Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kilka lat temu, wprowadzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapoczątkowało nową erę w biomedycynie. Potencjalne zastosowania ludzkich iPSC obejmują modelowanie patogenezy chorób genetycznych człowieka, autologiczną terapię komórkową po korekcji genów oraz spersonalizowane badania przesiewowe leków poprzez zapewnienie źródła komórek specyficznych dla pacjenta i istotnych dla objawów. Istnieje jednak kilka przeszkód do pokonania, takich jak wyeliminowanie pozostałej ekspresji transgenu czynnika przeprogramowującego po wytworzeniu ludzkich iPSC. Co ważniejsze, resztkowa ekspresja transgenu w niezróżnicowanych ludzkich iPSC może utrudniać prawidłowe różnicowanie i błędnie interpretować istotne dla choroby fenotypy in vitro. Z tego powodu opracowano ludzkie i/lub transgeniczne iPSC wolne od integracji i/lub transgenów przy użyciu kilku metod, takich jak adenowirus, system piggyBac, wektor minicircle, wektory episomalne, bezpośrednie dostarczanie białek i zsyntetyzowane mRNA. Jednak wydajność przeprogramowania przy użyciu metod bezintegracyjnych jest w większości przypadków dość niska.
Tutaj prezentujemy metodę izolowania ludzkich iPSC za pomocą systemu przeprogramowania opartego na wirusie Sendai (wirus RNA). Ta metoda przeprogramowania wykazuje spójne wyniki i wysoką wydajność w opłacalny sposób.
Wprowadzenie
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mają zdolność do samoodnawiania się in vitro i mają pluripotencję, co może być potencjalnie przydatne do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i rozwoju terapii komórkowych do leczenia chorób i uszkodzeń tkanek. Jednak hESC mają ograniczenia w terapii zastępczej komórek ze względu na bariery immunologiczne, onkologiczne i etyczne, a w celu zbadania genów związanych z chorobą, specyficzne dla choroby hESC można wyizolować za pomocą metod preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej (PGD), ale nadal jest to technicznie trudne, a dawstwo zarodków jest dość rzadkie. Zagadnienia te są związane z postępem w biologii komórek macierzystych, który doprowadził do rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).
Ludzkie iPSC są genetycznie przeprogramowane z ludzkich dorosłych komórek somatycznych i posiadają pluripotencjalne cechy podobne do komórek macierzystych hESC, co czyni je użytecznym źródłem dla medycyny regeneracyjnej, takiej jak odkrywanie leków, modelowanie chorób i terapia komórkowa w sposób specyficzny dla pacjenta1,2 .
Do tej pory istnieje kilka metod generowania ludzkich iPSC, w tym transdukcji genów za pośrednictwem wirusów (retrowirus i adenowirus)3, transdukcji genów bez pośrednictwa wirusa (transdukcja systemu BAC i wektorów)4 oraz system dostarczania białek5-7.
Chociaż dostarczenie genów za pośrednictwem wirusa może zapewnić pewien poziom efektywności, wektory wirusowe mogą pozostawić ślad genetyczny, ponieważ integrują się z chromosomami gospodarza, aby wyrazić przeprogramowanie genów w niekontrolowany sposób. Nawet jeśli wirusowa integracja czynników transkrypcyjnych może aktywować lub dezaktywować geny gospodarza8, może spowodować nieoczekiwaną aberrację genetyczną i ryzyko nowotworzenia5,9. Z drugiej strony, donoszono o bezpośrednim wprowadzeniu białek lub RNA do komórek somatycznych, ale ma to pewne wady, takie jak pracochłonna, wielokrotna transfekcja i niski poziom przeprogramowania7,10. Nawet episomalny i nieintegrujący adenowirus, wirus związany z adenowirusem i wektory plazmidowe są nadal stosunkowo mniejwydajne11. Z tych powodów prawdopodobne jest wybranie metod przeprogramowania nieintegracyjnego o wysokiej skuteczności generowania iPSC i mniejszej liczbie nieprawidłowości genetycznych. W tym badaniu używamy przeprogramowania opartego na wirusie Sendai. Wiadomo, że metoda ta nie jest zintegrowana z genomem gospodarza i konsekwentnie wytwarza ludzkie iPSC bez integracji transgenowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórki i mediów (Dzień 1)
- Hodowla i ekspansja ludzkich fibroblastów za pomocą pożywek DMEM zawierających 10% FBS.
