Artykuł metodologiczny

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

DOI:

10.3791/51406

⸱

23 kwietnia 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka lat temu, wprowadzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapoczątkowało nową erę w biomedycynie. Potencjalne zastosowania ludzkich iPSC obejmują modelowanie patogenezy chorób genetycznych człowieka, autologiczną terapię komórkową po korekcji genów oraz spersonalizowane badania przesiewowe leków poprzez zapewnienie źródła komórek specyficznych dla pacjenta i istotnych dla objawów. Istnieje jednak kilka przeszkód do pokonania, takich jak wyeliminowanie pozostałej ekspresji transgenu czynnika przeprogramowującego po wytworzeniu ludzkich iPSC. Co ważniejsze, resztkowa ekspresja transgenu w niezróżnicowanych ludzkich iPSC może utrudniać prawidłowe różnicowanie i błędnie interpretować istotne dla choroby fenotypy in vitro. Z tego powodu opracowano ludzkie i/lub transgeniczne iPSC wolne od integracji i/lub transgenów przy użyciu kilku metod, takich jak adenowirus, system piggyBac, wektor minicircle, wektory episomalne, bezpośrednie dostarczanie białek i zsyntetyzowane mRNA. Jednak wydajność przeprogramowania przy użyciu metod bezintegracyjnych jest w większości przypadków dość niska.

Tutaj prezentujemy metodę izolowania ludzkich iPSC za pomocą systemu przeprogramowania opartego na wirusie Sendai (wirus RNA). Ta metoda przeprogramowania wykazuje spójne wyniki i wysoką wydajność w opłacalny sposób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mają zdolność do samoodnawiania się in vitro i mają pluripotencję, co może być potencjalnie przydatne do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i rozwoju terapii komórkowych do leczenia chorób i uszkodzeń tkanek. Jednak hESC mają ograniczenia w terapii zastępczej komórek ze względu na bariery immunologiczne, onkologiczne i etyczne, a w celu zbadania genów związanych z chorobą, specyficzne dla choroby hESC można wyizolować za pomocą metod preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej (PGD), ale nadal jest to technicznie trudne, a dawstwo zarodków jest dość rzadkie. Zagadnienia te są związane z postępem w biologii komórek macierzystych, który doprowadził do rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Ludzkie iPSC są genetycznie przeprogramowane z ludzkich dorosłych komórek somatycznych i posiadają pluripotencjalne cechy podobne do komórek macierzystych hESC, co czyni je użytecznym źródłem dla medycyny regeneracyjnej, takiej jak odkrywanie leków, modelowanie chorób i terapia komórkowa w sposób specyficzny dla pacjenta1,2 .

Do tej pory istnieje kilka metod generowania ludzkich iPSC, w tym transdukcji genów za pośrednictwem wirusów (retrowirus i adenowirus)3, transdukcji genów bez pośrednictwa wirusa (transdukcja systemu BAC i wektorów)4 oraz system dostarczania białek5-7.

Chociaż dostarczenie genów za pośrednictwem wirusa może zapewnić pewien poziom efektywności, wektory wirusowe mogą pozostawić ślad genetyczny, ponieważ integrują się z chromosomami gospodarza, aby wyrazić przeprogramowanie genów w niekontrolowany sposób. Nawet jeśli wirusowa integracja czynników transkrypcyjnych może aktywować lub dezaktywować geny gospodarza8, może spowodować nieoczekiwaną aberrację genetyczną i ryzyko nowotworzenia5,9. Z drugiej strony, donoszono o bezpośrednim wprowadzeniu białek lub RNA do komórek somatycznych, ale ma to pewne wady, takie jak pracochłonna, wielokrotna transfekcja i niski poziom przeprogramowania7,10. Nawet episomalny i nieintegrujący adenowirus, wirus związany z adenowirusem i wektory plazmidowe są nadal stosunkowo mniejwydajne11. Z tych powodów prawdopodobne jest wybranie metod przeprogramowania nieintegracyjnego o wysokiej skuteczności generowania iPSC i mniejszej liczbie nieprawidłowości genetycznych. W tym badaniu używamy przeprogramowania opartego na wirusie Sendai. Wiadomo, że metoda ta nie jest zintegrowana z genomem gospodarza i konsekwentnie wytwarza ludzkie iPSC bez integracji transgenowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórki i mediów (Dzień 1)

  1. Hodowla i ekspansja ludzkich fibroblastów za pomocą pożywek DMEM zawierających 10% FBS.
  2. Umieść ludzkie fibroblasty (ryc. 1) na 24-dołkowej płytce z odpowiednią gęstością na studzienkę w dniu poprzedzającym transdukcję.
    nuta: Zalecane są następujące rozcieńczenia seryjne (200 K, 100 K, 50 K, 25 K, 12,5 K i 6,25 K), ponieważ różne typy komórek mają różną zdolność przyłączania.
  3. Inkubować komórki jeszcze przez jeden dzień w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 , upewniając się, że komórki w pełni przylegają i są rozciągnięte.

