Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Podsumowanie

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Streszczenie

Testowanie losów embrionalnych lub pluripotencjalnych pochodnych komórek macierzystych w protokołach in vitro doprowadziło do kontrowersyjnych wyników, które niekoniecznie odzwierciedlają ich potencjał in vivo. Najlepiej, aby komórki te zostały umieszczone w odpowiednim środowisku embrionalnym, aby uzyskać określony fenotyp. Co więcej, badania nad śledzeniem linii komórkowych u myszy po znakowaniu komórek barwnikami lub wektorami retrowirusowymi pozostały w większości ograniczone do zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju z wciąż słabo rozwiniętymi narządami. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zaprojektowaliśmy standardowe i ultradźwiękowe protokoły mikroiniekcji do wstrzykiwania różnych środków w docelowe regiony serca u zarodków myszy na E9,5 i późniejszych etapach rozwoju. Eksplantat lub zarodki embrionalne są następnie hodowane lub pozostawiane do dalszego rozwoju w macicy. Czynniki te obejmują barwniki fluorescencyjne, wirusy, shRNA lub komórki progenitorowe pochodzące z komórek macierzystych. Nasze metody pozwalają na zachowanie funkcji narządu przy jednoczesnym monitorowaniu migracji i losu znakowanych i/lub wstrzykiwanych komórek. Technologie te mogą zostać rozszerzone na inne narządy i będą bardzo pomocne w rozwiązywaniu kluczowych problemów biologicznych w biologii rozwoju.

Wprowadzenie

Ponad dziesięć lat temu, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (HuESC) pochodziły z ludzkich blastocyst¹. Od tego czasu komórki te stały się przedmiotem ważnej dziedziny badań, która odpowiada na nierozwiązane pytania w biologii rozwoju człowieka. Co więcej, badania HuESC dają nadzieję medycynie regeneracyjnej. W ostatnich latach ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zostały wygenerowane z komórek somatycznych specyficznych dla pacjenta, dostarczając modeli chorób genetycznych². Opisano wiele protokołów in vitro różnicowania embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku różnych linii komórkowych, w tym linii serca³. Zróżnicowane komórki są często fenotypowane poprzez analizę ekspresji RNA i białek, barwienie immunologiczne i/lub testy funkcjonalne in vitro. Jednak pluripotencjalne pochodne komórek macierzystych muszą zostać umieszczone w odpowiednim środowisku embrionalnym, aby sprawdzić, czy w pełni przejmują los komórkowy swojego embrionalnego odpowiednika i czy podsumowują prawdziwą funkcję in vivo w odpowiedzi na sygnały regionalne. Chociaż inżynieria tkankowa jest obiecująca, nie dostarcza jeszcze wszystkich znanych i nieznanych wskazówek dotyczących prawidłowego rozwoju tkanki embrionalnej in vivo ^4,5.

Znakowanie komórek za pomocą barwników lub wektorów retrowirusowych w embrionach, w tym embrionach myszy, przyniosło ważne informacje na temat embrionalnego pochodzenia linii komórkowych podczas rozwoju serca⁶. Na przykład wstrzyknięcie barwnika do przestrzeni osierdzia zarodków myszy ex vivo, a następnie hodowla in vitro izolowanych serc, zastosowano do znakowania komórek nasierdzia i ich potomków⁷. Jednak znakowanie barwnikami i komórkami retrowirusowymi stosuje się głównie do wczesnych zarodków myszy z wciąż słabo rozwiniętymi narządami lub zarodków kurzych, które są łatwiej dostępne⁸. Wyjątkiem jest mózg, który jest łatwiejszy do namierzenia w zarodkach^9,10. Takie podejście nie zostało jeszcze zastosowane do bijącego embrionalnego serca myszy.

