Artykuł metodologiczny

Przepływowa komora adhezji neutrofilów ludzkich

19.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51410

⸱

2 lipca 2014

 ,  ,  , 
1Genetics and Genomic Sciences Graduate Program, University of Alabama at Birmingham, 2Birmingham Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 5Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Zgłoszono metodę ilościowego mierzenia adhezji neutrofili. Ta metoda stwarza dynamiczne środowisko przepływu, podobne do tego spotykanego w naczyniach krwionośnych. Umożliwia badanie adhezji neutrofili do czystych cząstek adhezji (ligand) lub komórkowego podłoża śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do in vivo z naprężeniami ścinającymi.

Streszczenie

Przetrwale przyleganie neutrofili do komórek śródbłonka odgrywa kluczowe role w procesach zapalnych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Proces przetrwalego przylegania neutrofili obejmuje wiele różnych cząstek adhezji, w tym członków rodziny β2 integrin oraz ich przeciwnych receptorów z rodziny ICAM. Ostatnio stwierdzono, że naturalnie występujące warianty genetyczne zarówno β2 integrin, jak i ICAM są związane z chorobami autoimmunologicznymi. Dlatego też ilościowe zdolności adhezji neutrofili pochodzących od osób z różnymi formami alleli tych cząstek adhezji są ważne do zbadania w kontekście mechanizmów leżących u podstaw rozwoju autoimmunizacji. Badania adhezji w systemach komór przepływowych mogą stworzyć środowisko z ciągłym stresem ścinającym, podobnym do tego obserwowanego w środowisku naczyń krwionośnych in vivo. Przedstawiamy tu metodę wykorzystującą system komory przepływowej do badania ilościowych właściwości adhezji ludzkich neutrofili krwi obwodowej do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) oraz do oczyszczonych substratów ligandów. Za pomocą tej metody można ocenić i porównać zdolności adhezji neutrofili od różnych dawców z różnymi wariantami alleli receptorów adhezji. Ta metoda może być również zmodyfikowana do oceny adhezji innych pierwotnych typów komórek lub linii komórkowych.

Wprowadzenie

Odpowiednio warianty genetyczne zarówno w integrinach β2 jak i w ligandach ICAM są obecnie rozpoznawane jako związane z rozwojem chorób autoimmunologicznych1,2. Określenie konsekwencji funkcjonalnych tych wariantów w komórkach pochodzących od osób z tymi wariantami jest niezbędne dla zrozumienia, jak te warianty przyczyniają się do patogenezy chorób autoimmunologicznych. Takie badania funkcjonalne pozwalają na określenie mechanizmów, za pomocą których naturalnie występujące warianty genetyczne kształtują odpowiedź immunologiczną zarówno w zdrowiu jak i chorobie. W konkretnym przykładzie tocznia rumieniowatego układowego wiemy teraz, że warianty w ITGAM (CD11b) i jego ligandzie, ICAM-1, silnie korelują z rozwojem choroby1,2. Ponieważ neutrofile mają kluczowe znaczenie w reakcjach zapalnych, ilościowe badanie adhezji neutrofili może dostarczyć wglądu mechanicznego w to, jak warianty genetyczne w ITGAM/ICAM modyfikują stan zapalny.

Trwała adhezja neutrofili do komórek śródbłonka (EC) jest wysoce regulowanym procesem i odgrywa istotną rolę w reakcjach zapalnych3,4. Trwała adhezja neutrofili następuje po początkowej roli i zatrapieniu neutrofili na śródbłonku i może ostatecznie prowadzić do przemieszczania in vivo. Procesy te obejmują wiele różnych rodzajów cząstek adhezji, w tym ICAM-1, ICAM-2, P-Selectin, E-Selectin na komórkach śródbłonka i β2 integriny na neutrofilach5-9. Dlatego też staranna ilościowa ocena adhezji neutrofili u dawców z różnymi allelicznymi wariantami cząstek adhezji będzie ważna dla zrozumienia funkcjonalnych i patologicznych konsekwencji tych wariantów genetycznych.

