Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Nanocząstki są obdarzone bardzo obiecującymi właściwościami do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Praca ta opisuje szybką i wiarygodną metodę analizy za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania interakcji nanocząstek z komórkami odpornościowymi. Pierwotne komórki odpornościowe można łatwo oczyścić z tkanek ludzkich lub mysich za pomocą izolacji magnetycznej za pośrednictwem przeciwciał. Po pierwsze, różne populacje komórek biegnące w cytometrze przepływowym można odróżnić za pomocą światła rozproszonego do przodu (FSC), które jest proporcjonalne do wielkości komórki, oraz światła rozproszonego bocznie (SSC), związanego z wewnętrzną złożonością komórki. Co więcej, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała przeciwko specyficznym receptorom na powierzchni komórki umożliwiają identyfikację kilku subpopulacji w tej samej próbce. Często wszystkie te cechy różnią się, gdy komórki są wzmacniane przez bodźce zewnętrzne, które zmieniają ich stan fizjologiczny i morfologiczny. W tym przypadku nanocząstki FITC-SiO₂ o długości fali 50 nm są wykorzystywane jako model do identyfikacji internalizacji materiałów nanostrukturalnych w komórkach odpornościowych krwi ludzkiej. Fluorescencja komórek i wzrost światła rozproszonego bocznego po inkubacji z nanocząstkami pozwoliły nam określić zależność oddziaływania nanocząstka-komórka od czasu i stężenia. Co więcej, taki protokół można rozszerzyć w celu zbadania interakcji nanocząstek rodaminy-SiO₂ z pierwotnym mikroglejem, komórkami odpornościowymi rezydującymi w ośrodkowym układzie nerwowym, wyizolowanymi ze zmutowanych myszy, które specyficznie eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) w linii monocytów/makrofagów. Wreszcie, dane z cytometrii przepływowej związane z internalizacją nanocząstek w komórkach zostały potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

Nanomateriały inżynieryjne obecnie wzbudzają zainteresowanie naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi potencjalnymi zastosowaniami w biomedycynie¹. Do produkcji nanostruktur o różnych kształtach, właściwościach fizycznych i chemicznych można wykorzystać szeroką gamę materiałów nieorganicznych i organicznych. Wśród tych struktur zmodyfikowane nanocząstki o kulistym kształcie wykazały ogromny potencjał w medycynie diagnostycznej i translacyjnej². Ich konstrukcja rdzenia i powierzchni jest uzależniona od możliwego zastosowania i oznacza dogłębne badanie reakcji komórek docelowych po kontakcie i interakcji nanocząstek. Nanocząsteczki, które uważa się za celowo podawane ludziom, będą miały bezpośredni kontakt z kilkoma typami komórek odpornościowych. Ich odpowiedzialność za utrzymanie integralności organizmu sprawia, że są one kluczowym tematem badań w nanomedycynie³.

Komórkowa część wrodzonego układu odpornościowego jest głównie reprezentowana przez fagocyty. Wśród nich komórki pochodzące z linii monocytów/makrofagów, w tym mikroglej rezydujący w ośrodkowym układzie nerwowym, odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej^4,5. Są w stanie wywołać reakcje obronne w ciągu kilku godzin po zetknięciu się z ciałami obcymi. Co więcej, komórki monocytarne koordynują i instruują adaptacyjną odpowiedź immunologiczną poprzez uwalnianie cytokin. Wszystkie te zdarzenia zachodzą nawet w obecności materiałów inżynieryjnych, które są w dużej mierze postrzegane przez układ odpornościowy jako "nie-ja"⁶.

Wśród historycznie stosowanych metod w immunologii do analizy komórek, cytometria przepływowa stanowi jedno z najpotężniejszych narzędzi. Co więcej, dostępność technologii identyfikacji lub oczyszczania określonej subpopulacji immunologicznej (często wykorzystujących wykluczenie lub obecność jednego pojedynczego białka błonowego) pozwala na dokładne zbadanie wpływu określonej nanocząstki na ten konkretny pierwotny typ ^{komórki 7}. Jednak komórki mogą wykazywać zmiany fizjologiczne i morfologiczne po ekspozycji na nanocząstki. Nanocząstki mogą również zakłócać określone parametry optyczne, takie jak absorpcja lub emisja światła o określonych długościach fal, wpływając na uzyskiwane wyniki⁸. W związku z tym należy rozważyć ograniczenia stosowania i ewentualne adaptacje klasycznych testów immunologicznych do badania nowych materiałów.

