi na redukcję ligniny, a hemicelulozy pozostały niezmienione. Analizy mogą wskazywać, że przepływ węgla mógł zostać przesunięty z biosyntezy ligniny na biosyntezę celulozy. W artykule przedstawiono procedury stosowane w celu obniżenia zawartości ligniny w kukurydzy za pomocą technologii RNAi oraz analizy składu ściany komórkowej stosowane do weryfikacji wpływu modyfikacji na strukturę ściany komórkowej.

Wprowadzenie

Produkcja biopaliw z biomasy lignocelulozowej jest wysoce pożądana ze względu na jej obecną obfitość w USA1, a w przypadku zrównoważonego pozyskiwania pozostałości rolniczych i leśnych, zdolność do bezpośredniego konkurowania o grunty uprawne wykorzystywane do produkcji żywności i paszy dla zwierząt. Jednak w przeciwieństwie do ziarna kukurydzy, które jest głównym źródłem biopaliw wytwarzanych obecnie w USA, materiały lignocelulozowe są znacznie bardziej złożone i trudniejsze do rozdrobnienia. Oprócz węglowodanów długołańcuchowych, celulozy i hemicelulozy, które są głównymi źródłami cukrów podczas fermentacji materiałów lignocelulozowych, wiele rodzajów ścian komórkowych roślin zawiera również ligninę, polimer fenylopropanoidowy, który zapewnia wytrzymałość, obronę przed atakiem patogenów i hydrofobowość ścian komórkowych. Chociaż lignina jest niezbędna do wzrostu i przetrwania roślin, stanowi również istotną barierę dla pomyślnej enzymatycznej konwersji celulozy i hemicelulozy do cukrów rozpuszczalnych. Materiały o wysokiej zawartości ligniny są na ogół mniej pożądanymi materiałami zarówno w biopaliwach (poprzez szlaki konwersji biologicznej), jak i w przemyśle celulozowo-papierniczym ze względu na negatywny wpływ na charakterystykę przetwarzania i jakość produktu. W związku z tym manipulacja genetyczna materiałów roślinnych w celu redukcji ligniny na poziomie, który nie koliduje z wytrzymałością strukturalną upraw i systemami obronnymi, może być istotna dla obniżenia kosztów produkcji zarówno biopaliw lignocelulozowych, jak i przemysłu celulozowo-papierniczego.

W kukurydzy (Zea mays) lignina jest kowalencyjnie usieciowana z hemicelulozą w pierwotnej ścianie komórkowej za pośrednictwem mostków ferulanu i dyferulanu2. Kompleks lignina-hemiceluloza wiąże się z mikrofibrylami celulozy poprzez wiązania wodorowe, tworząc złożoną matrycę, która nadaje integralność i wytrzymałość wtórnej ścianie komórkowej. Wytrzymałość mechaniczna ścian komórkowych roślin zależy w dużej mierze od rodzaju podjednostek ligniny3-5. W poprzednich badaniach zmiana proporcji podjednostek ligniny nie wykazała wyraźnego trendu w zakresie strawności enzymatycznej6-11. Jednak zmniejszenie zawartości ligniny na ogół wykazuje poprawę konwersji12,13 i może być kluczem do zwiększenia strawności materiału roślinnego przez enzymy hydrolityczne, w tym endocelulazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy14.

Inżynieria genetyczna regulująca poziom ekspresji transkryptów była szeroko praktykowana w celu poprawy cech upraw. Zaawansowane techniki, w tym technologie anty-sensowne15 i kosupresji16, umożliwiają skuteczną regulację w dół docelowych genów. Całkowity nokaut genów osiągnięto również przy użyciu konstruktów genów kodujących RNA splicowane z intronem o strukturze spinki do włosów17. Co więcej, technika interferencji dwuniciowego RNA (dsRNAi), tj. potężny i skuteczny mediator ekspresji genów, który działa poprzez ukierunkowanie na degradację transkryptu lub represję translacji, zapewnia silny sposób indukowania szerokiego zakresu efektów supresji na docelowe mRNA18. Techniki wyciszania genów wykazują kilka ograniczeń. Techniki te nie regulują precyzyjnie poziomu transkrypcji i mogą powodować nieoczekiwane efekty wyciszania innych genów homologicznych.