Aby uzupełnić bezpośrednie znakowanie barwnikami lub wirusem i przeprowadzić śledzenie linii u bardziej zaawansowanych zarodków myszy i dorosłych myszy, podejście do znakowania komórek zostało połączone z analizą myszy transgenicznych przy użyciu technologii Cre/Lox. Podejście Cre/Lox¹¹ ma jednak pewne ograniczenia ze względu na czasoprzestrzenną specyficzność genomowych regionów regulatorowych wykorzystywanych do kierowania ekspresją rekombinazy oraz skuteczność rekombinacji Cre/Lox¹². Co więcej, podejście to nie rozwiązuje w pełni konkretnych kwestii związanych z nabywaniem losu komórkowego przez migrację komórek, ponieważ może ono oznaczać prekursor dopiero po aktywacji regionu regulatorowego używanego do napędzania ekspresji Cre. Nie może ona również mieć zastosowania do embrionów ludzkich z oczywistych względów etycznych.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia, zaprojektowaliśmy serię nowych protokołów do wstrzykiwania różnych środków znakujących komórki, takich jak barwniki fluorescencyjne, wirusy, modulatory ekspresji genów, takie jak shRNA i wektory znakowania komórek oparte na DNA, lub komórki w zarodku myszy na E9.5 i późniejszych etapach rozwoju w docelowych regionach serca.

Zastrzyki DNA/komórek wykorzystują stereomikroskop i proste urządzenie do mikroiniekcji w połączeniu z hodowlą zarodków ex vivo do 48 godzin, lub izolowaną hodowlą eksplantatów serca lub embrionu przez 48-72 godziny. Informujemy również o protokole mikroiniekcji za pośrednictwem ultradźwięków w embrionalnych sercach myszy w macicy. Technika ta umożliwia monitorowanie rozwoju zarodków¹³ i pozwala na długoterminową obserwację wstrzykniętych i/lub znakowanych komórek.

Stwierdziliśmy, że te podejścia zachowują funkcję narządu i zapewniają bardziej reprezentatywne środowisko niż badania potencjału komórek macierzystych in vitro. Daje również możliwość śledzenia migracji znakowanych i/lub wstrzykiwanych komórek w celu monitorowania ich losu. Ostatecznie powinno to pozwolić na lepsze zrozumienie regionalnych wzorców tkanek i kluczowych procesów biologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie

Procedury na zwierzętach

Uzyskaj zgodę komisji etyki zwierząt i postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi pracy z wirusem, HuESC i/lub iPSC (jeśli dotyczy), a także obchodzenia się z myszami, pozyskiwania mysich zarodków i przeprowadzania operacji na myszach. W przypadku krycia w określonym czasie dzień czopa jest uważany za dzień embrionalny (E) 0,5 / 0,5 dnia po stosunku.

1. Igły do mikroiniekcji:
   W przypadku mikroiniekcji ex utero należy wyciągnąć szklane pipety (borokrzemianowe rurki kapilarne o średnicy zewnętrznej 1,2 mm) za pomocą ściągacza/ukosowarki do pipet, aby uzyskać wewnętrzną średnicę końcówki 1 lub 10 μm oraz ostrą i stożkową końcówkę do wstrzykiwania odpowiednio DNA lub komórek. Do wstrzykiwań za pośrednictwem ultradźwięków należy używać niestandardowych sterylnych igieł, które mają średnicę zewnętrzną/wewnętrzną (OD/ID) 1,14 mm/0,53 mm, z końcówką OD/ID 50/35 μm.
2. Wypełnione krzemem szalki Petriego:
   Przygotuj silikon zgodnie z opisem w instrukcji. Napełnij czystą szklaną szalkę Petriego o średnicy 60 mm warstwą elastomeru o grubości ~1 cm. Unikaj pęcherzyków powietrza.
3. Instrumenty:
   Utrzymuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylnym stanie przed zabiegiem i w jego trakcie.
4. Przygotowanie DNA:
   Dodać 3 μg DNA i 12 μl Opti-MEM w jednej probówce. Dodać 3 μl Lipofectamine 2000 i 12 μl Opti-MEM do innej probówki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wymieszać oba roztwory. Zużyć natychmiast.
5. Przygotowanie komórek:
   Przygotować zawiesinę 10⁶ komórek/ml DMEM (Dulbecco's Eagle Medium, wysoka glukoza i 50% surowica szczurów). 50 μl końcowej zawiesiny komórek wystarcza na 8-10 zarodków.
6. Przygotowanie barwnika:
   Użyj zielonej fluorescencji CDCFDA-SE o stężeniu 25 mg/ml DMSO. Przygotować 20 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć w stosunku 1:100/1:200 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub PBS.
7. Przygotowanie wirusa:
   Użyj komercyjnego lentiwirusa 3^generacji z ekspresją PGK-GFP o mianie ~10 9-10 ¹⁰ jednostek transdukcyjnych/ml DMEM. Aby uzyskać informacje na temat przygotowania lentiwirusa, patrz Tiscornia i wsp.¹⁴ Nosić środki ochrony osobistej oraz bezpiecznie używać i usuwać wirusa.

