NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Podsumowanie

Streszczenie

Analiza tetrady jest cennym narzędziem do genetyki drożdży, ale pracochłonny ręczny charakter procesu utrudnia jej zastosowanie na dużą skalę. Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych (BEST)¹ zastępuje ręczne procesy izolowania, przerywania i rozdzielania tetrad. BEST izoluje tetrady za pomocą specyficznego dla zarodnikowania białka fuzyjnego GFP, które umożliwia aktywowane fluorescencją sortowanie komórek tetrad bezpośrednio na płytkach agarowych, gdzie worek jest trawiony enzymatycznie, a zarodniki są rozbijane i losowo układane przez powlekanie kulkami szklanymi. Koloniom haploidalnym przypisuje się następnie relacje zarodników siostrzanych, tj. informacje o tym, które zarodniki pochodzą z tej samej tetrady, za pomocą molekularnych kodów kreskowych odczytywanych podczas genotypowania. Usuwając wąskie gardło ręcznej sekcji, w ciągu kilku minut można wyizolować setki, a nawet tysiące tetrad. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis procedur doświadczalnych wymaganych do uzyskania najlepszego wyniku u drożdży Saccharomyces cerevisiae, począwszy od heterozygotycznego szczepu diploidalnego, poprzez izolację kolonii pochodzących z haploidalnego potomstwa mejotycznego.

Wprowadzenie

Mapowanie genów w mejozie, powszechnie znane jako analiza tetrad, zajmuje centralne miejsce w genetyce drożdży. W skrócie, dwa szczepy haploidalne, z których każdy zawiera jedną kopię każdego chromosomu, są krzyżowane w celu utworzenia heterozygotycznego szczepu diploidalnego z dwiema kopiami każdego chromosomu, po jednej od każdego rodzica. Głodzenie komórek diploidalnych w odniesieniu do azotu indukuje mejozę (sporulację), podczas której chromosomy ulegają replikacji, reorganizacji i dzielą się na cztery komórki haploidalne (zarodniki lub segreganty) z nowymi kombinacjami alleli od każdego z rodziców. Cztery zarodniki powstałe z jednej mejozy można wyizolować za pomocą manualnego procesu zwanego sekcją tetrad.

Konwencjonalna dyssekcja tetrad^2,3, która zmieniła się stosunkowo niewiele od czasu oryginalnej publikacji z 1937 roku⁴, ma trzy cele. Po pierwsze, komórki, które przeszły mejozę (tetrady), muszą zostać odizolowane od tła komórek wegetatywnych. W konwencjonalnej analizie realizuje to badacz, który za pomocą mikroskopu wizualnie identyfikuje tetrady na płytce z agarem i używa mikromanipulatora, aby przenieść tetradę na wolny od komórek obszar płytki. Następnie cztery przetrwalniki w tetradzie muszą zostać fizycznie rozdzielone, aby zapobiec kojeniu między przetrwalnikami. Przetrwalniki w obrębie tetrady są utrzymywane razem zarówno przez askus, będący pozostałością ściany komórkowej pierwotnej komórki diploidalnej, jak i zestaw mostków międzyprzetrwalnikowych⁵. W konwencjonalnej analizie tetrad askus jest usuwany poprzez trawienie enzymatyczne, a badacz używa mikromanipulatora do przerwania mostków międzyprzetrwalnikowych i rozdzielenia przetrwalników. Na koniec poszczególne przetrwalniki są rozmieszczone w układzie siatki, który zachowuje relacje między nimi, i.e. wszystkie potomstwo w rzędzie czterech są przetrwalnikami siostrzanymi z tej samej pierwotnej tetrady. Doświadczony badacz drożdży może ukończyć proces dyssekcji 10 tetrad (ogólnie przyjęta minimalna liczba na jeden krzyż) w około 15 min.