Eksperymentalne użycie komory przepływowej może stworzyć in vitro środowisko z ciśnieniem ścinającym płynu podobnym do tego obserwowanego w środowisku naczyń krwionośnych in vivo10-12. Rzeczywiście, próba komory przepływowej sprzężona z ludzkimi komórkami śródbłonka żył wędrowych (HUVEC) może naśladować in vivo środowisko naczynia krwionośnego. Używając tej metody, można badać ogólne właściwości adhezji komórkowej w stosunku do komórek śródbłonka. Ponadto, bardzo kontrolowane środowisko komory przepływowej pozwala również na ocenę wiązania komórek do oczyszczonych ligandów adhezji, takich jak ICAM-1, aby ułatwić badanie specyficznych interakcji receptor-ligand.

Przedstawiamy tu metodę wykorzystującą system badań adhezji komory przepływowej do badania właściwości adhezji ludzkich neutrofili krwi obwodowej do HUVEC i oczyszczonych substratów ligandów. Stosowanie tej metody z komórkami od dawców wyrażających różne alleliczne warianty cząstek adhezji pozwala nam ocenić, jak te warianty genetyczne mogą modyfikować trwałą adhezję ludzkich neutrofili.

Protokół

Wszyscy dawców rekrutowanych do tego badania dali pisemną wyraźną zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez Uniwersytet Alabama w Birmingham Institutional Review Board.

1. Początkowa hodowla i podtrzymywanie HUVEC

  1. Hoduj komórki ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC) in vitro w pełnym pożywkowym podłożu składającym się z bazowego podłoża komórek endotelianych (patrz Lista Materiałów) uzupełnionym o czynniki wzrostu komórek endotelianych.
    Uwaga: Czynniki wzrostu stosowane w tym badaniu obejmują: 5 ng/ml ludzkiego rekombinowanego czynnika wzrostu naskórka (hEGF), 1,0 mg/ml hydrokortyzonu, 50 mg/ml Gentamicin i 50 ng/ml amfoterycyny B (GA-1000), 2% surowicy wołowej (FBS), 0,5 ng/ml czynnika wzrostu komórek endotelianych (VEGF), 10 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów podstawowego z heparyną (hFGF-B), 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego czynnika podobnego do insuliny (R3-IGF-1), 1 μg/ml kwasu askorbinowego i 22,5 μg/ml heparyny. Pełne podłoże przygotowuje się początkowo w 37 °C, a następnie można je przechowywać w 4 °C w celu użycia w ciągu 1 miesiąca od przygotowania.
  2. Aby przygotować kolbę dla komórek, pełne podłoże wzrostowe dodaje się do kolby 75 cm2 (1 ml/5 cm2), a następnie kolba jest pozostawiana do zrównoważenia w 37 °C/5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez co najmniej 30 min. Komórki HUVEC są następnie siewne bezpośrednio do tej zrównoważonej kolby hodowlanyej w gęstości 2500-5000 komórek/cm2.
  3. Podczas gdy podłoże się zrównoważa, szybko rozmroź kolbę z komórkami HUVEC w kąpieli wodnej o 37 °C. Rozprowadź komórki w oryginalnym pojemniku do przechowywania przez wstrząsanie, a następnie dodaj je bezpośrednio do kolby hodowlanyej zawierającej zrównoważone pełne podłoże wzrostowe HUVEC, aby osiągnąć gęstość 2500-5000 komórek/cm2. Delikatnie potrząśnij kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki, a następnie wróć kolbę do inkubatora. Te komórki teraz reprezentują 1st przelew.
  4. Podłoże należy zmieniać co dwa dni, aż komórki osiągną 70-80% konfluencji.
  5. HUVEC mogą teraz być zebrane z kolby hodowlanyej z trypsyną/EDTA. Podłoże hodowlanye jest aspirowany z kolb hodowlanyej, po czym następuje płukanie PBS w celu usunięcia pozostałego białka i wapnia z komórek. Dodaje się 0,25% roztwór trypsyny-EDTA i w ciągu 2-6 min odczepianie komórek powinno być widoczne w mikroskopii świetlnej.
  6. Kiedy 90% komórek jest zaokrąglonych i oderwanych z płytki, zatrzymaj trypsynizację, dodając równą objętość 2x inhibitora trypsyny. Aby ułatwić zbieranie komórek, dodaj kolejną równą ilość pełnego podłoża wzrostowego. Przenieś oderwane komórki do sterylnej 15 ml probówki do wirówki.
  7. Wiruj oderwane komórki przy 225 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Aspiruj nadstan, a następnie zawieś komórki w 2-3 ml pełnego podłoża wzrostowego. Określ stężenie komórek i ich żywotność za pomocą hemocitometru i niebieskiego trypanu.
  8. Aby wykorzystać zebrane komórki do badania, ponownie siej dodatkowe kolby 75 cm2 z komórkami w gęstości 10000 komórek/cm2 i przejdź do kroku 2.2. Alternatywnie, komórki mogą być zamrożone w tym momencie na przyszłe badania. Do zamrażania komórek, zetrzyj komórki przez wirowanie przy 225 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Aspiruj nadstan, a następnie zawieś pellet komórek w FBS zawierającym 10% DMSO w stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Zawiesina komórek jest następnie przenoszona do kolb zamrażających i przechowywana w -80 °C po zamrożeniu komórek w pojemniku do zamrażania komórek.