Ta praca dotyczy wykrywania interakcji nanocząsteczek z pierwotnymi komórkami odpornościowymi za pomocą cytometrii przepływowej. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystano nanocząstki FITC-SiO₂ o długości fali 50 nm jako modelowy nanomateriał do opisania metody. Cząsteczki krzemionki mogą być wytwarzane w bardzo precyzyjny sposób w skali nanometrycznej. Rozmiar, kształt i właściwości powierzchni, takie jak ładunek lub hydrofobowość, można precyzyjnie dostosować, aby zwiększyć ich biokompatybilność⁹. Wiele cech nanocząstek SiO₂ pozwala na wykorzystanie ich jako modelu dla cząstek dostarczających leki¹⁰. Co więcej, barwniki fluorescencyjne lub kropki kwantowe mogą być uwięzione lub połączone z tymi cząstkami, co stanowi użyteczne nanonarzędzia do celów obrazowania¹¹.

Protokół

OŚWIADCZENIE ETYCZNE

Próbki ludzkie i zwierzęce zostały przetworzone zgodnie z wytycznymi włoskiego Ministerstwa Zdrowia, ustawą 116/92 i Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG.

1. Hodowle komórek monocytowych

1. Hodowla ludzkich komórek THP-1 w kolbach T-75 zawierających pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% surowicą ludzką, 50 U/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny, 0,05 mM β-merkaptoetanolu w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Podziel kultury, gdy zlewają się (co 3-5 dni).

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od Buffy Coats

1. Przed rozpoczęciem protokołu izolacji należy przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,2, 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 5 ml roztworu podstawowego BSA do 95 ml buforu płuczącego (rozcieńczenie 1:20). Odgazuj bufor i utrzymuj go w chłodzie (2-8 °C).
   WAŻNE: Nieodgazowanie bufora może skutkować mniej niż optymalnymi wynikami, ponieważ pęcherzyki mogą zablokować kolumnę izolacyjną (patrz krok 3.2).
   nuta: Alternatywnie można zastosować antykoagulant cytrynianowo-dekstrozę Formula-A (ACD-A) lub dekstrozę fosforanu cytrynianu (CPD). I odwrotnie, inne białka albuminowe lub surowice innych gatunków mogą zastąpić BSA. Nie należy używać zawierających^Ca2+ lub Mg²⁺.
2. Zdobądź kożuchy od zdrowych dawców (w wieku 20-60 lat).
3. Przygotować stożkowe probówki o pojemności 50 ml do wirowania w gradiacji gęstości. Określić liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia krwi (każda probówka może przetworzyć 35 ml rozcieńczonej krwi) i dodać 15 ml Ficoll-Paque do każdej pustej probówki.
4. Rozcieńczyć 8 ml krwi w 24 ml roztworu PBS/BSA/EDTA (rozcieńczenie 1:4).
5. Ostrożnie nałożyć rozcieńczony roztwór na wierzch Ficoll-Paque (gęstość = 1,077 g/ml) w każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Nie mieszać krwi z Ficoll-Paque.
   WAŻNE: Aby uniknąć mieszania się krwi i Ficoll-Paque, trzymaj probówkę pod kątem 45° i powoli nakładaj warstwę mieszaniny krwi.
6. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Komórki jednojądrzaste (MNC) pozostaną na granicy faz osocza-Ficoll-Paque, podczas gdy granulocyty i erytrocyty osadzają się z powodu większej gęstości przy ciśnieniu osmotycznym Ficoll-Paque.
7. Przenieść komórki interfazowe (komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, PBMC) do nowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej PBS/BSA/EDTA i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
8. Przemyć osad dwukrotnie preparatem PBS/BSA/EDTA w celu usunięcia płytek krwi. Wirować w 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
9. Hoduj komórki w kompletnym RPMI-1640 z 10% ludzką surowicą i antybiotykami lub przystąp do oczyszczania monocytów.

