Artykuł metodologiczny

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

DOI:

10.3791/51390

⸱

22 września 2014

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implantacja biogramu do leczenia zawału mięśnia sercowego wywołanego podwiązaniem LAD w modelu gryzoni tradycyjnie wymagała dwóch operacji na otwartym sercu. W celu zmniejszenia śmiertelności i zapewnienia optymalnych warunków do utrwalania stałych i galaretowatych biomatryc związanych z komórkami, opracowano procedury małoinwazyjne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkowa serca zyskała coraz większe zainteresowanie, a wszczepianie biomateriałów związanych z komórkami stało się głównym problemem w celu optymalizacji dostarczania komórek mięśnia sercowego. Model zawału mięśnia sercowego (MI) u gryzoni składający się z podwiązania lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) był zwykle wykonywany za pomocą torakotomii; Druga operacja na otwartym sercu poprzez sternotomię jest tradycyjnie wykonywana w celu nasierdziowego zastosowania zabiegu. Od czasu opisania modelu podwiązania LAD śmiertelność pooperacyjna spadła z 35-13%, jednak druga operacja pozostała krytyczna. W celu poprawy rekonwalescencji pooperacyjnej oraz zmniejszenia bólu i infekcji przedstawiono małoinwazyjne zabiegi chirurgiczne. Wykonano dwie torakotomie, pierwszą do podwiązania LAD, a drugą do leczenia nasierdzia. Na obszar zawału nałożono bioleki składające się z komórek związanych z matrycami typu stałego lub żelowego. Podwiązanie LAD spowodowało utratę funkcji serca, co potwierdziła echokardiografia wykonana po 2 i 6 tygodniach. Barwienie trichromowe Goldnera przeprowadzone na wycinkach serca potwierdziło powstawanie blizn przezściennych. Pierwsza i druga operacja spowodowały mniej niż 10% śmiertelności pooperacyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od końcaXIX wieku, choroby układu krążenia pozostają numerem jeden wśród seryjnych morderców w krajach uprzemysłowionych. Wśród nich główną etiologię stanowi choroba wieńcowa. Ostra faza prowadzi do zawału mięśnia sercowego (MI), po którym następuje nieadaptacyjna przebudowa, która stopniowo rozwija się w kierunku fazy przewlekłej i ciężkiej niewydolności serca. Pomimo ostatnich znaczących postępów technologicznych i terapeutycznych, zachorowalność i śmiertelność z powodu progresji niewydolności serca wciąż rośnie1. W tym kontekście terapia komórkowa cieszy się coraz większym zainteresowaniem jako nowa opcja terapeutyczna mająca na celu zatrzymanie postępu choroby w kierunku niewydolności serca i stymulowanie niedawno zidentyfikowanej zdolności regeneracyjnej mięśnia sercowego. Badania eksperymentalne i kliniczne dostarczyły przekonujących dowodów na korzystne efekty uzyskiwane po przeszczepieniu serca różnych typów komórek. Główne wyniki obejmowały poprawę funkcji skurczowej serca, zmniejszenie przebudowy lewej komory, zmniejszenie rozmiaru zawału i zwiększenie gęstości naczyń w obszarze zawału. Jednak niska retencja liczby komórek po wstrzyknięciu komórek pozostała istotną wadą. Powiązanie komórek z biomatrycą w celu poprawy dostarczania komórek2 przyczyniło się ostatnio do rozwoju zainteresowań badawczych i klinicznych.

Podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) jest metodą referencyjną dla MI w małym modelu zwierzęcym, która skutkuje przezściennym zawałem i dojrzałą blizną. Terapia komórkowa stosowana w przewlekłej fazie zawału mięśnia sercowego wymaga drugiej interwencji chirurgicznej. Środkowa sternotomia jest zwykle wykonywana, aby umożliwić wstrzyknięcie komórek do mięśnia sercowego lub implantację nasierdzia biorentów. Takie inwazyjne zabiegi chirurgiczne zwiększają śmiertelność, czas rekonwalescencji pooperacyjnej, ból i ryzyko infekcji. Przedstawione tutaj minimalnie inwazyjne podejście nie tylko zapobiega takim odchyleniom, ale także zapewnia optymalną dostępność serca do zastosowania w leczeniu. Implantacja mięśnia sercowego i nasierdzia komórek związanych z biomatrycą typu żelowego jest wykonywana na bijącym sercu za pomocą torakotomii międzyżebrowej lewej strony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Samce i samice szczurów Lewis, 200-220 g były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych (12-godzinny cykl światła i ciemności, woda i jedzenie ad libitum, klatka IVC). Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z zaleceniami FELASA i szwajcarskiej ustawy o ochronie zwierząt.