Opracowaliśmy nową wysokoprzepustową metodę genotypowania tetrad, którą nazwaliśmy Barcode Enabled Sequencing of Tetrads (BEST)¹. Metoda BEST rozszerza obecne techniki w zakresie genetyki wysokoprzepustowej, umożliwiając generowanie i genotypowanie ogromnej liczby potomstwa, które jest izolowane, genotypowane i utrzymywane jako osobne jednostki w sposób pozwalający na odzyskanie relacji siostrzanych zarodników dla wszystkich czterech produktów mejozy. Jest to realizowane za pomocą trzech głównych strategii (Rysunek 1). Pierwszą jest wprowadzenie konstruktu reporterowego, który znakuje białkiem GFP komórki, które przeszły mejozę, umożliwiając ich izolację za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Drugą jest wprowadzenie wysoce złożonego kodu kreskowego DNA (ciągu 15 losowych nukleotydów) w formie przekazywanej wszystkim czterem zarodnikom tetrady, który może zostać odczytany poprzez sekwencjonowanie DNA potomstwa rekombinantowego, co pozwala zidentyfikować zarodniki siostrzane z tej samej tetrady. Trzecim etapem jest genotypowanie; BEST jest kompatybilna z wieloma platformami genotypowania, które rejestrują zarówno zestaw markerów genomowych, jak i specyficzny dla tetrady kod kreskowy. Stosujemy metodę sekwencjonowania tagów DNA związanych z miejscami restrykcyjnymi (RAD-seq)⁶, która kieruje sekwencjonowanie genomu do specyficznych miejsc restrykcyjnych¹, przechwytując w ten sposób stałe 2-3% genomu szczepów potomnych oraz kod kreskowy przenoszony przez plazmid. Odzyskanie relacji tetrad wraz z empirycznie uzyskanymi danymi z genotypowania krzyżówki pozwala na dokładne wnioskowanie o brakujących informacjach, w tym o statusie markerów o niskim pokryciu sekwencjonowania oraz pełnym genotypie osobników nieżywotnych (a zatem nie do odzyskania). W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie tej metody u najczęściej używanego mikroorganizmu w mapowaniu mejotycznym, drożdży S. cerevisiae. Jednakże, przy niewielkich modyfikacjach odczynników specyficznych dla organizmu, np. zastosowaniu innych białek specyficznych dla sporulacji połączonych z GFP, metoda ta powinna być łatwo przeniesiona na inne mikroorganizmy, w tym na organizmy, w których mapowanie mejotyczne jest znacznie bardziej pracochłonne lub obecnie niewykonalne.

Rysunek 1. Metoda BEST. (A) Plazmid pCL2_BC jest plazmidem 2-mikronowym z fuzją GFP specyficzną dla sporulacji, opornością na G418 oraz losowym kodem kreskowym o długości 15 nukleotydów. Konstrukcja biblioteki plazmidów została opisana przez Ludlow et al¹. (B) Pula plazmidów z kodami kreskowymi jest transformowana do szczepu diploidalnego pochodzącego z krzyżówki. (C) Transformanty są następnie hodowane na pożywce selekcyjnej, a około 10 000 przetransformowanych kolonii jest łączonych i poddawanych sporulacji. Podczas mejozy każda przetrwalnik tetrady dziedziczy kopię plazmidu z kodem kreskowym. (D) Tetrady są oddzielane od niesporulowanych komórek za pomocą FACS i zbierane na płytkach agarowych, gdzie są trawione i rozbijane, aby umożliwić każdemu przetrwalnikowi utworzenie kolonii. (E) Kolonie są następnie przenoszone do płytek 96-dołkowych, fenotypowane i genotypowane. Podczas genotypowania odczytywany jest kod kreskowy plazmidu, który służy do identyfikacji czterech członków każdej tetrady. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Ludlow et al¹. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Konstrukcja i charakterystyka szczepów

1. Stwórz heterozygotyczny szczep diploidalny do wykorzystania w krzyżówce poprzez kojarzenie szczepów haploidalnych i selekcję diploidów² lub wykorzystując naturalnie występujący szczep heterozygotyczny. Szczepy nie powinny posiadać GFP.
2. Potwierdź, że szczep nie jest w stanie rosnąć na podłożu YPD² + 200 µg/ml G418.
3. Potwierdź, że szczep jest zdolny do sporulacji. Metoda BEST jest kompatybilna z krzyżówkami o niskiej wydajności sporulacji, jednak niska częstotliwość sporulacji wydłuża czas sortowania FACS.
   1. Przygotuj kulturę nocną (O/N) szczepu w 5 ml YPD i hoduj z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.
   2. Przemyj 0,5 ml kultury nocnej trzykrotnie za pomocą PBS (pH 7,4).
   3. Odwirowuj przemyte komórki, usuń nadsącz i resuspenduj w 2 ml pożywki do sporulacji⁷.
   4. Wytząsaj komórki w RT i codziennie sprawdzaj tworzenie tetrad za pomocą mikroskopu świetlnego w kontraście fazowym z obiektywem 40X.
4. Oszacuj żywotność zarodników krzyżówki poprzez konwencjonalną dyssekcję^2,3 niewielkiej liczby (~20) tetrad. Żywotność zarodników w krzyżówkach między różnymi tłem szczepowymi jest bardzo zróżnicowana i nieprzewidywalna. Jednakże oczekiwania a priori dotyczące żywotności zarodników mogą służyć do oceny wydajności eksperymentu BEST przed czasochłonnymi i kosztownymi etapami zabezpieczania i genotypowania szczepów. Dlatego ten krok jest wysoce zalecany.