2. Przygotowanie warstwy HUVEC

  1. Użycie zamrożonych komórek HUVEC 2nd przelewu: przywrócenie i hodowla. Jeśli używane są aktywnie rosnące komórki, przejdź do kroku 2.2.
    1. Szybko rozmroź kolbę zawierającą komórki HUVEC 2nd przelewu z kroku 1.8 w kąpieli wodnej o 37 °C. Przenieś komórki z kolby do 15 ml sterylnej probówki do wirówki i dodaj 10 ml podłoża wzrostowego.
    2. Wiruj komórki przy 200 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i aspiruj nadstan, aby usunąć resztki DMSO.
    3. Zawieś pellet komórek w pełnym podłożu wzrostowym i przenieś komórki do kolby 75 cm2. Dodaj podłoże wzrostowe do łącznej objętości około 20-25 ml i inkubujej w 37 °C/5% CO2.
  2. Codziennie wizualnie sprawdzaj hodowlę komórek na konfluencję z zmianą podłoża co dwa dni. Zazwyczaj

Wyniki

Przykłady wiązania neutrofili do wyczyszczonego ligandu (ICAM-1/P-Selectin) powlekanej komory przepływowej (Rysunek 2) lub wiązania neutrofili do powlekanej komory przepływowej HUVEC (Rysunek 3) są pokazano. Jak pokazano na rysunkach, neutrofile nadal gromadzą się/przywierają do powlekanej powierzchni lub HUVEC w warunkach ciągłego przepływu. W naszych typowych warunkach eksperymentalnych, możemy zaobserwować 50-70 ludzkich neutrofili mocno przywierających do powlekanej powierzchni lub HUVEC w ciągu czterominutowego okresu nagrywania. Jednakże alleliczne warianty cząsteczek wiązania neutrofili, lub alleliczne warianty w podłożu (wyczyszczony ligand lub HUVEC), mogą znacząco zmienić ilościowe wiązanie neutrofili14.

Ocenialiśmy również zależność czasową zdarzeń wiązania neutrofili obserwowanych w naszych badaniach. Podczas gdy utrzymujemy stałe warunki przepływu, jest możliwe, że właściwości adhezji komórek zmieniają się w czasie. Jednakże względem stosunkowo krótkich przebiegów czasowych w naszych badaniach, nie obserwujemy żadnych spójnych różnic w tempie adhezji w czasie. Na przykład, ocena adhezji w punktach czasowych 1-2 minuty w porównaniu z adhezą zaobserwowaną między punktami czasowymi 3-4 minuty nie jest konsekwentnie różna. Oczywiście, jeśli komórki są stymulowane podczas eksperymentu adhezji, to zmiany właściwości adhezji w czasie mogą być oczekiwane.