1. Przygotowanie komórek: Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego

  1. Znieczulić szczury izofluranem 5% i O2 5 l/min w komorze indukcyjnej przez 5 minut. Umieść pysk zwierzęcia w stożku nosowym podłączonym do systemu znieczulającego. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację.
  2. Usuń skórę z nogi nożyczkami, przecinając skórę od kostki do biodra. Usuń mięśnie i przetnij tętnicę udową w celu wykrwawienia zwierzęcia. Odsłoń staw biodrowy i zwichnij głowę kości udowej. Ważne jest, aby nie uszkodzić głowy kości udowej. Umieść kości w sterylnym PBS w plastikowej tubie o pojemności 50 ml.
  3. Usuń wszystkie mięśnie i więzadła z kości, nie łamiąc ich. UWAGA: Ważne jest, aby kość pozostała nienaruszona, aby uniknąć połączenia roztworu płuczącego lub zanieczyszczenia etanolem. Opłucz obrane kości w 70% etanolu przez 5 min.
  4. Pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym odetnij oba końce kości nożyczkami. Przepłukać szpik kostny, wstrzykując sterylny PBS z kończyny kostnej. Pobrać szpik do probówki o pojemności 15 ml. Wirować 7 min przy 300 x g.
  5. Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie wirować przez 7 minut w temperaturze 300 x g. Do kolby hodowlanej o pojemności 150 ml dodać sterylną pożywkę do hodowli komórkowych (395 ml pożywki IMDM, 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca, 100 ml FBS) i zasiać komórki.
  6. Zmień pożywkę na drugi dzień, aby usunąć nieprzylegające komórki.
    1. Wykonuj zmiany pożywki co drugi dzień przez 2-3 tygodnie, aż do uzyskania pożądanej ilości komórek.
    2. Alternatywnie, przygotuj biograft, umieszczając komórki na stałej matrycy w razie potrzeby i opisanej w innym miejscu3.
  7. W dniu implantacji serca należy przygotować komórki lub pobrać biogram tuż przed aplikacją nasierdzia.
    1. Zebrać komórki za pomocą roztworu do odrywania komórek Accutase. Policz komórki. Napełnij probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml objętością zawiesiny komórek obliczoną w celu uzyskania pożądanej ilości komórek. Wirować przez 7 minut przy 300 x g i usunąć supernatant.
    2. Alternatywnie, należy zebrać biograft z pożywki do hodowli komórkowych, wypłukać w sterylnym PBS i przechowywać w świeżej pożywce hodowlanej bez surowicy.

2. Pierwsza torakotomia i podwiązanie LAD

  1. Zważ szczura. Włączyć poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C. Znieczulić szczura 5% izofluranem i 5 l/min 100%O2 w komorze indukcyjnej przez 5-7 minut. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację. Umieść szczura na poduszce grzewczej.
  2. Zaintubować zwierzę za pomocą cewnika dożylnego o stężeniu 14 g. Podłączyć cewnik intubacyjny do respiratora dla gryzoni zaprogramowanego na 2,5 l/min tlenu, 2,5% izofluranu, objętość oddechową 2 ml i częstotliwość oddychania 90 oddechów/min.
  3. Przygotować roztwór buprenorfiny w stężeniu 0,1 mg/kg. Wstrzyknąć podskórnie jedną trzecią roztworu. Ogol lewą część klatki piersiowej. Zdezynfekować 1% roztworem betadyny.
  4. Naciąć skórę prostopadle do mostka w czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Oddziel 3 warstwy mięśnia piersiowego (mięsień piersiowy większy, rosnący mięsień piersiowy i zewnętrzny skośny mięsień piersiowy). Otwórz czwartą przestrzeń międzyżebrową (między żebrami 4 i 5).
  5. Użyj małego retraktora, aby rozłożyć żebra i odsłonić serce. Ostrożnie otwórz osierdzie. Zlokalizuj i podwiązaj lewą przednią zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) za pomocą szwu 7,0 4 mm poniżej przedsionka.
  6. Zamknij przestrzeń międzyżebrową dwoma szwami za pomocą szwów 3,0. Ustaw oba szwy proksymalnie i dystalnie od mostka. Najpierw dokręć szew dystalny. Zaciśnij rurkę odprowadzającą wentylator na 2 sekundy, aby napompować klatkę piersiową i uniknąć odmy opłucnowej. Dokręć drugi szew. Ułóż warstwy mięśni z powrotem na miejscu (nie są potrzebne szwy). Zamknij skórę szwem 5.0.
  7. Zdezynfekuj szew 1% roztworem betadyny. Wstrzyknąć pozostałą część roztworu buprenorfiny. Wyłącz system znieczulający. Usunąć cewnik do intubacji.
  8. Trzymaj szczura w klatce pod ciepłą lampą przez 1-2 godziny. Trzymaj termometr w klatce i kontroluj odległość między ciepłą lampą a klatką, aby uniknąć przegrzania. Zwróć szczura do jednostki IVC. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w dawce 0,05-0,1 mg/kg po operacji co 6-12 godzin przez 48 godzin.

