Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nanocząstki są obdarzone bardzo obiecującymi właściwościami do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Praca ta opisuje szybką i wiarygodną metodę analizy za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania interakcji nanocząstek z komórkami odpornościowymi. Pierwotne komórki odpornościowe można łatwo oczyścić z tkanek ludzkich lub mysich za pomocą izolacji magnetycznej za pośrednictwem przeciwciał. Po pierwsze, różne populacje komórek biegnące w cytometrze przepływowym można odróżnić za pomocą światła rozproszonego do przodu (FSC), które jest proporcjonalne do wielkości komórki, oraz światła rozproszonego bocznie (SSC), związanego z wewnętrzną złożonością komórki. Co więcej, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała przeciwko specyficznym receptorom na powierzchni komórki umożliwiają identyfikację kilku subpopulacji w tej samej próbce. Często wszystkie te cechy różnią się, gdy komórki są wzmacniane przez bodźce zewnętrzne, które zmieniają ich stan fizjologiczny i morfologiczny. W tym przypadku nanocząstki FITC-SiO2 o długości fali 50 nm są wykorzystywane jako model do identyfikacji internalizacji materiałów nanostrukturalnych w komórkach odpornościowych krwi ludzkiej. Fluorescencja komórek i wzrost światła rozproszonego bocznego po inkubacji z nanocząstkami pozwoliły nam określić zależność oddziaływania nanocząstka-komórka od czasu i stężenia. Co więcej, taki protokół można rozszerzyć w celu zbadania interakcji nanocząstek rodaminy-SiO2 z pierwotnym mikroglejem, komórkami odpornościowymi rezydującymi w ośrodkowym układzie nerwowym, wyizolowanymi ze zmutowanych myszy, które specyficznie eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) w linii monocytów/makrofagów. Wreszcie, dane z cytometrii przepływowej związane z internalizacją nanocząstek w komórkach zostały potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Wprowadzenie
Nanomateriały inżynieryjne obecnie wzbudzają zainteresowanie naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi potencjalnymi zastosowaniami w biomedycynie1. Do produkcji nanostruktur o różnych kształtach, właściwościach fizycznych i chemicznych można wykorzystać szeroką gamę materiałów nieorganicznych i organicznych. Wśród tych struktur zmodyfikowane nanocząstki o kulistym kształcie wykazały ogromny potencjał w medycynie diagnostycznej i translacyjnej2. Ich konstrukcja rdzenia i powierzchni jest uzależniona od możliwego zastosowania i oznacza dogłębne badanie reakcji komórek docelowych po kontakcie i interakcji nanocząstek. Nanocząsteczki, które uważa się za celowo podawane ludziom, będą miały bezpośredni kontakt z kilkoma typami komórek odpornościowych. Ich odpowiedzialność za utrzymanie integralności organizmu sprawia, że są one kluczowym tematem badań w nanomedycynie3.
Komórkowa część wrodzonego układu odpornościowego jest głównie reprezentowana przez fagocyty. Wśród nich komórki pochodzące z linii monocytów/makrofagów, w tym mikroglej rezydujący w ośrodkowym układzie nerwowym, odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej4,5. Są w stanie wywołać reakcje obronne w ciągu kilku godzin po zetknięciu się z ciałami obcymi. Co więcej, komórki monocytarne koordynują i instruują adaptacyjną odpowiedź immunologiczną poprzez uwalnianie cytokin. Wszystkie te zdarzenia zachodzą nawet w obecności materiałów inżynieryjnych, które są w dużej mierze postrzegane przez układ odpornościowy jako "nie-ja"6.
Wśród historycznie stosowanych metod w immunologii do analizy komórek, cytometria przepływowa stanowi jedno z najpotężniejszych narzędzi. Co więcej, dostępność technologii identyfikacji lub oczyszczania określonej subpopulacji immunologicznej (często wykorzystujących wykluczenie lub obecność jednego pojedynczego białka błonowego) pozwala na dokładne zbadanie wpływu określonej nanocząstki na ten konkretny pierwotny typ komórki 7. Jednak komórki mogą wykazywać zmiany fizjologiczne i morfologiczne po ekspozycji na nanocząstki. Nanocząstki mogą również zakłócać określone parametry optyczne, takie jak absorpcja lub emisja światła o określonych długościach fal, wpływając na uzyskiwane wyniki8. W związku z tym należy rozważyć ograniczenia stosowania i ewentualne adaptacje klasycznych testów immunologicznych do badania nowych materiałów.