2. Pobieranie zarodków E9.5 i E10.5 do iniekcji ex vivo

1. Eutanazja ciężarnej myszy w 9,5 lub 10,5 dniu embrionalnym.
2. Wysterylizuj klatkę piersiową i brzuch myszy 70% etanolem.
3. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej, aby otworzyć jamę brzuszną i odzyskać róg macicy w RT w PBS i przenieś go po dwóch płukaniach PBS na wypełnioną silikonem szalkę Petriego z podłożem M16.
4. Przypnij róg macicy za pomocą szpilek przeciw owadom do warstwy silikonu tak, aby unaczyniona strona macicy znajdowała się na dole.
5. Przetnij powierzchnię macicy drobnymi kleszczami i nasadką decidua 1 mm poniżej powierzchni.
6. Delikatnie odzyskaj zarodek w woreczku żółtkowym, rozkładając ścianki decidua.
7. Przechowywać zarodki w temperaturze 37 °C w pożywce M16 przed wstrzyknięciem komórek. Do wstrzyknięcia każdy zarodek przenosi się do silikonowego naczynia wypełnionego pożywką M16 podgrzaną w temperaturze 37 °C.

3. Wstrzyknięcie DNA lub komórki pod mikroskopem stereoskopowym

1. Napełnij szklaną pipetę od tyłu strzykawką Hamiltona i potrząśnij pipetą, aby usunąć pęcherzyki na końcówce.
2. Ustawić pipetę na uchwycie do mikroiniekcji, ustawić ciśnienie trzymania na 50 (DNA) lub 30 (komórki) hPa, a ciśnienie wtrysku na 150 (DNA) do 300 (komórki) hPa. Ustaw czas wstrzyknięcia na 0,2 sekundy (DNA) lub 0,5 sekundy (komórki). Ustawienia te mogą się nieznacznie różnić w zależności od typu mikroiniektora i pipety.
3. Przypnij zarodek do silikonowego dna przez woreczek żółtkowy, nie dotykając właściwego zarodka. Obserwuj obszar serca i otwórz worek tuż nad tym obszarem.
4. Dodaj 4 szpilki wokół zarodka, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas wstrzykiwania komórek.
5. Za pomocą mikromanipulatora (ustawionego na ręczny) powoli ustawić końcówkę pipety pod kątem 45° nad osierdziem, tuż nad obszarem serca, który ma zostać wstrzyknięty (Rysunek 1).
6. Przesunąć pipetę w obszar zainteresowania i uruchomić wstrzyknięcie. Wyjmij pipetę tak szybko, jak to możliwe. Upewnij się, że serce bije prawidłowo po wstrzyknięciu DNA/komórki.