2. Transformacja diploidów biblioteką plazmidów z kodami kreskowymi

1. Wprowadź plasmid z kodem kreskowym pCL2_BC do heterozygotycznego szczepu diploidalnego, stosując protokół transformacji opisany przez Gietza i Woodsa⁸ z następującymi modyfikacjami.
   1. Po inkubacji komórek z mieszaniną transformacyjną w temperaturze 30 °C przez 20 min, dodaj DMSO do stężenia 8% objętości mieszaniny transformacyjnej. Stwierdzono, że dodatek DMSO zwiększa wydajność transformacji w niektórych liniach szczepów⁹.
   2. Po etapie szoku termicznego odwirowaj komórki krótką centrifugacją, odlej mieszaninę transformacyjną i delikatnie przemyj komórki w YPD. Następnie zawieś komórki ponownie w 1 ml YPD i pozostaw je do regeneracji w RT przez 3 hr bez wstrząsania.
2. Wyselekcjonuj transformanty, wysiewając je na płytki agarowe YPD + G418 (200 µg/ml). Aby zapewnić zróżnicowaną pulę kodów kreskowych plazmidów, zbierz dużą liczbę kolonii, np. z 5 płytek zawierających ok. 2 500 kolonii na płytkę.
3. Gdy kolonie staną się widoczne (po 2-3 dniach wzrostu w 30 °C), połącz transformanty, ostrożnie zeskrobując je z płytki do ciekłego YPD + G418 (200 µg/ml) + 15% glicerolu. Zawiesinę komórkową wymieszaj w wortexie, przenieś do fiolki do krioようにpreserwacji i zamroź w temperaturze -80° C. Przygotuj oddzielny mrożony stok dla każdej płytki. Mrożone stoki te posłużą jako szczepy wyjściowe do kroku 3.1 i mogą zostać wykorzystane w późniejszym terminie do generowania kolejnych tetrad, jeśli będzie to wymagane.

3. Sporulacja biblioteki transformowanych komórek w celu otrzymania zakodowanych kreszowo tetrad

1. Rewiwyzować komórki z mrożonych zapasów przygotowanych w punkcie 2.3 poprzez inkubację przez noc (O/N) w 5 ml pożywki YPD + G418 (200 µg/ml) w temperaturze 30 °C przy mieszaniu.
2. Przemyć komórki z kultur inkubowanych przez noc 3x w PBS (pH 7.4), a następnie zawiesić komórki w medium do sporulacji⁷ z dodatkiem 200 µg/ml G418.
3. Mieszać kultury sporulacyjne w temperaturze pokojowej (RT) i codziennie monitorować postępy sporulacji, aż do momentu zaprzestania tworzenia się nowych tetrad.
4. Gdy kultura będzie zawierać dobrze uformowane tetrady i stosunkowo mało dyad, należy zaprzestać mieszania i pozostawić kultury w temperaturze pokojowej przez co najmniej 7 dni. Choć niektóre krzyżówki mogą nadawać się do trawienia i rozbicia na płytce natychmiast po uformowaniu się tetrad (ocenianym zgodnie z opisem w punkcie 7.3), dodatkowa inkubacja (7-10 dni w naszych eksperymentach) jest niezbędna dla innych krzyżówek. W związku z tym ten krok jest wysoce zalecany.

4. Wyznaczanie bram FACS dla sortowania tetrad

Fuzja SPS2-GFP wyrażana podczas mejozy na plazmidzie pCL2_BC pozwala na wykrywanie i izolowanie tetrad w kulturze sporulacyjnej za pomocą fluorescencji. Poniższy protokół został opracowany dla systemu FACSAria II.