- Umieść ludzkie fibroblasty (ryc. 1) na 24-dołkowej płytce z odpowiednią gęstością na studzienkę w dniu poprzedzającym transdukcję.
nuta: Zalecane są następujące rozcieńczenia seryjne (200 K, 100 K, 50 K, 25 K, 12,5 K i 6,25 K), ponieważ różne typy komórek mają różną zdolność przyłączania. - Inkubować komórki jeszcze przez jeden dzień w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 , upewniając się, że komórki w pełni przylegają i są rozciągnięte.
2. Wykonaj transdukcję (dzień 2)
- W dniu transdukcji należy sprawdzić gęstość komórek i wybrać najbardziej efektywne studzienki o gęstości (rysunek 2). Lepiej jest wybrać trzy różne gęstości: wysoką (80 ~ 90%), średnią (50 ~ 70%) i niską (20 ~ 40%).
- Co najmniej 1 godzinę przed transdukcją odessać pożywkę fibroblastów z komórek i wymienić nowe 300 μl pożywki fibroblastowej.
- Wyjmij jeden zestaw 4 różnych probówek z wirusem Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Rozmrozić każdą probówkę w tym samym czasie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka sekund, a następnie wyjąć probówki z łaźni wodnej. Następnie rozmrozić je do temperatury pokojowej; Probówki wirówkowe o masie 6 000 x g przez 10 sekund i umieszczać je na lodzie do czasu użycia. Nie zamrażaj ponownie i nie rozmrażaj wirusa, ponieważ miana nie utrzymają się.
- Dodać wskazane objętości każdej z czterech probówek z wirusem Sendai (Oct-4, Klf-4, c- Myc i Sox-2) do probówki mikrowirówkowej. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany, delikatnie pipetując.
Na przykład, jeśli 50 tys. komórek/jedna studzienka na płytce 24-dołkowej wygląda dobrze na transdukcję:
(Miano oparte na Certyfikacie Analizy od Life Technologies, może się różnić w zależności od partii)
Rurka hOct-4 = 6,0 x 107 CIU, 3 MOI = 5 μl
Rurka hSox-2 = 6,5 x 107 CIU, 3 MOI = 4,6 μl
Rurka hKlf-4 = 6,3 x 107 CIU, 3 MOI = 4,8 μl
Rurka hc-Myc = 7,8 x 107 CIU, 3 MOI = 3,8 μl
Razem = 18,2 μl mieszaniny czterech czynników wirusowych/jeden dołek (50 tys. komórek) z płytki 24-dołkowej - W zależności od gęstości komórek, dodaj 2X, 1X i 0,5X objętość mieszaniny wirusów do studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką od przodu do tyłu, w lewo i w prawo (2X: 36,4 μl mieszaniny wirusów, 1X: 18,2 μl i 0,5X: 9,1 μl).
- Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez noc.
3. Wymiana pożywki hodowlanej (Dzień 3 i Dzień 5)
- 24 godziny po transdukcji zastąp pożywkę 500 μl świeżej pożywki fibroblastowej.
- W dniu 5 zmień pożywkę na świeżą pożywkę fibroblastów.
4. Przygotuj potrawy MEF dla kokultury (Dzień 8)
- Przygotować komórki MEF w 60-milimetrowych szalkach hodowlanych z 10% pożywką DMEM zawartą w FBS na dzień przed przeniesieniem transdukowanego fibroblastu na komórki zasilające MEF.
Uwaga: Używamy 5 x 105 MEF w każdej naczyniu 60 mm.
5. Rozpocznij kokulturację transdukowanych komórek z komórkami zasilającymi MEF (Dzień 9)
- Przed posiewem transdukowanych komórek odessać 10% pożywki DMEM zawierającej FBS z naczyń podajnika MEF i dodać świeżą pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS.