4. Hodowla zarodków, izolowanych serc i eksplantatów

1. Hodowla zarodków E9,5 w 25% M2 pożywce i 75% surowicy szczurzej, uzupełnionej penicyliną/streptomycyną, wstępnie ogrzanych w temperaturze 37 °C i natlenionych 40%_O2.
2. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do szklanej probówki o pojemności 25 ml, delikatnie dodać zarodek i natlenić 40%_O2 przed nakręceniem nakrętki na probówkę. Inkubować do 36 godzin w temperaturze 37 °C, obracając lub wytrząsając (30 obrotów/min).
3. W pożądanym momencie (np. 24 godziny) należy dokładnie wyciąć serca cienkimi kleszczami, nie dotykając serc, najpierw odcinając głowy zarodkom; serce można łatwo wyciąć, wyciągając je za pomocą dystalnej drogi odpływu.
4. Hoduj izolowane serce przez kolejne 36-48 godzin w DMEM z 50% FCS na wkładce pokrytej Matrigelem umieszczonej w 12-dołkowej płytce. Zobacz Dyer & Patterson (2013) dla ulepszonego protokołu posiewu serca¹⁵.
5. Wykonaj dowolny eksplantat z interesującego Cię regionu. Na przykład wypreparuj kanał przedsionkowo-komorowy (AVC) i hoduj go przez 48 godzin na żelu kolagenowym^{typu 16}.