Ta praca dotyczy wykrywania interakcji nanocząsteczek z pierwotnymi komórkami odpornościowymi za pomocą cytometrii przepływowej. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystano nanocząstki FITC-SiO2 o długości fali 50 nm jako modelowy nanomateriał do opisania metody. Cząsteczki krzemionki mogą być wytwarzane w bardzo precyzyjny sposób w skali nanometrycznej. Rozmiar, kształt i właściwości powierzchni, takie jak ładunek lub hydrofobowość, można precyzyjnie dostosować, aby zwiększyć ich biokompatybilność9. Wiele cech nanocząstek SiO2 pozwala na wykorzystanie ich jako modelu dla cząstek dostarczających leki10. Co więcej, barwniki fluorescencyjne lub kropki kwantowe mogą być uwięzione lub połączone z tymi cząstkami, co stanowi użyteczne nanonarzędzia do celów obrazowania11.
Protokół
OŚWIADCZENIE ETYCZNE
Próbki ludzkie i zwierzęce zostały przetworzone zgodnie z wytycznymi włoskiego Ministerstwa Zdrowia, ustawą 116/92 i Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG.
1. Hodowle komórek monocytowych
- Hodowla ludzkich komórek THP-1 w kolbach T-75 zawierających pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% surowicą ludzką, 50 U/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny, 0,05 mM β-merkaptoetanolu w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Podziel kultury, gdy zlewają się (co 3-5 dni).
2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od Buffy Coats
- Przed rozpoczęciem protokołu izolacji należy przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,2, 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 5 ml roztworu podstawowego BSA do 95 ml buforu płuczącego (rozcieńczenie 1:20). Odgazuj bufor i utrzymuj go w chłodzie (2-8 °C).
WAŻNE: Nieodgazowanie bufora może skutkować mniej niż optymalnymi wynikami, ponieważ pęcherzyki mogą zablokować kolumnę izolacyjną (patrz krok 3.2).
nuta: Alternatywnie można zastosować antykoagulant cytrynianowo-dekstrozę Formula-A (ACD-A) lub dekstrozę fosforanu cytrynianu (CPD). I odwrotnie, inne białka albuminowe lub surowice innych gatunków mogą zastąpić BSA. Nie należy używać zawierającychCa2+ lub Mg2+. - Zdobądź kożuchy od zdrowych dawców (w wieku 20-60 lat).
- Przygotować stożkowe probówki o pojemności 50 ml do wirowania w gradiacji gęstości. Określić liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia krwi (każda probówka może przetworzyć 35 ml rozcieńczonej krwi) i dodać 15 ml Ficoll-Paque do każdej pustej probówki.
- Rozcieńczyć 8 ml krwi w 24 ml roztworu PBS/BSA/EDTA (rozcieńczenie 1:4).
- Ostrożnie nałożyć rozcieńczony roztwór na wierzch Ficoll-Paque (gęstość = 1,077 g/ml) w każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Nie mieszać krwi z Ficoll-Paque.
WAŻNE: Aby uniknąć mieszania się krwi i Ficoll-Paque, trzymaj probówkę pod kątem 45° i powoli nakładaj warstwę mieszaniny krwi. - Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Komórki jednojądrzaste (MNC) pozostaną na granicy faz osocza-Ficoll-Paque, podczas gdy granulocyty i erytrocyty osadzają się z powodu większej gęstości przy ciśnieniu osmotycznym Ficoll-Paque.
- Przenieść komórki interfazowe (komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, PBMC) do nowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej PBS/BSA/EDTA i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przemyć osad dwukrotnie preparatem PBS/BSA/EDTA w celu usunięcia płytek krwi. Wirować w 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Hoduj komórki w kompletnym RPMI-1640 z 10% ludzką surowicą i antybiotykami lub przystąp do oczyszczania monocytów.
3. Oczyszczanie pierwotnych monocytów z PBMC
- Wyizoluj monocyty z PBMC przez magnetyczną separację kulek przy użyciu zestawu do izolacji monocytów ludzkiego Pana:
- Przepuść komórki przez nylonową siatkę o grubości 30 μm (filtry wstępnej separacji, 30 μm), aby usunąć ewentualne grudki komórek.
- Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Całkowicie odessać supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 30 μl bufora PBS/EDTA/BSA na 107 komórek ogółem.
- Dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR na 10 7 komórek.
- Dodać 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał na 107 komórek.
- Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.
- Dodać 30 μl buforu na 107 komórek.
- Dodaj 20 μl mikrokulek antybiotyny na 107 komórek.
- Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C.
- Ponownie zawiesić do 108 komórek w 500 μl buforu PBS/EDTA/BSA.
- Separacja magnetyczna
- W zależności od całkowitej liczby komórek wybierz odpowiednią kolumnę MACS i separator MACS (zobacz arkusz danych kolumny MACS).
- Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora MACS.
- Przygotować kolumnę przez przepłukanie odpowiednią ilością buforu PBS/EDTA/BSA (kolumny MS: 500 μl; Kolumny LS: 3 ml).
Uwaga: Kolumny są "zatrzymane przepływem" i nie pracują na sucho. - Nałóż zawieszenie komórek na kolumnę. Zebrać przepływowy zawierający nieznakowane komórki, reprezentujące wzbogaconą frakcję monocytów.
- Kolumna płucząca 3x z buforem PBS/EDTA/BSA (500 μl dla MS i 3 ml dla LS na mycie).
- Zebrać nieznakowane komórki, które przechodzą, reprezentujące wzbogacone komórki monocytów, i dodać do przepływu z sekcji 3.2.4.
nuta: Umyć kolumnę, dodając podwielokrotności bufora PBS/EDTA/BSA tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. - (Opcjonalnie) Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej. Odpipetować bufor do kolumny (kolumny MS: 1 ml; Kolumny LS: 5 ml). Natychmiast wypłukać znakowane magnetycznie komórki niemonocytowe, mocno wciskając tłok do kolumny.
- Hodowla oczyszczonych monocytów w kompletnym RPMI-1640 z 10% ludzką surowicą i antybiotykami.
4. Oczyszczanie pierwotnych monocytów z krwi pełnej
- Oczyść monocyty z krwi pełnej za pomocą zestawu do izolacji monocytów krwi pełnej zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Internalizacja nanocząstek w leukocytach krwi i oczyszczonych monocytach
- Płytka 5 x 105 komórek/ml (1 ml/dołek) wyizolowanych PBMC lub oczyszczonych monocytów CD14-dodatnich na 12-dołkowej płytce.
- Wirować roztwór podstawowy nanocząstek FITC-SiO2 i ponownie zawiesić w kompletnym podłożu do stężenia roboczego 100 nM.
- Dodać 10 μl roboczej zawiesiny nanocząstek (100 nM) dla próbek poddanych działaniu substancji, aby osiągnąć końcowe stężenie nanocząstek wynoszące 1 nM. Dodać taką samą objętość kompletnej pożywki dla niepoddanych działaniu substancji kontrolnych do każdej studzienki.
- Po 1 godzinie internalizacji zebrać próbki w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml i odwirować je przez 3 minuty przy 6 000 x g przy wilgotności względnej.
- Przepłukać osad 1 ml buforu bieżącego przez 3 minuty przy 6 000 x g przy wilgotności względnej.
- Zawiesić osad w 200 μl buforu roboczego. Komórki są teraz gotowe do odczytu za pomocą cytometrii przepływowej.
6. Izolacja pierwotnych mieszanych kultur glejowych (patrz Bertero et al.7)
7. Powtarzanie mieszanej hodowli komórek glejowych zlewających
się- Przemyć kolbę T-75 raz 10 ml PBS (bez Ca2+/Mg2+), następnie dodać 10 ml Versene i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
- Kilkakrotnie pipetować supernatant w górę i w dół, aby oderwać komórki od powierzchni T-75 i rozpuścić agregaty komórek.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Zbierz niewielką ilość zawiesiny komórkowej, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w końcowym stężeniu 5 x 105 komórek/ml w pożywce do kompletnych hodowl glejowych.
- Umieść 0,5 ml / basenik w 24-dołkowej płytce i pozwól komórkom osiąść na 2-4 godziny przed poddaniem działaniu nanocząstek.