W tej metodzie zastosowaliśmy bombardowanie cząstkami, aby przenieść konstrukty dsRNAi do genomu kukurydzy. Do tej pory wiele gatunków roślin zostało z powodzeniem przekształconych za pomocą bombardowania cząstkami, transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, elektroporacji i metod mikroiniekcji. W transformacji genetycznej kukurydzy metoda bombardowania cząstkami jest lepsza od wszystkich innych metod, ponieważ jest najbardziej wydajna. Bombardowanie cząstkami nie jest zależne od bakterii, więc metoda jest wolna od ograniczeń biologicznych, takich jak rozmiar genu, gatunek pochodzenia genu lub genotyp rośliny. Fizyczny system dostarczania transgenów umożliwia wprowadzenie DNA o dużej masie cząsteczkowej i wielu genów do genomów roślinnych, a w niektórych przypadkach do chloroplastów z wysoką wydajnością transformacji19. Zmniejszenie ligniny w układzie naczyniowym środkowego żebra liścia można uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), która jest korzystna dla badania topografii i składu próbek.

U roślin kukurydzy, dwa geny reduktazy cynamonoilo-CoA (ZmCCR1: X98083 i ZmCCR2: Y15069) zostały znalezione w genomie kukurydzy20. Reduktaza cynamonoilo-CoA katalizuje przemianę estrów hydroksycynamoilo-CoA w aldehydy cynamonowe. Wybraliśmy gen ZmCCR1, aby obniżyć poziom tego enzymu, ponieważ gen ulega ekspresji we wszystkich tkankach zdrewniałych. 523 nukleotydy na końcu 3' genu ZmCCR1 zostały wybrane do konstruktu dsRNAi, ponieważ sekwencje wydawały się być bardziej zróżnicowane w porównaniu z sekwencjami ZmCCR2. W ten sposób konstrukt dsRNAi precyzyjnie wiązałby się tylko z ZmCCR1, unikając wyciszenia poza celem21. Konstrukt ZmCCR1_RNAi został zmodyfikowany w cytoplazmatycznym systemie ekspresji ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) zawierającym promotor specyficzny dla tkanek zielonych, oksygenazę karboksylazy rybulozo-1, 5-bisfosforanu (RuBisCO).

Aby zbadać wpływ konstruktu dsRNAi na rośliny transgeniczne, zawartość ligniny została określona ilościowo. Wiadomo, że pomiar ligniny Klason (nierozpuszczalny w kwasach) jest dokładniejszy w porównaniu z metodami oznaczania ilościowego ligniny z kwaśnym detergentem, które rozpuszczają część ligniny22. W związku z tym ligninę Klason zmierzono w transgenicznych łodygach kukurydzy. Procedura ta polega na dwuetapowej hydrolizie kwasowej, która przekształca węglowodany polimerowe w rozpuszczalne monosacharydy23. Zhydrolizowaną biomasę następnie frakcjonowano na materiały rozpuszczalne i nierozpuszczalne w kwasach, a ligninę nierozpuszczalną w kwasach mierzono zgodnie z wcześniejszymi badaniami23,24. Idealnie byłoby, gdyby analiza ligniny obejmowała ekstrakcje wodą i etanolem przed etapem hydrolizy, w celu usunięcia rozpuszczalnych materiałów, które mogą zakłócać wyniki, oraz spalanie pozostałości ligniny po hydrolizie w celu uwzględnienia popiołu obecnego w pozostałości. Bez tych czynności zawartość ligniny w próbce mogłaby być sztucznie zawyżona. Pełna metoda jest przedstawiona tutaj, jednak w przypadku naszych eksperymentów nie byliśmy w stanie wykonać obu tych kroków ze względu na małą objętość materiału dostępnego do testów