5. Iniekcja pod kontrolą USG w serce w macicy

1. Konfiguracja ultrasonografu i mikrowtryskiwacza:
   1. Użyj systemu ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości z przetwornikiem 40 MHz i zestawem do mikroiniekcji na szynie.
   2. Ustawić objętość wstrzykniętego wtrysku na mikrowstrzykiwaczu na 69 nl na wstrzyknięcie. Zapoznaj się z instrukcją producenta mikroiniekcji, aby zapoznać się z instrukcją mikrowtryskiwacza.
2. Przygotowanie zestawu do mikroiniekcji i iniekcja:
   1. Umieścić szklaną mikropipetę w mikrowstrzykiwaczu. Aby zapewnić skuteczne wstrzykiwanie, należy najpierw pokryć wewnętrzną stronę pipety olejem mineralnym, zasysając do maksymalnej objętości. Następnie ponownie wysuń olej, pozostawiając 1-2 mm oleju wewnątrz igły.
   2. Wstrzykniętą iniekcję należy odsysać aż do osiągnięcia maksymalnej objętości. Należy uważać, aby nie dotknąć końcówką igły żadnych powierzchni, ponieważ może to spowodować stępienie końcówki i utrudnienie wstrzyknięcia.
   3. Aby ustabilizować róg macicy zawierający zarodki podczas wstrzyknięcia, należy użyć zmodyfikowanej szalki Petriego z otworem pośrodku (o średnicy 2,5 cm), pokrytej cienką silikonową membraną z małą szczeliną wyciętą pośrodku, i umieścić ją powyżej miejsca nacięcia. Ustabilizuj szalkę Petriego na stole do obsługi myszy, umieszczając 3-4 grudki gliny pod krawędziami naczynia.
3. Procedura iniekcji:
   1. Ogol brzuch ciężarnej myszy (w pożądanym stadium embrionalnym) przed znieczuleniem w celu usunięcia włosów. Potraktuj brzuch chemicznym środkiem do usuwania włosów, aby usunąć resztki włosów i wysterylizuj 70% etanolem.
   2. Znieczulij ciężarną mysz tlenem/izofluranem za pomocą maski na twarz. Użyj 3-5% izofluranu w 100% tlenu do wstępnego znieczulenia, a następnie 1-1,5% podczas pozostałej części zabiegu. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, delikatnie szczypiąc jej łapy i/lub ogon.
   3. Umieść mysz na wznak na stole do obsługi myszy (ustawionym na podgrzanie do 37 °C) i przykryj oczy smarem, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
   4. Nałóż żel elektrodowy na elektrody i przyklej łapy do elektrod, aby monitorować tętno, częstość oddechów i EKG. Ustaw termometr doodbytniczy do monitorowania temperatury ciała.
   5. Sprawdź najpierw, czy mysz jest w ciąży, wizualizując i licząc zarodki za pomocą ultradźwięków. Nałóż żel ultradźwiękowy na brzuch i umieść głowicę skanującą nad pęcherzem. Aby zachować spójność, najpierw uwidocznij pęcherz moczowy i policz zarodki w lewym i prawym rogu macicy, zaczynając od pozycji pęcherza. Upewnij się, że serca embrionalne biją normalnie.
   6. Jeśli mysz jest w ciąży, umieść szalkę Petriego nad przyszłym miejscem nacięcia gliną. Lekko dociśnij naczynie do brzucha, tak aby naczynie miało bezpośredni kontakt.
   7. Wyjmij naczynie i ponownie wysterylizuj brzuch. Wykonaj 1,5-2 cm brzuszne nacięcie linii środkowej, około 0,75-1 cm powyżej pochwy, aby otworzyć brzuch i otrzewną. Unikaj obrażeń narządów wewnętrznych.
   8. Zewnętrzizuj lewy lub prawy róg macicy za pomocą kleszczy, delikatnie przeciągnij go przez silikonową membranę naczynia i ponownie ustabilizuj naczynie na glinie. Należy unikać intensywnego ciągnięcia lub manipulacji, ponieważ może to spowodować krwawienie z naczyń macicy i przedwczesną śmierć samicy i/lub zarodków.
   9. Należy ponownie policzyć zarodki, aby zapewnić odpowiednie prowadzenie dokumentacji dotyczącej tego, które zarodki zostały wstrzyknięte.
   10. Nałóż żel ultradźwiękowy na rogi macicy, aby zobrazować serce i zapobiec odwodnieniu.
   11. Wyobraź sobie pierwszy zarodek, który ma zostać wstrzyknięty. Sprawdzaj normalne bicie serca embrionalnego i prowadź zapisy orientacji czaszkowo-ogonowej i lewo-prawo zarodka. W razie potrzeby nieznacznie zmień położenie rogu macicy, aby zapewnić prawidłową orientację. Jeśli okaże się to trudne, przejdź do następnego zarodka.
   12. Ostrożnie nakłuć macicę igłą do mikroiniekcji, aby ustawić igłę pod kątem 45° nad zarodkiem, nieco poza osierdziem (ryc. 3). W celu znakowania komórek nasierdzia należy zobrazować serce w widoku czterokomorowym i ustawić igłę tak, aby była skierowana w stronę rowka przedsionkowo-komorowego (ryc. 3). Jeśli kąt wymaga regulacji, wyciągnij igłę i zmień położenie. Nie należy regulować kąta z igłą wewnątrz macicy, ponieważ może to spowodować złamanie igły. Unikaj nakłuwania innych tkanek, takich jak kończyny lub łożysko.
   13. Przyłóż igłę do ściany osierdzia i nakłuj ją delikatnym, ale szybkim ruchem. Ogólnie rzecz biorąc, będzie pewien opór, ale zbyt szybkie przesuwanie igły może spowodować, że końcówka igły przebije samo serce. Końcówka powinna kończyć się w przestrzeni osierdziowej rowka przedsionkowo-komorowego. W przypadku krwawienia z osierdzia komórki krwi będą widoczne jako biały wzór przypominający śnieg. W takim przypadku należy przerwać wstrzykiwanie zarodka i przejść do innego zarodka.
   14. Wstrzyknąć wstrzykiwany. Wstrzyknąć maksymalnie 700 nl do przestrzeni osierdziowej, aby zapobiec niekorzystnemu wpływowi na rozwój serca. Należy monitorować prawidłowe wstrzyknięcie przez niewielki, skroniowy obrzęk worka osierdziowego.
   15. Po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i upewnić się, że wstrzyknięty materiał może zostać wyrzucony, aby upewnić się, że igła nie została zatkana przez fragmenty tkanki.
   16. Zmień położenie stołu manipulacyjnego, aby zobrazować i wstrzyknąć następny zarodek. Liczbę wstrzykiwanych zarodków należy utrzymywać maksymalnie 3-4 (w jednym rogu macicy), aby zapobiec przedłużonemu znieczuleniu, umożliwić kontrolę zarodków w przeciwległym rogu macicy oraz zapewnić, że zabieg nie zaburzy rozwoju zarodka.
   17. Po wstrzyknięciu pożądanej liczby zarodków należy usunąć nadmiar żelu do ultradźwięków i delikatnie umieścić róg macicy z powrotem w jamie brzusznej we właściwej pozycji.
   18. Zamknij brzuch matki, używając jednej warstwy szwu na otrzewną i mięśnie brzucha, a drugiej warstwy szwu na skórę.
   19. Wstrzyknij myszy pierwszą dawkę leku przeciwbólowego. Należy zastosować jedno wstrzyknięcie 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny na 15 minut przed zakończeniem znieczulenia i trzy dodatkowe wstrzyknięcia w odstępach 12-godzinnych.
   20. Przerwij znieczulenie i monitoruj mysz pod kątem odpowiedniej rekonwalescencji po zabiegu. Umieść ciężarną mysz w osobnej klatce na żądany czas obserwacji.