2. Wykonaj transdukcję (dzień 2)

  1. W dniu transdukcji należy sprawdzić gęstość komórek i wybrać najbardziej efektywne studzienki o gęstości (rysunek 2). Lepiej jest wybrać trzy różne gęstości: wysoką (80 ~ 90%), średnią (50 ~ 70%) i niską (20 ~ 40%).
  2. Co najmniej 1 godzinę przed transdukcją odessać pożywkę fibroblastów z komórek i wymienić nowe 300 μl pożywki fibroblastowej.
  3. Wyjmij jeden zestaw 4 różnych probówek z wirusem Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Rozmrozić każdą probówkę w tym samym czasie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka sekund, a następnie wyjąć probówki z łaźni wodnej. Następnie rozmrozić je do temperatury pokojowej; Probówki wirówkowe o masie 6 000 x g przez 10 sekund i umieszczać je na lodzie do czasu użycia. Nie zamrażaj ponownie i nie rozmrażaj wirusa, ponieważ miana nie utrzymają się.
  4. Dodać wskazane objętości każdej z czterech probówek z wirusem Sendai (Oct-4, Klf-4, c- Myc i Sox-2) do probówki mikrowirówkowej. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany, delikatnie pipetując.
    Na przykład, jeśli 50 tys. komórek/jedna studzienka na płytce 24-dołkowej wygląda dobrze na transdukcję:
    (Miano oparte na Certyfikacie Analizy od Life Technologies, może się różnić w zależności od partii)
    Rurka hOct-4 = 6,0 x 107 CIU, 3 MOI = 5 μl
    Rurka hSox-2 = 6,5 x 107 CIU, 3 MOI = 4,6 μl
    Rurka hKlf-4 = 6,3 x 107 CIU, 3 MOI = 4,8 μl
    Rurka hc-Myc = 7,8 x 107 CIU, 3 MOI = 3,8 μl
    Razem = 18,2 μl mieszaniny czterech czynników wirusowych/jeden dołek (50 tys. komórek) z płytki 24-dołkowej
  5. W zależności od gęstości komórek, dodaj 2X, 1X i 0,5X objętość mieszaniny wirusów do studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką od przodu do tyłu, w lewo i w prawo (2X: 36,4 μl mieszaniny wirusów, 1X: 18,2 μl i 0,5X: 9,1 μl).
  6. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez noc.

3. Wymiana pożywki hodowlanej (Dzień 3 i Dzień 5)

  1. 24 godziny po transdukcji zastąp pożywkę 500 μl świeżej pożywki fibroblastowej.
  2. W dniu 5 zmień pożywkę na świeżą pożywkę fibroblastów.

4. Przygotuj potrawy MEF dla kokultury (Dzień 8)

  1. Przygotować komórki MEF w 60-milimetrowych szalkach hodowlanych z 10% pożywką DMEM zawartą w FBS na dzień przed przeniesieniem transdukowanego fibroblastu na komórki zasilające MEF.
    Uwaga: Używamy 5 x 105 MEF w każdej naczyniu 60 mm.