3. Oczyszczanie pierwotnych monocytów z PBMC

1. Wyizoluj monocyty z PBMC przez magnetyczną separację kulek przy użyciu zestawu do izolacji monocytów ludzkiego Pana:
   1. Przepuść komórki przez nylonową siatkę o grubości 30 μm (filtry wstępnej separacji, 30 μm), aby usunąć ewentualne grudki komórek.
   2. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
   3. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Całkowicie odessać supernatant.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 30 μl bufora PBS/EDTA/BSA na 10⁷ komórek ogółem.
   5. Dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR na 10 7 komórek.
   6. Dodać 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał na 10⁷ komórek.
   7. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.
   8. Dodać 30 μl buforu na 10⁷ komórek.
   9. Dodaj 20 μl mikrokulek antybiotyny na 10⁷ komórek.
   10. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C.
   11. Ponownie zawiesić do 10⁸ komórek w 500 μl buforu PBS/EDTA/BSA.
2. Separacja magnetyczna
   1. W zależności od całkowitej liczby komórek wybierz odpowiednią kolumnę MACS i separator MACS (zobacz arkusz danych kolumny MACS).
   2. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora MACS.
   3. Przygotować kolumnę przez przepłukanie odpowiednią ilością buforu PBS/EDTA/BSA (kolumny MS: 500 μl; Kolumny LS: 3 ml).
      Uwaga: Kolumny są "zatrzymane przepływem" i nie pracują na sucho.
   4. Nałóż zawieszenie komórek na kolumnę. Zebrać przepływowy zawierający nieznakowane komórki, reprezentujące wzbogaconą frakcję monocytów.
   5. Kolumna płucząca 3x z buforem PBS/EDTA/BSA (500 μl dla MS i 3 ml dla LS na mycie).
   6. Zebrać nieznakowane komórki, które przechodzą, reprezentujące wzbogacone komórki monocytów, i dodać do przepływu z sekcji 3.2.4.
      nuta: Umyć kolumnę, dodając podwielokrotności bufora PBS/EDTA/BSA tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.
   7. (Opcjonalnie) Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej. Odpipetować bufor do kolumny (kolumny MS: 1 ml; Kolumny LS: 5 ml). Natychmiast wypłukać znakowane magnetycznie komórki niemonocytowe, mocno wciskając tłok do kolumny.
   8. Hodowla oczyszczonych monocytów w kompletnym RPMI-1640 z 10% ludzką surowicą i antybiotykami.

4. Oczyszczanie pierwotnych monocytów z krwi pełnej

1. Oczyść monocyty z krwi pełnej za pomocą zestawu do izolacji monocytów krwi pełnej zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Internalizacja nanocząstek w leukocytach krwi i oczyszczonych monocytach

1. Płytka 5 x 10⁵ komórek/ml (1 ml/dołek) wyizolowanych PBMC lub oczyszczonych monocytów CD14-dodatnich na 12-dołkowej płytce.
2. Wirować roztwór podstawowy nanocząstek FITC-SiO₂ i ponownie zawiesić w kompletnym podłożu do stężenia roboczego 100 nM.
3. Dodać 10 μl roboczej zawiesiny nanocząstek (100 nM) dla próbek poddanych działaniu substancji, aby osiągnąć końcowe stężenie nanocząstek wynoszące 1 nM. Dodać taką samą objętość kompletnej pożywki dla niepoddanych działaniu substancji kontrolnych do każdej studzienki.
4. Po 1 godzinie internalizacji zebrać próbki w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml i odwirować je przez 3 minuty przy 6 000 x g przy wilgotności względnej.
5. Przepłukać osad 1 ml buforu bieżącego przez 3 minuty przy 6 000 x g przy wilgotności względnej.
6. Zawiesić osad w 200 μl buforu roboczego. Komórki są teraz gotowe do odczytu za pomocą cytometrii przepływowej.

6. Izolacja pierwotnych mieszanych kultur glejowych (patrz Bertero et al.⁷)

7. Powtarzanie mieszanej hodowli komórek glejowych zlewających

się

1. Przemyć kolbę T-75 raz 10 ml PBS (bez Ca²⁺/Mg²⁺), następnie dodać 10 ml Versene i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
2. Kilkakrotnie pipetować supernatant w górę i w dół, aby oderwać komórki od powierzchni T-75 i rozpuścić agregaty komórek.
3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Zbierz niewielką ilość zawiesiny komórkowej, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
4. Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w końcowym stężeniu 5 x 10⁵ komórek/ml w pożywce do kompletnych hodowl glejowych.
6. Umieść 0,5 ml / basenik w 24-dołkowej płytce i pozwól komórkom osiąść na 2-4 godziny przed poddaniem działaniu nanocząstek.