Rysunek 2. Bramkowanie FACS.  Do wyizolowania tetrad wykorzystuje się serię czterech sekwencyjnych bramek. Bramki przedstawione na (A) i (B) pomagają zredukować liczbę aglomeratów. Zdarzenia fluorescencyjne są wybierane za pomocą bramki w (C). Histogram w (D) wykazuje dwa piki. Zdarzenia w lewym piku to przede wszystkim tetrady (obraz wstawiony po lewej), a zdarzenia w prawym piku to zazwyczaj tetrady z przyczepionym pączkiem (obraz wstawiony po prawej). Do tego histogramu zastosowano końcową bramkę w celu wybrania zdarzeń, które są w przeważającej mierze tetradami (czerwone słupki). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Ludlow, et al¹.

1. Załaduj kulturę z zarodnikami do sortera FACS i ustaw dwa bramki rozproszenia przedniego (forward scatter) oraz bocznego (side scatter), aby wykluczyć zanieczyszczenia, aglomeraty komórek oraz zdarzenia wielokomórkowe w jednej kropli (Rycina 2A i 2B).
2. Powinna pojawić się populacja komórek fluorescencyjnych, która przy użyciu konstruktu reporterowego SPS2-GFP obejmuje dyady i tetrady¹⁰. Ustaw bramkę GFP względem FSC, aby uwzględnić te zdarzenia fluorescencyjne (Rycina 2C).
3. W zależności od tła szczepu może być konieczne zastosowanie dodatkowej bramki w celu usunięcia aglomeratów zawierających tetrady i inne komórki. Jeśli jest to wymagane, sprawdź histogram FSC dla zdarzeń fluorescencyjnych i określ bramkę obejmującą zdarzenia o niższym FSC (Rycina 2D, zdarzenia wyselekcjonowane zaznaczono na czerwono).
4. Zweryfikuj efektywność schematu bramkowania, sortując ok. 1 500 tetrad na szkiełko mikroskopowe i obliczając proporcję tetrad do obiektów niebędących tetradami za pomocą mikroskopu fazokontrastowego przy powiększeniu 400X. Procent tetrad można dokładnie oszacować, licząc jedynie ok. 200 posortowanych zdarzeń, jednak sortowanie ok. 1 500 skraca czas poszukiwania komórek na szkiełku. Alternatywnie, stosunek tetrad do obiektów niebędących tetradami można ocenić podczas kroku 4.5.
5. Okresowo sprawdzaj, czy sorter prawidłowo raportuje liczbę zdarzeń, sortując 25 tetrad na szkiełko mikroskopowe i badając komórki zawarte w kropli za pomocą mikroskopu fazokontrastowego przy powiększeniu 400X. W kropli powinno znajdować się 25 tetrad. Powtórz czynność 3-4x, aby ocenić wariancję urządzenia FACS.

5. Sortowanie tetrad na płytkę agarową

Rysunek 3. Umieszczenie szalki z agarem w sorterze FACS. Aby posortować tetrady do małej kropli roztworu zymolazy umieszczonej na środku standardowej (okrągłej) szalki z agarem, najpierw na stole sortera komórkowego umieszcza się standardową (prostokątną, 100 mm) płytkę 96-dołkową, a następnie programuje sorter tak, aby nanosił tetrady do konkretnego dołka (w tym przypadku D5). Następnie okrągłą szalkę z agarem kładzie się na płytce 96-dołkowej i wyrównuje tak, aby kropla zymolazy znajdowała się dokładnie nad wskazanym dołkiem.