Wyniki

Korzystając z opisanych powyżej protokołów iniekcji, komórki mogą być znakowane i/lub wstrzykiwane do embrionalnego serca myszy. Jako dowód słuszności koncepcji pokazano kilka przykładów, w których połączono protokół wstrzyknięcia i eksplantat ex vivo AVC, izolowane serce lub całą hodowlę zarodków (ryc. 1).

Rysunek 1 pokazuje przygotowanie zarodka przed wstrzyknięciem komórki. Zarodek E9.5 jest usuwany z jego decidua przy zachowaniu integralności wore...

Dyskusja

Opisane powyżej protokoły wstrzyknięć ex vivo do serca mają na celu zachowanie funkcji mięśnia sercowego przez co najmniej 48 godzin w zarodkach myszy w średnim stadium (E9.5-E11.5). Te metody iniekcji pozwalają na przestrzennie ukierunkowane wstrzykiwanie DNA lub komórek. Kilka przykładów pokazanych na rysunkach 1-3 stanowi dowód słuszności koncepcji nakreślenia ex vivo i in vivo molekularnych mechanizmów procesów rozwojowych, które zachodzą w ograniczonych regionach serca, ta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Konfiguracje/Sprzęt
40 MHz Przetwornik	VisualSonics	MS550S
Mikrowtryskiwacz	VisualSonics
Mikromanipulator	Eppendorf	5242
	Eppendorf	5171
Azot			wymagany do zwiększenia ciśnienia w wtryskiwaczu
System szynowy	Rotator
	do obracania szklanej rurki z zarodkami wewnątrz inkubatora Standardowy
			C
stereoskopowy	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
borokrzemianowe rurki kapilarne	Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μ m średnica zewnętrzna
Ściągacz do pipet	Sutter	Model P87
Igły do mikroiniekcji	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1,14 mm/53 mm, z 50/35 μ m Końcówka OD/ID
Strzykawki Hamilton
szalki			o średnicy 10 cm
Olej mineralny	Sigma	M8410
Membrana silikonowa	Visualsonics		4,3 x 4,3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
środek do usuwania włosów	Nair
Lubrykant do oczu	Optixcare	31779
Żel do elektrod (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Żel do ultradźwięków	Aquasonic
Buprenex Buprenex (chlorowodorek buprenorfiny)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0,05-0,1 mg/kg w soli fizjologicznej
Inne
elastomer silikonowy	Dow Corning	Sylgard 184
Szklane pestki	Fine Science Tools		o średnicy 60 mm
Szpilki do owadów	Fine Science Tools	26002-20
Odczynniki do pożywek i kultur
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 średni	Sigma	M7167
Dulbecco' s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	wysoka glukoza i 50% surowica szczura
M16 średnia	Sigma	M7292
Surowica szczura	Janvier	ODI 7158
Pennicylina/streptomycyna	Life Technologies	15140-12
tlen 40%	Ciecz		wymagana do natlenienia pożywki hodowlanej zarodka
Surowica	cielęca płoduFisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Kolagen typu I	BD	354236	do powlekania naczyń hodowlanych do hodowli eksplantatów
Naczynia hodowlane	Holender /Pomarańczowy	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Sondy invitrogenowe/molekularne	C1165	25 mg/ml DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć 1:100-200 w soli fizjologicznej.
lentiwirus wykazujący ekspresję PGK-GFP			~ 8E9 jednostek przetwornikowych / ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019