5. Rozpocznij kokulturację transdukowanych komórek z komórkami zasilającymi MEF (Dzień 9)

  1. Przed posiewem transdukowanych komórek odessać 10% pożywki DMEM zawierającej FBS z naczyń podajnika MEF i dodać świeżą pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS.
  2. Usuń pożywkę z transdukowanych fibroblastów, które znajdują się w 24-dołkowej płytce i przemyj komórki raz D-PBS. Dodaj 200 μl 0,25% trypsyny/EDTA do komórek fibroblastów w 24-dołkowej płytce. Po mniej niż 5 minutach inkubacji z trypsyną/EDTA, gdy komórki zaczną odłączać się od płytki, zebrać komórki z pożywką wzrostową w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie odwirować je w 6 000 x g przez 4 min.
    nuta: Zaleca się łączenie fibroblastów transdukowanych wirusem 2X, 1X i 0,5X.
  3. Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem i przemyć w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego 4-5 ml świeżej pożywki fibroblastowej w celu zneutralizowania z trypsyny. Następnie odwirować je przy 135 x g przez 4 min.
  4. Płytki jako gęstość rozcieńczenia szeregowego i rozpocząć kohodowlę z pożywkami fibroblastów na MEF: takich jak 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 i 1/128 na szalkę 60 mm. W zależności od wskaźnika śmierci komórek w pierwszym tygodniu transdukcji, może nie być konieczne rozcieńczanie do gęstości 1/2 lub 1/128. Odłóż na bok pozostałe komórki, aby wyekstrahować całkowite RNA jako pozytywną kontrolę dla Transgene RT-PCR.
  5. Umieść na noc szalki o średnicy 60 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

6. Podawaj ludzkie embrionalne komórki macierzyste i monitoruj komórki (Dzień 10)

  1. Następnego dnia zmień pożywkę fibroblastową na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Następnie codziennie zmieniaj pożywkę na ludzką pożywkę ES: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml zamiennika surowicy nokautującej + 10 ml L-glutaminy + 10 ml minimum 10 mM MEM aminokwasów endogennych + 1 ml 2-merkaptoetanolu + 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów.
  2. Wykonuj codzienną zmianę nośnika za pomocą świeżych ludzkich pożywek ES. Po tygodniu sprawdzaj naczynia raz na 2 ~ 3 dni pod mikroskopem pod kątem tworzenia się grudek komórek przypominających kolonię ES. W zależności od typu komórki, hodowla zajmie mniej lub więcej czasu, zanim zostaną znalezione kolonie.

7. Wybieranie indukowanych pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i rozszerzanie komórek (Dzień 20~)

  1. Trzy tygodnie po transdukcji kolonie powinny wyglądać na odpowiednio wyrośnięte do zbioru.
  2. Dzień przed zbiorem rodzin przygotuj karmnik MEF na płytce 24-dołkowej.
    UWAGA: Używamy 12,5 x 105 MEF na jednej płytce 24-dołkowej.
  3. Następnego dnia zmień pożywkę szalek MEF z pożywki fibroblastów na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Za każdym razem ręcznie pobierać jedną kolonię pod mikroskopem w kapturze do wybierania i tworzyć mniejsze grudki za pomocą pipetowania i przenoszenia ich na nowo przygotowane szalki MEF. Spróbuj wybrać kilka klonów.
  4. Najpierw przejdź i rozszerz każdą studzienkę z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej. Następnie z płytki 6-dołkowej na szalkę 60 mm przed dalszym rozmnażaniem.