1. Podgrzewaj odpowiednią liczbę płytek YPD + G418 (200 µg/ml) przez co najmniej 1,5 hr w inkubatorze o temperaturze 37 °C umieszczonym w pobliżu sortera FACS.
2. Kluczową cechą protokołu sortowania jest możliwość precyzyjnego skierowania tetrad sortowanych metodą FACS w konkretne miejsce na płytce agarowej zawierającej kroplę roztworu zymolyase. Aby to osiągnąć, umieść płytkę „orientacyjną” z 96 dołkami na automatycznej jednostce depozycji komórek (ACDU) sortera. Przygotuj układ sortowania, który pozwoli na posortowanie 25 tetrad do jednego dołka w formacie 96-dołkowym. Wybierz dołek w pobliżu środka płytki, np. dołek D5. Rysunek 3 przedstawia szalkę Petriego i płytkę 96-dołkową umieszczone w sorterze komórek. Sortowanie 25 tetrad na płytkę pozwala na uzyskanie dobrze oddzielonych kolonii.
3. Przenieś stos 10 płytek agarowych z inkubatora 37 °C do sortera.
4. Weź jedną płytkę agarową i nanieś pipetą 25 μl roztworu zymolyase (1 mg/ml w 0,7 M sorbitolu) na agar w pobliżu środka płytki. Następnie umieść płytkę na orientacyjnej płytce 96-dołkowej, wyrównując kroplę zymolyase nad docelowym dołkiem z kroku 5.2, np. dołkiem D5.
5. Rozpocznij sortowanie i zdeponuj 25 tetrad w środku kropli zymolyase na płytce agarowej. Następnie wyjmij i przykryj płytkę.
6. Powtarzaj kroki 5.4 i 5.5, aż 25 tetrad zostanie posortowanych do kropli zymolyase na każdej płytce w stosie.
7. Przenieś stos płytek zawierających tetrady z powrotem do inkubatora 37 °C.
8. Powtarzaj kroki od 5.3 do 5.7, aż wszystkie płytki będą zawierały tetrady.

6. Separacja zarodników

1. Inkubować każdy stos płytek agarowych zawierających tetrady w temperaturze 37 °C przez 1,5 hr.
2. Wyjąć płytki z inkubatora, dodać 15-25 sterylnych szklanych kulek o średnicy 3 mm na płytkę i wstrząsać płytkami w stosie (lub w dwóch stosach po 5 płytek) przez 3-5 min. Najlepszą separację zarodników uzyskuje się, przesuwając płytki sztywno z boku na bok lub od przodu do tyłu. Nie należy przesuwać płytek w sposób, który powodowałby „wirowanie” kulek wokół zewnętrznej krawędzi płytki. Po zakończeniu pozostawić kulki na płytkach.
3. Umieścić stos płytek z kulkami stroną aktywną do góry w inkubatorze w temperaturze 30 °C. Wyjąć kolejny stos płytek z inkubatora w temperaturze 37 °C i powtórzyć krok 6.2.
4. Inkubować płytki O/N w temperaturze 30 °C.

7. Zbieranie kolonii

1. Po inkubacji przez noc (O/N) w temperaturze 30 °C na płytkach powinny powstać małe kolonie. Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora, uważając, aby nie poruszyć szklanych kulek.
2. Usuń szklane kulki, ostrożnie i szybko odwracając płytki nad głębokim pojemnikiem. Pojemnik powinien być wystarczająco głęboki, aby przechwycić kulki i zapobiec ich odbijaniu się i uderzaniu w płytkę z agarem. Delikatne opukiwanie dna płytki podczas odwracania może pomóc w usunięciu kulek przyklejonych do powierzchni. Kulki te można ponownie wykorzystać po dokładnym umyciu z detergentem, starannym wypłukaniu wodą dejonizowaną i sterylizacji w autoklawie.
3. Policz liczbę kolonii na każdej płytce i na podstawie tej liczby oszacuj wydajność separacji i odzyskiwania zarodników. Na przykład 25 tetrad na płytce w przypadku krzyżówek o żywotności bliskiej 100% mogłoby dać łącznie 100 kolonii na płytce.
4. Z płytek z odpowiednią liczbą kolonii (>65 dla krzyżówek o wysokiej żywotności) przenieś komórki z każdej kolonii do osobnej studzienki płytki 96-dołkowej zawierającej płynne podłoże YPD + G418. Zapisz również, które studzienki zawierają kolonie z tej samej płytki agarowej; informacje te posłużą do wsparcia oprogramowania do przydzielania tetrad.
5. Wykorzystaj płynne kultury na płytkach 96-dołkowych do zaszczepienia kultur do genotypowania oraz do przechowywania szczepów jako zamrożone stożki glicerolowe. Szczegółowe informacje na temat sekwencjonowania RAD-tag oraz analizy sekwencji znajdują się w pracy Ludlow et al¹.