8. Internalizacja nanocząstek w mikrogleju

1. Dodać 500 μl kompletnej pożywki do hodowli glejowej (dla kontroli niepoddanych działaniu substancji) lub 500 μl 2x zawiesiny nanocząstek rodaminy-SiO₂ w kompletnej pożywce do hodowli glejowej (dla próbek poddanych działaniu substancji) do każdej studzienki.
2. Odpipetować komórki, aby umożliwić oderwanie się szybko przylegających komórek w wybranych punktach czasowych i zebrać je w probówkach polipropylenowych o pojemności 2 ml.
3. Dodać 500 μl versenu do każdego dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut, następnie odłączyć pozostałą frakcję komórkową i zebrać każdą próbkę z odpowiednimi komórkami nieprzylegającymi z poprzedniego etapu.
4. Odwirowywać próbki przez 3 minuty przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
5. Zawiesić osad w 100 μl bufora AutoMACS Running.

9. Barwienie za pomocą CD11b-VioBlue

1. Dodać 10 μl ludzko-mysiego przeciwciała VioBlue-CD11b do 100 μl zawiesiny komórkowej (w stosunku 1:11) w buforze do pracy i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
2. Dodać 1 ml bieżącego buforu i wymieszać zawiesinę komórkową.
3. Odwirować każdą próbkę przez 3 minuty przy 300 x g.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100-150 μl buforu bieżącego.
5. Odczytać próbki do cytometru (przechowywać próbki w temperaturze 4 °C między dwoma ostatnimi etapami).
   WAŻNE: przed analizą próbek należy przystąpić do kompensacji nakładających się sygnałów w widmach emisyjnych obserwowanych między różnymi fluorochromami (nanocząstkami lub przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem).

10. Kompensacja spektralna

1. Otwórz okno "Ustawienia urządzenia" (obecne we wszystkich programach przyrządu).
   nuta: W przypadku korzystania z innego instrumentu niż podany w tabeli materiałów, należy zapoznać się z instrukcją obsługi konkretnego instrumentu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat nabycia.
2. Pobrać próbkę niepoddaną działaniu substancji (bez nanocząstek) przy niskiej prędkości przepływu (jeśli zezwala na to urządzenie). Podczas akwizycji należy ręcznie wyregulować rozpraszanie do przodu i na boki (odpowiednio FSC i SSC), regulując kanały napięcia.
   nuta: Zmodyfikuj skale osi SSC i FSC, aby jak najlepiej zobrazować całą populację komórek na wykresie. Szablon ustawień instrumentu dla każdego typu komórki zainteresowania może być utworzony, zapisany i wykorzystany do przyszłych przejęć.
3. Otwórz odpowiednią zakładkę "region" w oprogramowaniu. Narysuj odpowiedni duży region ("bramę") wokół żądanej populacji.
   nuta: Internalizacja nanocząstek indukuje przesunięcie komórek w SSC. Jeśli bramka jest zbyt ściśle ograniczona wokół populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, uzyskane dane prawdopodobnie pominą część komórek, które mają zostać wykryte.
4. Należy użyć dwóch niebarwionych próbek, jednej do użycia jako próbka ślepa, a drugiej do kompensacji barwienia PI (opcjonalnie), jednej pojedynczej próbki barwionej z odpowiednim fluorochromem dla każdego kanału fluorescencji, który ma być poddany kompensacji.
   nuta: Użyj innej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, które ma być użyte w znakowaniu eksperymentu.
5. Otwórz zakładkę "Kompensacja" w polu "Ustawienia instrumentu". Zwiększ lub zmniejsz współczynnik kompensacji podczas akwizycji, aż intensywność fluorescencji w kanale rozlewowym będzie mniej więcej taka sama dla populacji fluorochromu dodatniego i ujemnego.
6. Pobieraj próbki poddane działaniu nanocząstek po dostosowaniu kompensacji.

Wyniki

Cytometria przepływowa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji i charakterystyki różnych komórek i jest techniką z wyboru do identyfikacji konkretnych komórek odpornościowych, takich jak monocyty, granulocyty, limfocyty T, limfocyty B, komórki NK (natural killer), komórki dendrytyczne (DC) i inne subpopulacje leukocytów.