8. Internalizacja nanocząstek w mikrogleju
- Dodać 500 μl kompletnej pożywki do hodowli glejowej (dla kontroli niepoddanych działaniu substancji) lub 500 μl 2x zawiesiny nanocząstek rodaminy-SiO2 w kompletnej pożywce do hodowli glejowej (dla próbek poddanych działaniu substancji) do każdej studzienki.
- Odpipetować komórki, aby umożliwić oderwanie się szybko przylegających komórek w wybranych punktach czasowych i zebrać je w probówkach polipropylenowych o pojemności 2 ml.
- Dodać 500 μl versenu do każdego dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut, następnie odłączyć pozostałą frakcję komórkową i zebrać każdą próbkę z odpowiednimi komórkami nieprzylegającymi z poprzedniego etapu.
- Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić osad w 100 μl bufora AutoMACS Running.
9. Barwienie za pomocą CD11b-VioBlue
- Dodać 10 μl ludzko-mysiego przeciwciała VioBlue-CD11b do 100 μl zawiesiny komórkowej (w stosunku 1:11) w buforze do pracy i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 1 ml bieżącego buforu i wymieszać zawiesinę komórkową.
- Odwirować każdą próbkę przez 3 minuty przy 300 x g.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100-150 μl buforu bieżącego.
- Odczytać próbki do cytometru (przechowywać próbki w temperaturze 4 °C między dwoma ostatnimi etapami).
WAŻNE: przed analizą próbek należy przystąpić do kompensacji nakładających się sygnałów w widmach emisyjnych obserwowanych między różnymi fluorochromami (nanocząstkami lub przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem).
10. Kompensacja spektralna
- Otwórz okno "Ustawienia urządzenia" (obecne we wszystkich programach przyrządu).
nuta: W przypadku korzystania z innego instrumentu niż podany w tabeli materiałów, należy zapoznać się z instrukcją obsługi konkretnego instrumentu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat nabycia. - Pobrać próbkę niepoddaną działaniu substancji (bez nanocząstek) przy niskiej prędkości przepływu (jeśli zezwala na to urządzenie). Podczas akwizycji należy ręcznie wyregulować rozpraszanie do przodu i na boki (odpowiednio FSC i SSC), regulując kanały napięcia.
nuta: Zmodyfikuj skale osi SSC i FSC, aby jak najlepiej zobrazować całą populację komórek na wykresie. Szablon ustawień instrumentu dla każdego typu komórki zainteresowania może być utworzony, zapisany i wykorzystany do przyszłych przejęć. - Otwórz odpowiednią zakładkę "region" w oprogramowaniu. Narysuj odpowiedni duży region ("bramę") wokół żądanej populacji.
nuta: Internalizacja nanocząstek indukuje przesunięcie komórek w SSC. Jeśli bramka jest zbyt ściśle ograniczona wokół populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, uzyskane dane prawdopodobnie pominą część komórek, które mają zostać wykryte. - Należy użyć dwóch niebarwionych próbek, jednej do użycia jako próbka ślepa, a drugiej do kompensacji barwienia PI (opcjonalnie), jednej pojedynczej próbki barwionej z odpowiednim fluorochromem dla każdego kanału fluorescencji, który ma być poddany kompensacji.
nuta: Użyj innej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, które ma być użyte w znakowaniu eksperymentu. - Otwórz zakładkę "Kompensacja" w polu "Ustawienia instrumentu". Zwiększ lub zmniejsz współczynnik kompensacji podczas akwizycji, aż intensywność fluorescencji w kanale rozlewowym będzie mniej więcej taka sama dla populacji fluorochromu dodatniego i ujemnego.
- Pobieraj próbki poddane działaniu nanocząstek po dostosowaniu kompensacji.
Wyniki
Cytometria przepływowa jest przydatnym narzędziem do identyfikacji i charakteryzacji różnych komórek i stanowi technikę z wyboru w celu identyfikacji specyficznych komórek odpornościowych, takich jak monocyty, granulocyty, limfocyty T, limfocyty B, komórki natural killer (NK), komórki dendrytyczne (DCs) oraz inne subpopulacje leukocytów.
W celu lepszej charakterystyki zachowania leukocytów w odpowiedzi na nanocząstki, przeprowadziliśmy testy internalizacji z udziałem pierwotnych leukocytów wyizolowanych z krwi zdrowych dawców (Rysunki 1 i 2) oraz z ludzkiej linii komórkowej monocytów (komórki THP-1, Rysunek 3).