Wyniki

Metoda BEST może znacznie zwiększyć szybkość izolacji zarodników z tetrad. Jako przykład wydajności tej metody, jeden badacz przeprowadził sortowanie FACS i separację zarodników (kroki od 5.1 do 6.3) dla 149 płytek agarowych w ciągu 3 hr¹. Odpowiedni uzysk (około 3 725 tetrad) wymagałby ponad 90 hr manualnej dyssekcji. Jednakże, podobnie jak w przypadku wielu metod wysokoprzepustowych, obecna wersja tej metody wykazuje pewną utratę wydajności w porównaniu z dyssekcją manualną. Strata ta przejawia się w zmniejszonej liczbie odzyskanych kolonii w stosunku do oczekiwań obliczonych na podstawie żywotności zarodników krzyżówki, określonej poprzez dyssekcję manualną (krok 1.4). Zakładając, że przyczyny utraty zarodników (Omówienie) wpływają na zarodniki w sposób losowy, można oszacować, ile odzyskanych kolonii będzie należało do tetrad, z których odzyskano 1, 2, 3 lub 4 zarodniki (Rysunek 4).

Rycina 4. Symulacja wydajności metody na poziomie tetrad. Brak możliwości pomyślnego odzyskania zarodników (w formie kolonii) może wynikać z ich nieżywotności, przylegania zarodników do szklanych kulek, niepowodzenia w oddzieleniu zarodników od siebie itp. Rozkład dwumianowy został wykorzystany do obliczenia oczekiwanej frakcji tetrad (z co najmniej jednym pomyślnie odzyskanym zarodnikiem) wytwarzających 4, 3, 2 lub 1 kolonię na podstawie proporcji wszystkich pomyślnie odzyskanych zarodników. Wykres ten może służyć jako orientacyjny przewodnik po liczbie szczepów, które ostatecznie zostaną zgrupowane w tetrady 3- lub 4-zarodnikowe. Wraz ze wzrostem liczby kolonii na płytce rośnie liczba odzyskanych kompletnych tetrad.

W opisanym powyżej eksperymencie 25 tetrad z krzyżówki o żywotności zarodników bliskiej 100% (ustalonej poprzez ręczną dyssekcję)¹ wysiano na 149 płytki z agarem. W tym eksperymencie maksymalna liczba kolonii zaobserwowana na jednej płytce wyniosła 80, co wskazuje, że 20 zarodników nie utworzyło osobnych kolonii. Średnia liczba kolonii na płytce wyniosła 62. Kolonie z 61 płytek zawierających 65 lub więcej kolonii zostały zebrane i poddane sekwencjonowaniu. Z 3 700 szczepów, które przeszły kontrolę jakości sekwencjonowania, 72% można było obliczeniowo przypisać do tetrad 3- lub 4-zarodnikowych.

Dyskusja

Wiele obszarów badań genetycznych, począwszy od mapowania złożonych^cech11 , a skończywszy na badaniu mechanizmów leżących u podstaw rekombinacji^DNA12, wymaga niezwykle dużej liczby potomstwa i dużych ilości sekwencjonowania DNA. Techniki, które łączą moc konwencjonalnych podejść ze zdolnością do wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA, mają potencjał, aby umożliwić badania, które wcześniej były trudne do wykonania. Chociaż kilka wysokoprzepustowych metod genetyki drożdży zostało skutecznie zastosowanych do konkretnych problemów, każda z nich ma ograniczenia, które nie są w stanie osiągnąć szerokiego zastosowania konwencjonalnej analizy tetradowej. Projekt BEST jest odpowiedzią na te wyzwania, stosując wysokoprzepustowe podejście łączące preparację tetrad i genotypowanie potomstwa krzyżówek drożdży. W połączeniu z multipleksowanym sekwencjonowaniem znaczników RAD, BEST oferuje niedrogi sposób zbierania informacji o genotypie dla każdego szczepu potomstwa, przy jednoczesnym zachowaniu powiązań tetrad za pomocą unikalnych kodów kreskowych tetrad. Spośród wszystkich obecnie stosowanych metod wysokoprzepustowych, BEST najwierniej podsumowuje informacje dostarczone przez ręcznie wypreparowaną krzyżówkę drożdży.