8. Charakterystyka ludzkich iPSC (po 10 przejściach)

  1. Immunofluorescencji
    1. Umieść ludzkie iPSC na 24-dołkowej płytce i posiew przez 4-5 dni z codzienną wymianą pożywki.
    2. Aby rozpocząć test immunofluorescencyjny, należy raz przemyć płytkę D-PBS. Następnie natychmiast utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Następnie myj trzy razy w D-PBS przez 5 minut.
    3. Utrwalone komórki należy traktować 0,1% roztworem Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zassać roztwór do permeablacji (0,1% roztwór trytona X-100), a następnie dodać 0,5% roztwór blokujący BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Wykonaj detekcję Nanog, Oct-4, SSEA (specyficzny dla etapu antygen embrionalny) i TRA-1-81 (antygen odrzucenia nowotworu) za pomocą przeciwciała antyludzkiego w 0,5% roztworze BSA (sprawdź tabelę materiałów dla szybkości rozcieńczenia przeciwciał). Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy w D-PBS przez 5 minut każdy.
    6. Sprawdź za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 1 godzinie inkubacji z przeciwciałami anty-mysim IgG Alexa Fluor 488 Goat jako 2 przeciwciałem ND, które rozcieńcza się w stosunku 1:2,000 w 0,5% roztworze BSA w temperaturze pokojowej. Wybarwić wszystkie jądra każdej komórki zasilającej MEF i hiPSC za pomocą DAPI.
  2. RT-PCR potwierdzenia transgenu
    1. Ekstrakcja całkowitego mRNA z osadu komórkowego za pomocą odczynników do ekstrakcji RNA.
    2. Wykonaj odwrotną transkrypcję na podwielokrotnościach (1 μg) całkowitego RNA i wynikowym cDNA do amplifikacji PCR przez odwrotną transkryptazę.
    3. Przygotować mieszaniny PCR tak, aby zawierały 2 μl matrycy cDNA, 10 μl mieszaniny głównej 2X PCR, 2 μl 2 pmol starterów (do przodu: 1 μl i do tyłu: 1 μl) i 6 μl DW. Aby wykryć ekspresję genu, należy wykonać RT-PCR ze starterami wymienionymi w Tabeli 1.
    4. Wykonaj RT-PCR z genem GAPDH jako kontrolę skuteczności reakcji amplifikacji. Wizualizacja i analiza produktu PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zazwyczaj zainfekowane fibroblasty nie wykazują żadnych zmian morfologicznych w ciągu kilku dni po transdukcji wirusa Sendai, ale pięć dni później zaczynają przybierać różne kształty (Rysunek 1). Jak opisano w prawym panelu rysunku 1, komórki nie mają już typowej morfologii fibroblastów. Mają okrągły kształt i większe jądro niż cytoplazma. Nawet jeśli transdukcja odbywa się w 80% konfluencji komórkowej, wygląda na to, że są one mniej zlewające się w studni po rozpoczęciu przeprogramowywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych na hiPSC niesie ze sobą bezprecedensowe nadzieje w dziedzinie biologii podstawowej, medycyny osobistej itransplantacji. Wcześniej ludzkie generacje iPSC wymagały wirusa DNA, który stwarza ryzyko integracji z genomem gospodarza, co może powodować niepożądane mutacje genetyczne, które ograniczają dalsze zastosowania kliniczne, takie jak opracowywanie leków i terapie transplantacyjne13. Z tego powodu doniesiono o wielu badaniach, w których za pomocą kilku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lee za cenne dyskusje na temat rękopisu. Prace w laboratorium Lee były wspierane przez granty z Robertson Investigator Award New York Stem Cell Foundation oraz z Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPSInvitrogenA1378002
CF-6, MEFs, odporny na neomycynę, poddany działaniu mitomycyny C Globalna płytka macierzystaGSC-6105M5 x 105/6 cm lub płytka 12,5 x 105/24-dołkowa
Trypsyna EDTA 0,25% Trypsyna z EDTA 4Na 1XInvitrogen25200114
DMEM/F-12 mediumInvitrogen11330-032
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska z pokrywkąBD353935
Y-27632TOCRIS125410 μ M (Magazyn: 10 mM)
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówLIFE TECHNOLOGIESPHG026310 ng (Magazyn: 100 ug)
Zamiennik surowicy nokautującejGibco10828028
Dulbecco' s Modyfikowane podłoże Eagle (D-MEM, DMEM) (1X), płynne (o wysokiej zawartości glukozy)Invitrogen11965118
Płodowa surowica bydlęcaThermo Scientific FermentasSH30071.03
L-Glutamina-200 mM (100X), płynnyGIBCO25030-0811/100
MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100XLIFE TECHNOLOGIES1/100
2-merkaptoetanol (1,000X), płynnyGIBCO219850231/1,000
Hemacytometry kontrastowe HausserHausser Scientific02-671-54
EmbryoMax 0,1% roztwór żelatynyMiliporES-006-B
SSEA-4DSHBMC-813-701/200
anty-Tra-1-81Sygnalizacja komórkowa4745S1/200
mysie przeciwciało monoklonalne Oct4Santa CruzSC-52791/1,000
NanogR& DAF19971/1,000
Alexa Flouor 488 koza anty-myszInvitrogen9484921/2,000
DPBS (Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1X bez wapnia i magnezCellgro21-031-CV
QuantiTect Zestaw do odwrotnej transkrypcjiQIAGEN205313
PCR Master Mix [2X]Thermo Scientific FermentasK0171
TrizolInvitrogen15596018
komorniksekcyjna NuAireNU-301
 NikonSMZ745
11140050 luneta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  2. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  3. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  4. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  5. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  6. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
  7. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  8. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  9. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  10. Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
  11. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
  12. Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
  13. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
  15. Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
  16. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Human iPSCsSendai VirusReprogramming EfficiencySomatic CellsFibroblast TransductionMouse Embryonic FibroblastImmuno LabelingRT PCR AnalysisStem Cell MarkersColony Expansion

Powiązane artykuły