- Usuń pożywkę z transdukowanych fibroblastów, które znajdują się w 24-dołkowej płytce i przemyj komórki raz D-PBS. Dodaj 200 μl 0,25% trypsyny/EDTA do komórek fibroblastów w 24-dołkowej płytce. Po mniej niż 5 minutach inkubacji z trypsyną/EDTA, gdy komórki zaczną odłączać się od płytki, zebrać komórki z pożywką wzrostową w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie odwirować je w 6 000 x g przez 4 min.
nuta: Zaleca się łączenie fibroblastów transdukowanych wirusem 2X, 1X i 0,5X. - Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem i przemyć w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego 4-5 ml świeżej pożywki fibroblastowej w celu zneutralizowania z trypsyny. Następnie odwirować je przy 135 x g przez 4 min.
- Płytki jako gęstość rozcieńczenia szeregowego i rozpocząć kohodowlę z pożywkami fibroblastów na MEF: takich jak 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 i 1/128 na szalkę 60 mm. W zależności od wskaźnika śmierci komórek w pierwszym tygodniu transdukcji, może nie być konieczne rozcieńczanie do gęstości 1/2 lub 1/128. Odłóż na bok pozostałe komórki, aby wyekstrahować całkowite RNA jako pozytywną kontrolę dla Transgene RT-PCR.
- Umieść na noc szalki o średnicy 60 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
6. Podawaj ludzkie embrionalne komórki macierzyste i monitoruj komórki (Dzień 10)
- Następnego dnia zmień pożywkę fibroblastową na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Następnie codziennie zmieniaj pożywkę na ludzką pożywkę ES: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml zamiennika surowicy nokautującej + 10 ml L-glutaminy + 10 ml minimum 10 mM MEM aminokwasów endogennych + 1 ml 2-merkaptoetanolu + 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów.
- Wykonuj codzienną zmianę nośnika za pomocą świeżych ludzkich pożywek ES. Po tygodniu sprawdzaj naczynia raz na 2 ~ 3 dni pod mikroskopem pod kątem tworzenia się grudek komórek przypominających kolonię ES. W zależności od typu komórki, hodowla zajmie mniej lub więcej czasu, zanim zostaną znalezione kolonie.
7. Wybieranie indukowanych pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i rozszerzanie komórek (Dzień 20~)
- Trzy tygodnie po transdukcji kolonie powinny wyglądać na odpowiednio wyrośnięte do zbioru.
- Dzień przed zbiorem rodzin przygotuj karmnik MEF na płytce 24-dołkowej.
UWAGA: Używamy 12,5 x 105 MEF na jednej płytce 24-dołkowej. - Następnego dnia zmień pożywkę szalek MEF z pożywki fibroblastów na ludzką pożywkę ES z 10 μM Y-27632. Za każdym razem ręcznie pobierać jedną kolonię pod mikroskopem w kapturze do wybierania i tworzyć mniejsze grudki za pomocą pipetowania i przenoszenia ich na nowo przygotowane szalki MEF. Spróbuj wybrać kilka klonów.
- Najpierw przejdź i rozszerz każdą studzienkę z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej. Następnie z płytki 6-dołkowej na szalkę 60 mm przed dalszym rozmnażaniem.
8. Charakterystyka ludzkich iPSC (po 10 przejściach)
- Immunofluorescencji
- Umieść ludzkie iPSC na 24-dołkowej płytce i posiew przez 4-5 dni z codzienną wymianą pożywki.
- Aby rozpocząć test immunofluorescencyjny, należy raz przemyć płytkę D-PBS. Następnie natychmiast utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Następnie myj trzy razy w D-PBS przez 5 minut.
- Utrwalone komórki należy traktować 0,1% roztworem Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Zassać roztwór do permeablacji (0,1% roztwór trytona X-100), a następnie dodać 0,5% roztwór blokujący BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Wykonaj detekcję Nanog, Oct-4, SSEA (specyficzny dla etapu antygen embrionalny) i TRA-1-81 (antygen odrzucenia nowotworu) za pomocą przeciwciała antyludzkiego w 0,5% roztworze BSA (sprawdź tabelę materiałów dla szybkości rozcieńczenia przeciwciał). Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy w D-PBS przez 5 minut każdy.