3. Leczenie nasierdziowe za pomocą drugiej torakotomii

  1. Powtórz kroki 2.1-2.3.
  2. Naciąć skórę prostopadle do mostka w piątej przestrzeni międzyżebrowej. Oddziel 3 warstwy mięśnia piersiowego (mięsień piersiowy większy, pierścień wstępujący i mięsień piersiowy skośny zewnętrzny). Otwórz piątą przestrzeń międzyżebrową (między żebrami 5 i 6).
  3. Użyj małego retraktora, aby rozłożyć żebra i odsłonić serce. Jeśli jest trochę przylegania, ostrożnie usuń je drobnymi kleszkami.
  4. Zlokalizuj obszar zawału, który pojawia się jako blady obszar poniżej ligatury. UWAGA: W razie potrzeby użyj 10-centymetrowego szwu (7,0) wprowadzonego na wierzchołku, aby lepiej uwidocznić lewą komorę. Delikatnie pociągnij za szew luźno utrzymywany przez zacisk, aby odsłonić serce.
  5. Zastosuj jeden z następujących zabiegów:
    1. Umieść biograft na powierzchni serca. Użyj ampułkostrzykawki z uszczelniaczem fibrynowym podgrzanej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Nanieść kroplę (50-100 μl) uszczelniacza fibrynowego pod biograft za pomocą igły Luer 25 G. Sprawdź, czy biograft jest idealnie uszczelniony.
    2. Alternatywnie, nałóż osad komórkowy zebrany końcówką pipety na powierzchni serca na blady obszar poniżej ligatury. Nanieś kroplę (50-100 μl) fibrynowego uszczelniacza na osad komórkowy.
  6. Usuń kawałek szwu z wierzchołka.
  7. Powtórz kroki 2.6-2.8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta doszły do siebie w ciągu 1 hr po torakotomiach. Gojenie ran przebiegało szybko. Nie zaobserwowano infekcji ani obrzęku.

Podwójna lewostronna torakotomia zapewniła optymalny dostęp do serca (Rycina 1). Ból oraz śmiertelność pooperacyjna były niskie. Zwierzęta szybko regenerowały się po zabiegu i przybierały na wadze (Rycina 2). Procent przeżywalności wg metody Kaplana-Meiera wyniósł 96% po pierwszej torakotomii. Cztery szczury ze 104 zmarły ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trwałe podwiązanie LAD powoduje nieodwracalne uszkodzenie mięśnia sercowego. Pierwszy model zwierzęcy został opisany w 1960 roku4. Od tego czasu jest uważany za standardowy i odpowiedni model dla przewlekłego zawału mięśnia sercowego. Jego stabilność i powtarzalność pozwoliły na eksperymentalną ocenę terapii MI5. Ulepszone procedury zgodnie z początkowym opisem wykazały śmiertelność operacyjną na poziomie 35-13%6.

Zgodnie z oczekiwaniami, podwiązanie LAD spowod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują prof. Hendrikowi Tevaearai i Departamentowi Chirurgii Sercowo-Naczyniowej za wsparcie finansowe dla początkowej części badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szew Polysorb 3-0Szew CovidienUL 204
Szew Polysorb 5-0 SzewCovidienUL 202
Surgipro II 7-0 SzewCovidienVP904X
Cewnik Insyte 14 GBD381267
Zaawansowany respirator o kontrolowanej objętościInspira Aparat Harvard557058
Dumont #7 KleszczeFST Niemcy11274-20
Uszczelniacz fibrynowyBaxter1501441Klej TISSEEL, Mrożony -20 ° C
Castroviejo Eye SpeculaHarvard Apparatus72-8925zastosowanie jako zwijacz żeber
IMDM GlutaMAXGibco31980
Pen/StrepGibco15140
FBSPAA Clone          A15-101
Nożyczki do kościFine Science Tools16044-10
Roztwór do lizy czerwonych krwinekGentra SystemsD-50k1
Rozwiązanie do odłączania komórek AccutaseTechnologia komórek macierzystych7920

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
  2. Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
  3. Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
  4. Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
  5. Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
  6. Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
  7. Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
  8. Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
  9. Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
  10. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
  11. Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
  12. Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
  13. Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
  14. Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model szczurapodwi zanie LADprocedura torakotomiiocena echokardiograficznaanaliza histologicznaizolacja szpiku kostnego

Powiązane artykuły