Dwa inne składniki ściany komórkowej, celuloza i hemiceluloza, były również analizowane w transgenicznych liniach kukurydzy regulowanych w dół ligniny. Doniesiono, że rośliny transgeniczne, które zostały obniżone w zakresie liazy amoniakalnej fenyloalaniny (PAL)25, ligazy 4-kumaranu:CoA (4CL)26 lub dehydrogenazy alkoholu cynamylowego (CAD)27, wykazują wzrost innych składników strukturalnych ściany komórkowej. Pierwszym krokiem w naszych badaniach było zmierzenie celulozy krystalicznej metodą Updegraffa28. Metoda ta została pierwotnie opracowana do oznaczania celulozy w dużej liczbie bakterii i grzybów celulolitycznych. Krótko mówiąc, zmielone wywary kukurydziane poddano działaniu odczynnika Updegraff (kwas octowy: kwas azotowy: woda) w celu usunięcia hemicelulozy, ligniny i ksylozanów. Krystaliczna celuloza została całkowicie zhydrolizowana do glukozy w procesie hydrolizy Saemana przez dodanieH2SO4. Celulozę krystaliczną oznaczono następnie metodą antronu kolorymetrycznego29. W celu sprawdzenia, czy zawartość hemicelulozy uległa zmianie, ekstrakty monosacharydowe ze zmielonych łodyg hydrolizowano przy użyciu kwasu trifluorooctowego, derywatyzowano metodą octanu aldytolu, a następnie analizowano metodą chromatografii gazowej (GC)30. Szczegółowe procedury analizy zawartości celulozy krystalicznej i składu polisacharydów matrycy opisano w Foster i in. (2010)31.

Tutaj opisujemy procedury stosowane do regulacji ligniny w kukurydzy za pomocą technologii RNAi, transformacji bombardowania cząstkami i analizy ligniny w celu przyspieszonego rozkładu biomasy lignocelulozowej kukurydzy na cukry fermentujące dla biopaliw.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie konstruktów dsRNAi użytych do wyciszenia ekspresji ZmCCR1

  1. Zaprojektować startery specyficzne dla genu, zawierające niezbędne miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych, w celu stworzenia konstruktu dsRNAi do wyciszenia genu ZmCCR1. Zaprojektowano dwa zestawy starterów do amplifikacji dwóch fragmentów cDNA ZmCCR1: fragmentu o długości 523 bp od nukleotydu 748 do 1271 oraz fragmentu o długości 285 bp od nukleotydu 986 do 1271. cDNA ZmCCR1 zostało dostarczone przez Arizona Genome Institute (AGI). Więcej szczegółów przedstawiono na Rysunku 1.
  2. Amplifikować duży fragment metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z matrycy cDNA ZmCCR1, używając starterów ZmCCR1_748F_BglII (5’-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3’) oraz ZmCCR1_1271R_NcoI (5’-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’). Amplifikować mniejszy fragment (285 bp) za pomocą starterów ZmCCR1_986F_BglII (5’-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3’) oraz ZmCCR1_1271R_SacI (5’-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’).
  3. Ligować poszczególne fragmenty do wektora pGEM-T Easy zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przeprowadzić izolację plazmidowego DNA metodą mini-prep z poszczególnych transformantów zawierających konstrukt pGEM-T, używając komercyjnego zestawu do mini-prep plazmidów.
  5. Przetrawić zarówno pGEM-T::ZmCCR1 (523 bp), jak i ImpactVector (IV)-1.1 (wektor ekspresyjny do cytoplazmy) enzymami BglII i NcoI.
  6. Ligować duży, przetrawiony i oczyszczony z żelu fragment ZmCCR1 (523 bp) do przetrawionego i oczyszczonego z żelu wektora IV-1.1.
  7. Przetrawić pGEM-T::ZmCCR1(285 bp) oraz IV-1.1::ZmCCR1(523 bp) enzymami BglII i SacI, aby wprowadzić mały fragment do IV-1.1::ZmCCR1(523 bp).
  8. Ligować mały, przetrawiony i oczyszczony z żelu fragment ZmCCR1 (285 bp) do przetrawionego i oczyszczonego z żelu IV-1.1::ZmCCR1(523 bp).
  9. Sklonować oba fragmenty (523 bp i 285 bp) do IV-1.1, aby stworzyć konstrukt ZmCCR1 RNAi, który posiada odwróconą sekwencję powtórzeniową o długości 285 bp z 238 bp spacerem w środku fragmentów powtórzeń odwróconych (patrz Rysunek 1).
  10. Przenieść ten konstrukt do Escherichia coli (E. coli), wyhodować bakterie i przeprowadzić izolację plazmidowego DNA metodą midi-prep, aby uzyskać ilość DNA plazmidowego wystarczającą do transformacji genetycznej kukurydzy.