W celu lepszego scharakteryzowania zachowania białych krwinek w odpowiedzi na nanocząsteczki, przeprowadziliśmy testy internalizacji z pierwotnymi leukocytami wyizolowanymi z krwi zdrowych dawców (Ryc. 1 i 2) oraz z ludzką linią komórkową monocytów (komórki THP-1, Ryc. 3).

Jak podano na rysunku 1A, trzy główne subpopulacje leukocytów krwi zostały wyraźnie zidentyfikowane przez rozpraszanie do przodu i na bok po izolacji PBMCs. Ponadto, po leczeniu FITC-SiO₂, limfocyty (szare), monocyty (niebieskie) i granulocyty (czerwone) mają różną szybkość internalizacji nanocząstek, o czym świadczy intensywność zielonej fluorescencji (ryc. 1B). Opisany protokół pozwala na oczyszczenie pierwotnych monocytów CD14-dodatnich z PBMC. Rysunek 2A przedstawia wykres punktowy cytometrii przepływowej monocytów CD14 ⁺ w obecności FITC-SiO_2. Rysunek 2B przedstawia internalizację FITC-SiO₂ określoną ilościowo w tych samych komórkach i wyrażoną w histogramie skali logarytmicznej.

Podobne eksperymenty internalizacji przeprowadzono na monocytach THP-1 potraktowanych rosnącym stężeniem nanocząsteczek FITC-SiO₂. Nieleczone komórki wykorzystano jako kontrolę negatywną. Rysunek 3A pokazuje zależny od dawki wzrost rozpraszania bocznego z niezmienionym rozpraszaniem do przodu w linii komórkowej THP-1. Na rysunku 3B, wraz z histogramami SSC i FSC dla każdego badanego stężenia nanocząstek FITC-SiO₂, przedstawiono kwantyfikację średniej intensywności fluorescencji (MFI). Dane te sugerują, że leczenie nanocząstkami FITC-SiO₂ indukuje zależną od dawki internalizację w monocytach, podkreśloną przez zwiększenie ziarnistości wewnątrzkomórkowej (rozpraszanie boczne) i fluorescencji (zielony kanał).

Aby uzyskać więcej informacji na temat rodzaju interakcji między komórkami odpornościowymi a nanocząsteczkami, wyizolowano pierwotne mieszane kultury glejowe i oczyszczono mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym. Wykorzystanie transgenicznego modelu myszy z ekspresją zielonego fluorescencyjnego mikrogleju pozwala na wizualizację różnych mechanizmów neurozapalnych. Transgeniczna mysz B6.129P-CX3CR1 ^tm1Litt/J użyta w tej pracy wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora CX3CR1¹². Po 7 dniach in vitro (DIV) mikroskopia fluorescencyjna pokazuje mieszaną pierwotną hodowlę glejową z dużą liczbą astrocytów (komórki adherentne GFP ujemne) i niektórymi krwinkami zielonymi (GFP dodatni, figura 5A). W tym modelu mysim za pomocą cytometrii przepływowej można wyróżnić trzy subpopulacje glejowe z pojedynczym barwieniem przeciwciał CD11b: pierwsza CD11b-GFP^- (astrocyty i inne komórki glejowe), druga odrębna grupa komórek mikrogleju CD11b ⁺ GFP ⁺ i trzecia subpopulacja CD11b ⁺ GFP^- (Figura 4A). Te dwie ostatnie subpopulacje są w stanie internalizować nanocząstki z nieznacznie zwiększoną wydajnością przez populację GFP⁺ (reprezentującą patrolowanie niedojrzałego mikrogleju przez transkrypcję promotora CX3CR1), jak wykazano w analizie cytometrii przepływowej (Figura 4B). Zaistniałą internalizację można następnie zweryfikować za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu tego samego końcowego stężenia nanocząstek rodaminy-SiO₂, jak pokazano na rysunku 5B.