- Sprawdź za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 1 godzinie inkubacji z przeciwciałami anty-mysim IgG Alexa Fluor 488 Goat jako 2 przeciwciałem ND, które rozcieńcza się w stosunku 1:2,000 w 0,5% roztworze BSA w temperaturze pokojowej. Wybarwić wszystkie jądra każdej komórki zasilającej MEF i hiPSC za pomocą DAPI.
- RT-PCR potwierdzenia transgenu
- Ekstrakcja całkowitego mRNA z osadu komórkowego za pomocą odczynników do ekstrakcji RNA.
- Wykonaj odwrotną transkrypcję na podwielokrotnościach (1 μg) całkowitego RNA i wynikowym cDNA do amplifikacji PCR przez odwrotną transkryptazę.
- Przygotować mieszaniny PCR tak, aby zawierały 2 μl matrycy cDNA, 10 μl mieszaniny głównej 2X PCR, 2 μl 2 pmol starterów (do przodu: 1 μl i do tyłu: 1 μl) i 6 μl DW. Aby wykryć ekspresję genu, należy wykonać RT-PCR ze starterami wymienionymi w Tabeli 1.
- Wykonaj RT-PCR z genem GAPDH jako kontrolę skuteczności reakcji amplifikacji. Wizualizacja i analiza produktu PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zwykle zakażone fibroblasty nie wykazują żadnych zmian morfologicznych przez kilka dni po transdukcji wirusem Sendai, lecz pięć dni później zaczynają przybierać inne kształty (Rysunek 1). Jak przedstawiono na prawym panelu Rysunku 1, komórki nie mają już typowej morfologii fibroblastów. Mają okrągły kształt, a ich jądro jest większe od cytoplazmy. Nawet jeśli transdukcję przeprowadzono przy 80% konfluencji komórkowej, po rozpoczęciu przeprogramowania sprawiają one wrażenie mniej konfluen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych na hiPSC niesie ze sobą bezprecedensowe nadzieje w dziedzinie biologii podstawowej, medycyny osobistej itransplantacji. Wcześniej ludzkie generacje iPSC wymagały wirusa DNA, który stwarza ryzyko integracji z genomem gospodarza, co może powodować niepożądane mutacje genetyczne, które ograniczają dalsze zastosowania kliniczne, takie jak opracowywanie leków i terapie transplantacyjne13. Z tego powodu doniesiono o wielu badaniach, w których za pomocą kilku...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lee za cenne dyskusje na temat rękopisu. Prace w laboratorium Lee były wspierane przez granty z Robertson Investigator Award New York Stem Cell Foundation oraz z Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6, MEFs, odporny na neomycynę, poddany działaniu mitomycyny C | Globalna płytka macierzysta | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm lub płytka 12,5 x 105/24-dołkowa |
| Trypsyna EDTA 0,25% Trypsyna z EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaska z pokrywką | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μ M (Magazyn: 10 mM) |
| podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Magazyn: 100 ug) |
| Zamiennik surowicy nokautującej | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco' s Modyfikowane podłoże Eagle (D-MEM, DMEM) (1X), płynne (o wysokiej zawartości glukozy) | Invitrogen | 11965118 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamina-200 mM (100X), płynny | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 1/100 | |
| 2-merkaptoetanol (1,000X), płynny | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hemacytometry kontrastowe Hausser | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0,1% roztwór żelatyny | Milipor | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anty-Tra-1-81 | Sygnalizacja komórkowa | 4745S | 1/200 |
| mysie przeciwciało monoklonalne Oct4 | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R& D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 koza anty-mysz | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami), 1X bez wapnia i magnez | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Zestaw do odwrotnej transkrypcji | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| komornik | sekcyjna NuAire | NU-301 | |
| Nikon | SMZ745 |
Bibliografia
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