2. Transformacja genetyczna kukurydzy

  1. Przygotowanie cząsteczek wolframu
    1. Umieścić 60 mg kulek wolframowych (M10) w probówce o pojemności 1,5 ml i przemyć 1 ml 70% etanolu, mieszając na wortexie przez 2 min. Inkubować przez 10 min w temperaturze 23 °C, a następnie wirować przy 18 894 x g przez 2 min i odrzucić nadsącz.
    2. Przemyć 3x 1 ml 100% etanolu, wirować przez 2 min i odrzucać nadsącz. Dodać 1 ml sterylnego 50% glicerolu, aby uzyskać stężenie mikrocząsteczek 60 mg/ml.
  2. Przygotowanie DNA do bombardowania
    1. Przenieść 50 μl (3 mg) kulek wolframowych przygotowanych w 50% glicerolu do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 5 μl (1 μg) plazmidowego DNA RNAi IV-1.1::ZmCCR1, 50 μl 2,5 M CaCl2 oraz 20 μl 0,1 M spermidyny. Po dodaniu każdego z powyższych odczynników krótko mieszać na wortexie.
    2. Krótko wymieszać mieszaninę kulek wolframowych z DNA na wortexie i wirować przy 18 894 x g przez 30 s. Odlać nadsącz i resuspender osad w 140 μl 70% etanolu. Usunąć i odrzucić ciecz. Dodać 140 μl 100% etanolu. Usunąć i odrzucić ciecz.
    3. Dodać 48 μl 100% etanolu. Użyć natychmiast lub przechowywać na lodzie do 4 h przed bombardowaniem.
  3. Bombardowanie
    1. Przenieść embrionogenne kalusy kukurydzy Hi-II o średnicy 3-5 cm (dostarczone przez Maize Transformation Center z Iowa State University) na środek szalek Petriego o średnicy 100 mm zawierających pożywkę N6OSM (pożywka osmotyczna) co najmniej 4 h przed bombardowaniem.
    2. Przygotować urządzenie do dostarczania cząsteczek PSD-1000/He zgodnie z instrukcjami producenta32.
    3. Zdezynfekować ściankę komory 70% etanolem. Załadować sterylną membranę pękającą 650 psi do sterylnej nasadki mocującej. Rozprowadzić 5-6 μl roztworu M10-DNA na powierzchni makronośnika i krótko wysuszyć. Załadować makronośnik i ekran zatrzymujący do zespołu wyrzutowego mikronośnika.
    4. Umieścić zespół wyrzutowy mikronośnika oraz kalusy kukurydzy w komorze w wybranej odległości od ekranu zatrzymującego (L2 = 6 cm) i zamknąć drzwiczki. Przyspieszyć w próżni 27 psi w kierunku ekranu z siatki drucianej.
    5. Nacisnąć przycisk odpalania, aż membrana pękająca pęknie, a manometr helu spadnie do zera. Zwolnić przycisk odpalania.
    6. Inkubować bombardowane kalusy w szalce Petriego zawierającej N6OSM (pożywkę osmotyczną) przez 16 h w ciemności w temperaturze 27 °C. Podzielić kalusy na około dziesięć fragmentów i przenieść do szalek Petriego z N6E (pożywką do indukcji kalusa) i inkubować przez 5 dni w ciemności w temperaturze 27 °C.
  4. Selekcja
    1. Po 5 dniach na N6E przenieść kalusy na pożywkę N6S (pożywkę selekcyjną). Przesiewać wszystkie kalusy na pożywkę selekcyjną co 30 dni przez 8-12 tygodni, nie zakłócając struktury kalusów.
    2. Po około 8-10 tygodniach z nieproliferujących i częściowo nekrotycznych kalusów macierzystych wyrosną białe, szybko rosnące sektory. Wyciąć białe, szybko rosnące tkanki i przenieść je na świeżą pożywkę selekcyjną (N6S), a następnie kontynuować inkubację jak opisano powyżej.
  5. Regeneracja
    1. Przenieść białe i szybko rosnące kalusy embrionalne na pożywkę do regeneracji i inkubować jak powyżej przez 1 tydzień. Przenieść regenerujące się kalusy embrionalne na cykl 16 h światła dziennego i 8 h ciemności w temperaturze 25-27 °C.
    2. Po 3-4 tygodniach przenieść regenerujące się pędy do probówek szklanych z pożywką do ukorzeniania, kontynuując inkubację jak powyżej. Po pojawieniu się znacznego rozwoju korzeni ostrożnie przemyć korzenie pod bieżącą wodą, a następnie przesadzić siewki do 4-calowych doniczek z ziemią. Przykryć doniczki plastikowymi workami, aby zachować wilgoć. Po 2 dniach wykonać małe otwory w plastikowych workach. Po 5-6 dniach usunąć worki. Kontynuować inkubację jak powyżej przez kolejne 5-6 dni.
  6. Szklarnia
    1. Przenieść siewki do 18-calowych doniczek z ziemią i utrzymywać w pełnym letnim słońcu lub świetle szklarniowym. Początkowe rośliny zregenerowane określa się jako T0, natomiast pierwsze nasiona należą do generacji T1.