BEST ma dwie kluczowe cechy. Pierwszym z nich jest zastosowanie FACS do szybkiej izolacji tetrad z dala od niezarodnikowanych komórek w hodowli (kroki protokołu 5-6). Zdolność do izolowania tysięcy zdarzeń fluorescencyjnych (tetrad) daje BEST największy wzrost przepustowości. Ta automatyzacja zapewnia jeszcze większą przewagę nad ręcznym preparowaniem w przypadku krzyżówek o niskiej wydajności zarodnikowania, ze względu na wydłużony czas potrzebny na wizualną identyfikację rzadkich zdarzeń. Drugą kluczową cechą jest użycie wysoce złożonego molekularnego kodu kreskowego (Protokół Krok 2), który jest przesyłany do każdego siostrzanego zarodnika tetrady. Ponieważ te kody kreskowe mogą być używane do obliczeniowej rekonstrukcji tetradowych relacji między zarodnikami, które zostały losowo rozmieszczone na płytce agarowej, potrzeba ręcznego układania komórek w uporządkowanej siatce jest złagodzona. Wreszcie, ponieważ molekularny kod kreskowy i gen reporterowy GFP specyficzny dla zarodnikowania są fizycznie połączone (na tym samym plazmidzie), tylko tetrady, które zachowały molekularny kod kreskowy, są wybierane przez sortowanie FACS.

Istnieją dwie kwestie, które regulują czas inkubacji kultur w pożywce zarodnikowej. Po pierwsze, ponieważ reporter specyficzny dla zarodnikowania (SPS2-GFP) ulega ekspresji we wczesnym okresie mejozy, sam GFP nie odróżnia kompletnych tetrad 4-zarodnikowych od komórek, które nie ukończyły mejozy (tj. diady). Podczas gdy dodatkowe bramkowanie FACS może zmniejszyć liczbę fluorescencyjnych, niekompletnych tetrad, najłatwiejszym sposobem na zmniejszenie tych niepożądanych zdarzeń jest po prostu monitorowanie kultury zarodnikowej (Krok 3.3) i kontynuowanie, gdy nowe tetrady przestaną się tworzyć. W naszych eksperymentach częstotliwość sortowania diad wynosi mniej niż 1%. Po drugie, w przypadku niektórych krzyżówek dodatkowy czas spędzony w pożywce zarodnikowej w temperaturze pokojowej bez mieszania (Krok 3.4) znacznie poprawia oddzielanie tetrad przez szklane kulki podczas posiewu ((Protokół Krok 6). W rzeczywistości ten krok jest absolutnie konieczny do przerwania niektórych krzyży.

Podobnie jak wszystkie metody o wysokiej przepustowości, BEST jest "głośniejszy" niż odpowiadające mu konwencjonalne podejście. Niewielkie zmniejszenie skuteczności BEST w porównaniu z konwencjonalną sekcją tetrad może wynikać z połączenia kilku czynników. Jednym z czynników jest zwiększona utrata skądinąd żywotnych zarodników, która może wynikać z przylegania do szklanych kulek podczas rozprzestrzeniania się lub zwiększonej śmierci zarodników z powodu naprężeń mechanicznych procesu. Drugim czynnikiem może być zwykła utrata plazmidu podczas mejozy. Trzecim czynnikiem może być efektywny spadek liczby kolonii nadających się do użytku wynikający z kolonii o mieszanych genotypach, szacowanych na ~5% kolonii w naszych pilotażowych krzyżówkach¹. Jest prawdopodobne, że te kolonie reprezentują niepowodzenia w separacji siostrzanych zarodników. Ponieważ szybkie sortowanie fluorescencyjne i separacja zarodników pozwalają na zbieranie ogromnych ilości tetrad, BEST jest dobrze przygotowany do przezwyciężenia spadków wydajności na tę skalę. Podczas gdy przyszłe iteracje BEST mogą zwiększyć wydajność zbliżoną do wydajności ręcznej sekcji, być może bardziej prawdopodobne jest, że obecna wykładnicza trajektoria zdolności sekwencjonowania DNA szybko skompensuje ten poziom użytecznej utraty szczepu. Niezależnie od tego, możliwość przeprowadzenia analizy tetradowej w skali, do której można zastosować BEST, umożliwi badania, które są obecnie niewykonalne metodami ręcznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FACSAria II (jednostka na specjalne zamówienie)	BD Biosciences		Inne sortery komórek powinny działać w tej procedurze. Kluczowymi czynnikami są: (1) laserowy/detekcyjny system dla używanego reportera fluorescencyjnego (w naszym przypadku laser o długości fali 488 nm do wzbudzania EGFP), (2) zdolność do sortowania pojedynczych zdarzeń, (3) możliwość sortowania na szkiełkach mikroskopowych w celu oceny jakości sortowania oraz (4) zdolność do sortowania na szalkach Petriego
Automated Cell Deposition Unit (dla FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (jeśli został zakupiony oddzielnie od instrumentu FACSAria)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Naukowy		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html