Jak pokazano na Rysunku 1A, trzy główne subpopulacje leukocytów krwi zostały wyraźnie zidentyfikowane na podstawie rozpraszania światła w przód i w bok po izolacji PBMC. Ponadto, po traktowaniu FITC-SiO2, limfocyty (szary), monocyty (niebieski) i granulocyty (czerwony) wykazują różną szybkość internalizacji nanocząstek, co obrazuje intensywność zielonej fluorescencji (Rysunek 1B). Opisany protokół umożliwia oczyszczanie pierwotnych monocytów CD14 dodatnich z PBMC. Rysunek 2A przedstawia wykres kropkowy z cytometrii przepływowej dla monocytów CD14+ w obecności FITC-SiO2. Rysunek 2B pokazuje ilościowo ocenioną internalizację FITC-SiO2 w tych samych komórkach, przedstawioną na histogramie w skali logarytmicznej.
Podobne eksperymenty dotyczące internalizacji przeprowadzono na monocytach THP-1 traktowanych rosnącymi stężeniami nanocząsteczek FITC-SiO2. Jako kontrolę negatywną wykorzystano komórki nietraktowane. Rysunek 3A przedstawia zależny od dawki wzrost rozproszenia bocznego przy niezmienionym rozproszeniu przednim w linii komórkowej THP-1. Na Rysunku 3B, obok histogramów SSC i FSC dla każdego przetestowanego stężenia nanocząsteczek FITC-SiO2, zaprezentowano ilościowe oznaczenie średniej intensywności fluorescencji (MFI). Dane te sugerują, że traktowanie nanocząsteczkami FITC-SiO2 indukuje zależną od dawki internalizację w monocytach, co objawia się zwiększeniem ziarnistości wewnątrzkomórkowej (rozproszenie boczne) oraz fluorescencji (kanał zielony).
Aby uzyskać dalsze informacje na temat rodzaju oddziaływań między komórkami odpornościowymi a nanocząsteczkami, wyizolowano pierwotne mieszane hodowle glejowe i oczyszczono mikroglej, czyli rezydentne komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego. Zastosowanie transgenicznego modelu mysiego wykazującego zieloną fluorescencję mikrogleju pozwala na wizualizację różnych mechanizmów neurozapalnych. Transgeniczna mysz B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J wykorzystana w tej pracy wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą promotora CX3CR112. Po 7 dniach in vitro (DIV) mikroskopia fluorescencyjna wykazuje mieszaną pierwotną hodowlę glejową z dużą liczbą astrocytów (przyległe komórki GFP-ujemne) i niektórymi komórkami zielonymi (GFP-dodatnie, Rysunek 5A). W tym modelu mysim za pomocą cytometrii przepływu i barwienia pojedynczym przeciwciałem CD11b można wyróżnić trzy subpopulacje glejowe: pierwszą CD11b-GFP- (astrocyty i inne komórki glejowe), drugą wyraźną grupę komórek mikroglejalnych CD11b+GFP+ oraz trzecią subpopulację CD11b+GFP- (Rysunek 4A). Te dwie ostatnie subpopulacje są zdolne do internalizacji nanocząsteczek, przy czym populacja GFP+ (reprezentująca patrolujące niedojrzałe mikrogleje poprzez transkrypcję promotora CX3CR1) wykazuje nieco wyższą wydajność, co wykazano w analizie cytometrii przepływu (Rysunek 4B). Nastąpiła internalizacja może zostać dodatkowo potwierdzona za pomocą mikroskopii konfokalnej, stosując taką samą końcową koncentrację nanocząsteczek Rhodamine-SiO2, jak pokazano na Rysunku 5B.