W naszych badaniach kontrolowaliśmy aktywację neutrofili indukowaną izolacją, celowo inicjując komórki z niską dawką fMLP (10-8 M) przez 10 min przed badaniem. Komórki śródbłonkowe (HUVEC w naszych badaniach) również wymagają wcześniejszej aktywacji, aby podnieść ekspresję cząsteczek adhezji dla optymalnego mocnego wiązania leukocytów. W przypadku braku wstępnego leczenia, komórki śródbłonkowe (HUVEC) będą wspierać bardzo niewielką adhezę neutrofili. W naszych badaniach stosowano leczenie 10 ng/ml TNFα przez 4-6 godzin przed użyciem. IL-1β (10 ng/ml) i LPS (0,5-1 µg/ml) mogą być również użyte do wstępnego aktywowania komórek śródbłonkowych. Co ważne, nieleczone HUVEC mogą być użyte jako negatywna kontrola, aby upewnić się, że adhezja komórek jest spowodowana specyficznymi (opartymi na receptorach) interakcjami neutrofil-komórka śródbłonkowa. Alternatywnie, przeciwciała przeciw receptorom mogą być użyte, aby zablokować określone receptory, aby ocenić specyficzność adhezji.

Ustawienia mikroskopu do badania komory przepływowej; diagram pokazuje pompę strzykawkę, próżnię i kontrolę przepływu PMN.
Rysunek 1. Konfiguracja komory przepływowej na scenie mikroskopu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zdjęcia z mikroskopii time-lapse pokazujące ruch komórek, pokazujące dynamiczne zmiany co minutę.
Rysunek 2. Zdjęcia z próbki wideo neutrofili przywierających do powierzchni powlekanej ICAM-1/P-Selectin w różnych punktach czasowych (A: 0 punkt czasowy, B: 1 punkt czasowy, C: 2 punkty czasowe i D: 4 punkty czasowe). Stężenie ICAM-1 wynosi 25 µg/ml, a P-Selectin to 0,5 µg/ml. Prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 µl/min, a gęstość neutrofili wynosi 500 000 komórek/ml.

Mikroskopowe zdjęcia time-lapse pokazujące wzrost kultury komórkowej przez cztery punkty czasowe dla badania migracji komórek.
Rysunek 3. Zdjęcia z próbki wideo neutrofili przywierających do powierzchni powlekanej HUVEC w różnych punktach czasowych (A: 0 punkt czasowy, B: 1 punkt czasowy, C: 2 punkty czasowe i D: 4 punkty czasowe). Prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 µl/ml, a gęstość neutrofili wynosi 500 000 komórek/ml.

GatunekLokalizacjaStres ścinający (dyne/

Dyskusja

Ten protokół przedstawia metodę separacji i izolacji minimalnie aktywowanych neutrofili w celu dokładnego określenia adhezji neutrofili w warunkach stresu ścinającego. Adhezja neutrofili jest krytycznym procesem w zapaleniu. Ponieważ udowodniono, że warianty genetyczne wielu cząstek w tym procesie predysponują do rozwoju chorób autoimmunologicznych1,2, wymagany jest system testowy zdolny do ilościowej oceny adhezji neutrofili u ludzi. Metoda opisana w tym protokole pozwala na dokładne i ilościowe określenie potencjału adhezji neutrofili w kontrolowanym środowisku in vitro w warunkach stresu ścinającego. Ta metoda pozwala więc na bezpośrednie porównanie ilościowej adhezji neutrofili między osobnikami o zgenotypowanych allelami, aby określić znaczenie zmienności genetycznej w cząsteczkach adhezji14.