3. Analiza histologiczna

    1. Utrwalenie żyłek głównych liści kukurydzy w 5 ml 10% neutralnego buforu formaliny.
    2. Przetwarzanie i infiltracja próżniowa parafiną przy użyciu procesora do tkanek.
    3. Zatopienie tkanek w parafinie przy użyciu stacji do zatapiania HistoCentre III.
    4. Usunięcie nadmiaru parafiny z krawędzi po ostygnięciu bloków.
    5. Wycinanie skrawków o grubości 4-5 μm za pomocą mikrotomu.
    6. Umieszczenie skrawków na szkiełkach przedmiotowych i suszenie w inkubatorze w temperaturze 56 °C przez 2-24 hr. Należy upewnić się, że skrawki są całkowicie przylegają do szkiełka.
    7. Deparafinizacja skrawków w dwóch zmianach ksylenu przez 5 min w temperaturze 23 °C.
    8. Rehydratacja szkiełek poprzez dwie zmiany 100% etanolu przez 2 min oraz dwie zmiany 95% etanolu przez 2 min w temperaturze 23 °C.
    9. Płukanie skrawków w bieżącej wodzie z kranu przez 2 min.
    10. Barwienie 0,05% błękitem toluidyny O przez 1-2 min i krótkie płukanie ddH2O.
    11. Nałożenie szkiełka nakrywnego na próbki z użyciem olejku immersyjnego i wizualizacja za pomocą mikroskopii świetlnej.
  2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Utrwalenie przekrojów poprzecznych żyłek głównych liści kukurydzy w 4% glutaraldehydzie i 0,1 M buforze fosforanowym sodu (pH 7.4) w temperaturze 4 °C przez 1-2 hr.
    2. Krótkie płukanie próbek w buforze, odwadnianie w serii etanolu (25%, 50%, 75% i 95%) przez 10-15 min na każdym etapie oraz w 100% etanolu przez 10 min, 3x.
    3. Suszenie odwodnionych przekrojów poprzecznych żyłek głównych liści kukurydzy w suszarce do punktu krytycznego z wykorzystaniem ciekłego dwutlenku węgla jako medium przejściowego.
    4. Montaż wysuszonych próbek na aluminiowych stubach za pomocą zwłókniałych taśm węglowych do wysokiej próżni.
    5. Napylanie złota (grubość około 20 nm) na żyłki główne liści kukurydzy zamontowane na aluminiowych stubach w napylarce przepłukanej argonem.
    6. Badanie napylonych próbek w skaningowym mikroskopie elektronowym JEOL JSM-6400V (z emiterem elektronów z heksaborku lantanu).
    7. Obrazy cyfrowe zostały wykonane przy użyciu oprogramowania analySIS Pro (wersja 3.2).