Rycina 1. Internali zacja nanocząsteczek FITC-SiO2 w wyizolowanych leukocytach krwi. A) Reprezentatywny wykres punktowy cytometrii przepływowej rozproszenia światła przedniego (FSC) w stosunku do rozproszenia światła bocznego (SSC) leukocytów krwi wyizolowanych za pomocą Ficoll-Paque. B) Nałożone na siebie histogramy fluorescencji zielonej trzech głównych subpopulacji komórek leukocytów krwi w obecności 1 nM nanocząsteczek FITC-SiO2 (+45 mV) przez 1 hr. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2. Internalizacja nanocząsteczek FITC-SiO2 w oczyszczonych monocytach CD14+. A) Reprezentatywny wykres kropkowy cytometrii przepływowej rozproszenia przedniego (FSC) versus rozproszenia bocznego (SSC) oczyszczonych monocytów CD14-dodatnich. B) Histogram zielonej fluorescencji oczyszczonej subpopulacji monocytów w obecności 1nM nanocząsteczek FITC-SiO2 (+45 mV) przez 1 hr. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3. Wpływ internalizacji nanocząstek FITC-SiO2 na komórki THP-1. A) Reprezentatywny wykres kropkowy z cytometrii przepływowej rozproszenia przedniego (FSC) w stosunku do rozproszenia bocznego (SSC) linii komórkowej monocytów THP-1 po 1 h ekspozycji na rosnące stężenia nanocząstek FITC-SiO2. B) Zależna od stężenia zmienność rozproszenia bocznego (SSC), rozproszenia przedniego (FSC) i zielonej fluorescencji w obecności nanocząstek FITC-SiO2 (+45 mV) przez 1 h. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 4. Internali zacja nanocząstek Rhodamine-SiO2 do pierwotnego mikrogleju izolowanego z myszy B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J. A) Wykres kropkowy cytometrii przepływowej dla białka GFP (Green Fluorescent protein) versus CD11b-VioBlue pierwotnej mieszanej glei izolowanej z myszy B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J. Populacje CD11b+GFP+ i CD11b+GFP- są przedstawione odpowiednio w prawym górnym i prawym dolnym kwadrancie. B) Nałożony histogram fluorescencji czerwonej dla subpopulacji mikrogleju w obecności 1 nM nanocząstek Rhodamine-SiO2 (+45 mV) przez 30 min (histogram czerwony) versus kontrola (histogram szary). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5. Wizualizacja mikrogleju GFP+. (A) Mikroskopia fluorescencyjna w 7 DIV oraz (B) mikroskopia konfokalna internalization nanocząstek Rhodamine-SiO2 (czerwone strzałki) w mikrogleju GFP+.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Protokół eksperymentalny przedstawia bardzo istotne punkty, które należy wziąć pod uwagę. Bardzo ważne jest, aby pracować w temperaturze 4 °C (na lodzie) i ewentualnie w ciemności podczas wszystkich etapów barwienia, ponieważ wyższe temperatury i światło mogą negatywnie wpłynąć na wydajność barwienia. Nanocząstki mogą być poddawane sonikacji, aby lepiej zawiesić je tuż przed użyciem.
Prawidłowa analiza cytometrii przepływowej wymaga prawidłowej kalibracji w różnych kanałach. Kalibrację przyrządu należy wykonywać przed każdą sesją eksperymentalną. Oprócz problemów technicznych z oprzyrządowaniem, mogą wystąpić również problemy z etykietowaniem przeciwciał. Obowiązkowe jest stosowanie przeciwciała w odpowiednim stężeniu. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie lub zbyt niskie, konsekwencją może być niezadowalająca intensywność sygnału.
Wady tej techniki dotyczą konieczności pracy z próbkami monodyspersyjnymi, braku możliwości zlokalizowania miejsca pochodzenia sygnału (tj. różnych przedziałów komórkowych). Istnieją również pewne ograniczenia w wyborze fluorochromów, które mają być stosowane łącznie: długość fali wzbudzenia i pasma emisji muszą być wystarczająco oddzielone, aby umożliwić ich właściwy pomiar. Jeśli stosowane widma przeciwciał nakładają się na siebie, wymagana jest prawidłowa kompensacja.
Cytometria przepływowa to potężna metoda analizy komórek w obecności lub bez nanocząstek. Technika ta pozwala na wieloparametryczne badanie komórki, dużą liczbę badanych zdarzeń, szybkość analizy (ponad 1000 komórek/s), odtwarzalność i odczyty statystyczne. Próbki mogą być przetwarzane bez utraty żywotności komórek.
Dzięki zastosowaniu znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek możliwe jest zakwalifikowanie i ilościowe określenie ich internalizacji w subpopulacjach komórek, które są identyfikowane przez specyficzne markery naświetlone na błonie komórkowej. Parametry komórki mogą się zmieniać w obecności określonych nanocząstek. W zależności od celu badań, wariacje te mogą być wykorzystane do identyfikacji konkretnego zjawiska, takiego jak rozpraszanie boczne komórek, które proporcjonalnie wzrasta wraz ze wzrostem szybkości internalizacji nanocząstek.