Rysunek 1. Internalizacja nanocząstek FITC-SiO₂ w izolowanych leukocytach krwi. A) Reprezentatywny wykres punktowy cytometrii przepływowej cytometrii przepływowej z rozpraszaniem do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) izolowanych leukocytów krwi Ficoll-Paque. B) Wykres histogramu zielonej nakładki fluorescencji trzech głównych subpopulacji komórek leukocytów krwi w obecności 1 nM FITC-SiO₂ nanocząstek (+45 mV) przez 1 godzinę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Internalizacja nanocząstek FITC-SiO₂ w oczyszczonych monocytach CD14⁺. A) Reprezentatywne rozpraszanie do przodu (FSC) w porównaniu z rozpraszaniem bocznym (SSC) wykres punktowy cytometrii przepływowej oczyszczonych monocytów CD14-dodatnich. B) Wykres histogramu zielonej fluorescencji oczyszczonej subpopulacji monocytów w obecności nanocząstek 1nM FITC-SiO₂ (+45 mV) przez 1 godzinę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Wpływ internalizacji nanocząstek FITC-SiO₂ na komórki THP-1. A) Reprezentatywne rozpraszanie do przodu (FSC) w porównaniu z rozpraszaniem bocznym (SSC) wykres punktowy cytometrii przepływowej linii komórkowej monocytów THP-1, po 1-godzinnej ekspozycji na nanocząstki FITC-SiO₂ zwiększające stężenie. B) Zależna od stężenia zmienność rozpraszania bocznego (SSC), rozpraszania do przodu (FSC) i zielonej fluorescencji w obecności nanocząstek FITC-SiO₂ (+45 mV) przez 1 godzinę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Internalizacja nanocząstek rodaminy-SiO₂ do pierwotnego mikrogleju wyizolowanego z myszy B6.129P-CX3CR1 ^tm1Litt/J. A) Białko zielonej fluorescencji (GFP) w porównaniu z wykresem punktowym cytometrii przepływowej CD11b-VioBlue pierwotnego mieszanego gleju wyizolowanego z myszy B6.129P-CX3CR1 ^tm1Litt/J. Populacje CD11b⁺GFP⁺ i CD11b⁺GFP^- są pokazane odpowiednio w prawym górnym i prawym dolnym kwadrancie. B) Wykres histogramu czerwonej fluorescencji subpopulacji mikrogleju w obecności 1 nM nanocząstek rodaminy-SiO₂ (+45 mV) przez 30 minut (czerwony histogram) w porównaniu z kontrolą (szary histogram). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wizualizacja GFP⁺-mikrogleju. (A) Mikroskopia fluorescencyjna przy 7 DIV i (B) Mikroskopia konfokalna internalizacji nanocząstek rodaminy-SiO₂ (czerwone strzałki) w GFP⁺-mikrogleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół eksperymentalny przedstawia bardzo istotne punkty, które należy wziąć pod uwagę. Bardzo ważne jest, aby pracować w temperaturze 4 °C (na lodzie) i ewentualnie w ciemności podczas wszystkich etapów barwienia, ponieważ wyższe temperatury i światło mogą negatywnie wpłynąć na wydajność barwienia. Nanocząstki mogą być poddawane sonikacji, aby lepiej zawiesić je tuż przed użyciem.

Prawidłowa analiza cytometrii przepływowej wymaga prawidłowej kalibracji w różnych kanałach. Kalibrację przyrządu należy wykonywać przed każdą sesją eksperymentalną. Oprócz problemów technicznych z oprzyrządowaniem, mogą wystąpić również problemy z etykietowaniem przeciwciał. Obowiązkowe jest stosowanie przeciwciała w odpowiednim stężeniu. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie lub zbyt niskie, konsekwencją może być niezadowalająca intensywność sygnału.

Wady tej techniki dotyczą konieczności pracy z próbkami monodyspersyjnymi, braku możliwości zlokalizowania miejsca pochodzenia sygnału (tj. różnych przedziałów komórkowych). Istnieją również pewne ograniczenia w wyborze fluorochromów, które mają być stosowane łącznie: długość fali wzbudzenia i pasma emisji muszą być wystarczająco oddzielone, aby umożliwić ich właściwy pomiar. Jeśli stosowane widma przeciwciał nakładają się na siebie, wymagana jest prawidłowa kompensacja.

Cytometria przepływowa to potężna metoda analizy komórek w obecności lub bez nanocząstek. Technika ta pozwala na wieloparametryczne badanie komórki, dużą liczbę badanych zdarzeń, szybkość analizy (ponad 1000 komórek/s), odtwarzalność i odczyty statystyczne. Próbki mogą być przetwarzane bez utraty żywotności komórek.