4. Pomiar ligniny Klasona

  1. Zmiel próbki przez sito o oczkach 2 mm.
  2. Użyj analizatora wilgotności, aby określić zawartość wody w każdej próbce i zapisz uzyskaną wartość.
  3. Odważ ~1,5 g każdej próbki i zapisz masę. Wykonaj ekstrakcję próbek, używając wody w pierwszym etapie, a następnie etanolu w drugim etapie, wykorzystując zautomatyzowany ekstraktor rozpuszczalnikowy (3 cykle na ekstrakcję, ~14 min na cykl) lub aparat Soxhleta (8 hr na ekstrakcję). (Uwaga: Krok ten usuwa substancje ekstrahowalne, które mogą kondensować podczas hydrolizy kwasowej i zakłócać dokładny pomiar ligniny, zwiększając pozorną zawartość ligniny Klasona.)
  4. Wysusz ekstrahowane próbki w temperaturze 45 °C przez noc, a następnie pozostaw je do ostygnięcia w eksyكاته i zważ ponownie.
  5. Ustaw inkubator na 30 °C. Odmierz 0,3 g każdej suchej, ekstrahowanej próbki do probówek wysokociśnieniowych z nakrętką (zaleca się wykonanie pomiarów w trzech powtórzeniach dla każdej próbki) i zapisz masę z dokładnością do 0,1 mg. Do każdej probówki dodaj 3 ml 72% H2SO4.
  6. Wymieszaj próbkę za pomocą szklanej lub teflonowej bagietki. Pozostaw bagietkę w probówce aż do momentu dodania wody po inkubacji.
  7. Umieść probówki w inkubatorze ustawionym na 30 °C i 150 rpm na 60 min. Po 1 hr dodaj 84 ml wody dejonizowanej, aby rozcieńczyć stężenie kwasu do 4%, i wymieszaj bagietką. Należy uważać, aby na ściankach probówki powyżej poziomu wody nie pozostały duże ilości próbki.
  8. Szczelnie zamknij korki we wszystkich probówkach i umieść je w metalowym statywie lub dużych zlewkach. Autoklawuj w temperaturze 121 °C w cyklu sterylizacji cieczy przez 1 hr. Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed otwarciem.
  9. Przeprowadź wstępne popielanie tygli filtracyjnych w piecu w temperaturze 575 °C przez co najmniej 4 hr. Pozostaw tygle do ostygnięcia w eksykatorze przez co najmniej godzinę.
  10. Przefiltruj roztwór z każdej probówki pod próżnią przez oddzielny tygiel, używając gumowego adaptera do mocowania tygla. Użyj wody dejonizowanej, aby wypłukać pozostałe cząstki z probówki.
  11. Wysusz pozostałość ligniny w temperaturze 105 °C przez minimum 4 hr. Zapisz masę suchego tygla i osadu.
  12. W przypadku stosowania temperatury 575 °C, wstępnie wypal próbki nad palnikiem Bunsena, aż przestaną dymić lub wydzielać popiół, a następnie umieść je w piecu na 24 hr; w przypadku stosowania pieca programowalnego, zrezygnuj z wstępnego popielania i zastosuj następujący program:
  13. Wzrost temperatury z pokojowej do 105 °C i utrzymanie przez 12 min.
  14. Wzrost do 250 °C z szybkością 10 °C/min i utrzymanie przez 30 min.
  15. Wzrost do 575 °C z szybkością 20 °C/min i utrzymanie przez co najmniej 180 min.
  16. Wyjmij tygle z pieca i wystudź w eksykatorze. Zważ tygiel wraz z popiołem.
  17. Oblicz zawartość osadu nierozpuszczalnego w kwasie, korzystając z następującego równania:

Wzór na ligninę nierozpuszczalną w kwasie: (Mresidue-Mash)(Mpost)/(Mvial)(Mpre)(1-MC)*100%; równanie chemiczne.

MPRE = masa biomasy przed ekstrakcją
MPOST = masa biomasy po ekstrakcji
MVIAL = masa ekstrahowanej biomasy dodana do fiolki
MRESIDUE = masa tygla i pozostałości ligniny
MASH = masa tygla i popiołu
MC = zawartość wilgoci w biomasie przed ekstrakcją, w przeliczeniu na masę całkowitą