Modyfikacje powierzchni komórek wywołane przez nanocząstki mogą również stanowić ograniczenie tej techniki. Z tego powodu obrót receptorów błony komórkowej musi być zawsze brany pod uwagę i możliwie znany z wyprzedzeniem, aby precyzyjnie scharakteryzować badaną populację komórek. Ekstremalne upośledzenie osmozy błonowej w próbkach przeciążonych nanocząstkami może prowadzić do śmierci komórki.
Toksyczność zależna od dawki nanomateriałów powinna być badana empirycznie dla każdej populacji komórek. Wyraźnie zdefiniowane martwe komórki muszą być wyłączone z ilościowego oznaczania fluorescencji. Na przykład barwienie aneksyną V / PI jest jedną z kilku metod zwykle stosowanych do wykrywania zarówno komórek martwiczych, jak i apoptotycznych.
Komórki pierwotne wykazujące ekspresję GFP są również potężnym narzędziem do wybierania określonej subpopulacji komórek i zbierania danych bez wstępnego etykietowania. Połączenie z komplementarnymi nanocząstkami fluorescencyjnymi pozwala na bardzo szybkie i precyzyjne określenie ilościowe interakcji komórka-nanocząstka. Uważa się, że dostarczanie leków lub genów zostanie w przyszłości ulepszone dzięki zastosowaniu nanocząstek zdolnych do uwalniania określonego ładunku leku do wybranych tkanek.
Zastosowanie nanocząstek jako specyficznych nośników dostarczania i/lub modulatorów immunologicznych w farmacji wymaga znajomości środowiska biologicznego (np. poprzez cytometrię przepływową) w celu zbadania oddziaływań komórka-nanocząstka.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że firma Miltenyi Biotech GmbH sponsorowała złożenie tego manuskryptu. HiQ-Nano Company (http://www.hiq-nano.com/index.html) to firma spin-off zajmująca się nanotechnologią, która powstała z IIT.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
Autorzy chcieliby podziękować Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Niemcy) za sponsorowanie tego manuskryptu, Dr. Paolo Petrucciani (Oddział Immunohematologii i Transfuzjologii, Szpital Lotti Pontedera, Piza, Włochy) za dostarczenie ludzkich kożuchów oraz Prof. Massimo Pasqualetti (Wydział Biologii - Zakład Biologii Komórkowej i Rozwojowej), Uniwersytet w, Piza, Włochy) w celu utrzymania kolonii myszy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| RPMI-1640 (zmodyfikowana ATCC) | Gibco | A10491-01 | Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem |
| DMEM, wysoka glukoza, czerwień fenolowa | Gibco | 41966-029 | |
| Penicylina-Streptomycyna, płyn | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamycyna | Gibco | 15710-049 | |
| Surowica konia (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
| β-merkaptoetanol | Gibco | 21985-023 | |
| Trypsyna 2,5% | Gibco | 15090-046 | |
| Ludzkie Wspólne Surowice | Invitrogen | 34005100 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
| DNAza I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
| CD11b-VioBlue człowiek i mysz | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
| MACS BSA Roztwór podstawowy | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Roztwór do płukania | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| Bufor do biegania | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
| AutoMACS Bufor do biegania | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Zestaw do izolacji monocytów ludzkiego Pana | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
| Zestaw kolumny krwi pełnej | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
| Mikrogranulki CD14 krwi pełnej, ludzkie | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
| Kolumna MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Kolumna LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separator MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Separator MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Roztwór do lizy czerwonych krwinek | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Filtry do wstępnej separacji 30 i mikro; m | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Cytometr przepływowy MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
| Kulki kalibracyjne MACSQuant | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
| FITC-SiO2 nanocząstki (50 nm, +45 mV) | Firma HiQ-Nano | ||
| Nanocząstki rodaminy-SiO2 (50 nm, +45 mV) | HiQ-Nano Company | ||
| 12-dołkowa płytka Falcon | Becton Dickinson | 353043 |
Bibliografia
- Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
- Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
- Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
- Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
- Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
- Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
- Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
Przedruki i uprawnienia