Dzięki zastosowaniu znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek możliwe jest zakwalifikowanie i ilościowe określenie ich internalizacji w subpopulacjach komórek, które są identyfikowane przez specyficzne markery naświetlone na błonie komórkowej. Parametry komórki mogą się zmieniać w obecności określonych nanocząstek. W zależności od celu badań, wariacje te mogą być wykorzystane do identyfikacji konkretnego zjawiska, takiego jak rozpraszanie boczne komórek, które proporcjonalnie wzrasta wraz ze wzrostem szybkości internalizacji nanocząstek.

Modyfikacje powierzchni komórek wywołane przez nanocząstki mogą również stanowić ograniczenie tej techniki. Z tego powodu obrót receptorów błony komórkowej musi być zawsze brany pod uwagę i możliwie znany z wyprzedzeniem, aby precyzyjnie scharakteryzować badaną populację komórek. Ekstremalne upośledzenie osmozy błonowej w próbkach przeciążonych nanocząstkami może prowadzić do śmierci komórki.

Toksyczność zależna od dawki nanomateriałów powinna być badana empirycznie dla każdej populacji komórek. Wyraźnie zdefiniowane martwe komórki muszą być wyłączone z ilościowego oznaczania fluorescencji. Na przykład barwienie aneksyną V / PI jest jedną z kilku metod zwykle stosowanych do wykrywania zarówno komórek martwiczych, jak i apoptotycznych.

Komórki pierwotne wykazujące ekspresję GFP są również potężnym narzędziem do wybierania określonej subpopulacji komórek i zbierania danych bez wstępnego etykietowania. Połączenie z komplementarnymi nanocząstkami fluorescencyjnymi pozwala na bardzo szybkie i precyzyjne określenie ilościowe interakcji komórka-nanocząstka. Uważa się, że dostarczanie leków lub genów zostanie w przyszłości ulepszone dzięki zastosowaniu nanocząstek zdolnych do uwalniania określonego ładunku leku do wybranych tkanek.

Zastosowanie nanocząstek jako specyficznych nośników dostarczania i/lub modulatorów immunologicznych w farmacji wymaga znajomości środowiska biologicznego (np. poprzez cytometrię przepływową) w celu zbadania oddziaływań komórka-nanocząstka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS	Gibco	14170-088	Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
RPMI-1640 (zmodyfikowana ATCC)	Gibco	A10491-01	Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
DMEM, wysoka glukoza, czerwień fenolowa	Gibco	41966-029
Penicylina-Streptomycyna, płyn	Gibco	15140-122
Gentamycyna	Gibco	15710-049
Surowica konia (lot n° 1131917)	Gibco	16050-122
β-merkaptoetanol	Gibco	21985-023
Trypsyna 2,5%	Gibco	15090-046
Ludzkie Wspólne Surowice	Invitrogen	34005100
Versene	Invitrogen	15040-033
DNAza I	Sigma Aldrich	D5025-150KU
CD11b-VioBlue człowiek i mysz	Miltenyi Biotec	130-097-336
MACS BSA Roztwór podstawowy	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Roztwór do płukania	Miltenyi Biotec	130-091-222
Bufor do biegania	Miltenyi Biotec	130-092-747
AutoMACS Bufor do biegania	Miltenyi Biotec	130-091-221
Zestaw do izolacji monocytów ludzkiego Pana	Miltenyi Biotec	130-096-537
Zestaw kolumny krwi pełnej	Miltenyi Biotec	130-093-545
Mikrogranulki CD14 krwi pełnej, ludzkie	Miltenyi Biotec	130-090-879
Kolumna MS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Kolumna LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Separator MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Separator MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
Roztwór do lizy czerwonych krwinek	Miltenyi Biotec	130-094-183
Filtry do wstępnej separacji 30 i mikro; m	Miltenyi Biotec	130-041-407
Cytometr przepływowy MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Kulki kalibracyjne MACSQuant	Miltenyi Biotec	130-093-607
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	GEH17544202
FITC-SiO2 nanocząstki (50 nm, +45 mV)	Firma HiQ-Nano
Nanocząstki rodaminy-SiO2 (50 nm, +45 mV)	HiQ-Nano Company
12-dołkowa płytka Falcon	Becton Dickinson	353043