5. Analiza węglowodanów

  1. Przeprowadzić analizy węglowodanów ściany komórkowej zgodnie z protokołem Foster et al. (2010)31. W skrócie: przygotować osad nierozpuszczalny w alkoholu z liofilizowanego materiału roślinnego. Następnie materiał poddać hydrolizie za pomocą kwasu trifluoroctowego i dopasować solubilizowane pochodne monosacharydów do odpowiadających im octanów alditoli. Analizę tych lotnych pochodnych przeprowadzić za pomocą chromatografii gazowej (GC) sprzężonej z kwadrupolowym spektrometrem mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykazaliśmy redukcję zawartości ligniny w roślinach kukurydzy za pomocą RNAi. Metoda transformacji poprzez bombardowanie cząsteczkami pozwoliła uzyskać wydajność transformacji na poziomie około 30%. Wyciszenie genu ZmCCR1 było konsekwentnie obserwowane w generacjach T0-T2. Rośliny transgeniczne o zredukowanej zawartości ligniny rosły podobnie do roślin kukurydzy typu dzikiego, z wyjątkiem brązowego zabarwienia w żyłce środkowej liścia, okrywie kolby i łodydze. Analiza histologiczna wykazała, że linie mutantów ch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dostępność celulaz mikrobiologicznych dla polisacharydów ściany komórkowej roślin zależy w dużej mierze od stopnia, w jakim są one związane z polimerami fenolowymi23. Współczynnik konwersji z biomasy lignocelulozowej na cukier fermentacyjny jest ujemnie skorelowany z zawartością ligniny zdeponowanej w wtórnych ścianach komórkowych roślin. Korelacja ta przypisuje się właściwościom fizycznym ligniny, takim jak hydrofobowość24, niejednorodność chemiczna i brak regularnych hydrolizowalnych wiązań między...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Obrazowanie mikroskopowe zostało przeprowadzone za pośrednictwem usług Centrum Zaawansowanej Mikroskopii Uniwersytetu Stanowego Michigan. Kalus kukurydziany został zakupiony w Centrum Transformacji Kukurydzy Uniwersytetu Stanowego Iowa. Autorzy chcieliby podziękować Jeffreyowi R. Weatherheadowi z MSU Plant Research Laboratory za jego pomoc techniczną w analizie węglowodanów. Badania te zostały hojnie sfinansowane przez Corn Marketing Program of Michigan (CMPM) i Konsorcjum Badań Biotechnologii Roślin (CPBR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
N6OSM (pożywka osmotyczna)Wykonana we własnym zakresie
N6E (indukcja kalusa)Wykonana we własnym
pożywka N6S (pożywka selekcyjna)Wykonana we własnym zakresie
Pożywkaregeneracyjna Wykonana we własnym zakresie
PożywkaWykonana we własnym zakresie
10% neutralna buforowana formalina (1 L)Wykonane we własnym
zakresie urządzenie do dostarczania cząstek Bio-Rad PSD-1000/HeHercules, CA, Stany Zjednoczone
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Zeiss PASCALCarl Zeiss, Jena, NiemcyW przypadku mikroskopii jasnego pola obrazy zarejestrowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego PASCAL firmy Zeiss (Jena, Niemcy) ze zwierciadłem wzbudzenia 488 nm, filtrem emisyjnym 560 nm i filtrem emisyjnym 505-530 nm. Analizę obrazu wykonano przy użyciu oprogramowania Laserowy mikroskop skaningowy PASCAL LSM wersja 3.0 SP3.
Excelsior ES Tissue ProcessorThermo Scientific, Pittsburgh, PA, Stany
Stacja osadzania HistoCentre IIIThermo Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone
Model mikrotomowy Reichert 2030Reichert, Depew, NY, Stany
Napylarka Emscope model SC 500Ashford, Kent, Anglia
Skaningowy mikroskop elektronowy JEOL JSM-6400VJEOL Ltd., Tokio, Japonia
Młyn homoloidalny Fitzpatrick JT-6Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
Analizator wilgoci MA35Sartorius
Suszarka punktu krytycznego, Balzers CPDLeica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, Stany Zjednoczone
Przykręcane rurki wysokociśnienioweAce Glass, Vineland, NJ#8648-27
Zakręcane zaślepki do rur wysokociśnieniowychAce Glass, Vineland, NJ#5845-47
zakresie ukorzeniająca ZjednoczoneZjednoczone

Bibliografia

  1. Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
  2. Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
  3. Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
  4. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  5. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
  6. Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
  7. Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
  8. Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
  9. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
  10. Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
  11. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
  12. Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
  13. Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
  14. Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
  15. Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
  16. Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
  17. Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
  18. Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
  19. Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
  20. Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
  21. Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
  22. Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
  23. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
  24. Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
  25. Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
  26. Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
  27. Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
  28. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
  29. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
  30. Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
  31. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
  32. Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
  33. Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
  34. Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
  35. Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

RNAi CCR1 u kukurydzybombardowanie cząsteczkamiskład ściany komórkowejtransgeniczne rośliny kukurydzyzwiększenie zawartości celulozy krystalicznejniezmieniona zawartość hemicelulozyfenotyp brązowego przebarwieniapocienienie włókien sklerenchymy
Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.