Kilka kroków w tej metodzie wymaga starannego rozważenia, aby osiągnąć wysoce ilościowe i powtarzalne wyniki. W przygotowaniu HUVEC, kluczowe jest osiągnięcie 100% konfluencji komórek przed użyciem ich w komorze przepływowej. W przypadku powierzchni pokrytych oczyszczonym ligandem, obszar powierzchni pokrywającej substrat nigdy nie powinien wyschnąć, aby uniknąć denaturacji ligandu. Ponadto przygotowanie ludzkich neutrofili jest kluczowe dla sukcesu eksperymentu. Kluczowe zagadnienia w izolowaniu neutrofili z krwi obejmują delikatne manipulowanie poprzez minimalizowanie wirowania, aby uniknąć aktywacji, utrzymanie komórek w temperaturze pokojowej (tj. krew nie powinna być przechowywana na lodzie, a kroki wirowania powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej) i zakończenie izolacji i eksperymentu w jak najkrótszym czasie. Istnieją dodatkowe metody izolacji neutrofili, które również mogą być wykorzystane do przygotowania komórek do tych testów17,18.

Z praktycznego punktu widzenia, testy adhezji z użyciem świeżo izolowanych ludzkich neutrofili powinny być rozpoczynane w ciągu 3-6 godzin po pobraniu krwi uczestnika. Ponieważ neutrofile są niezwykle wrażliwe na manipulację, przedłużone czasy między pobraniem krwi a zastosowaniem mogą wpłynąć na wyniki testu. Dokładne określenie stężenia komórek neutrofili przed testem w komorze przepływowej jest również konieczne, aby osiągnąć dokładne i powtarzalne wyniki.

Podczas testu w komorze przepływowej, ważne jest dokładne monitorowanie nagrań wideo, aby upewnić się, że prędkość przepływu jest jednolita i nie ma turbulencji w ciągu całego eksperymentu. Zmiany w prędkości przepływu lub obecność turbulencji wymagałyby powtórzenia eksperymentu. Po zakończeniu eksperymentu ważne jest również mikroskopowe ocena pozostałych neutrofili, aby upewnić się, że neutrofile nie kłębiają się. Kłębkowanie w tym momencie wskazywałoby na aktywację neutrofili, co mogłoby znacząco zmienić gęstość neutrofili podczas eksperymentu.

Komora przepływowa tworzy prawie jednorodny stres ścinający wewnątrz komory (τ=6Qμ/(wh2), gdzie Q=szybkość przepływu, μ=lepkość dynamiczna, a w=szerokość komory przepływowej, h=wysokość komory przepływowej15). W naszych badaniach użyliśmy szybkości przepływu 350 µl/min na adhezję neutrofili, co tworzy stres ścinający 1,5 dyn/cm2 (w=0,25 cm, h=0,01 cala, lepkość wody w 37 °C (0,007 poise) została użyta jako przybliżenie lepkości medium RMPI). Dla konkretnej komory przepływowej można zmienić szybkość przepływu, aby osiągnąć różne poziomy stresu ścinającego, aby naśladować różne warunki fizjologiczne. Typowy fizjologiczny stres ścinający w ludzkich naczyniach krwionośnych może wahać się od 0,5 do 5,0 dyn/cm 13,16. Stres ścinający w innych naczyniach krwionośnych i u innych zwierząt przedstawiono w Tabeli 1113,16,19  20.

Chociaż nasza metoda koncentruje się na badaniu adhezji ludzkich neutrofili, metoda ta nie jest ograniczona do neutrofili i może być łatwo zastosowana do badań adhezji lub toczenia innych typów komórek przy prostych modyfikacjach. Również, podłoża w tej metodzie mogą być zmieniane dla różnych celów.

Chociaż ten protokół jest łatwo przystosowywalny do różnych badań, istnieją pewne ograniczenia. Protokół zaimplementowany tutaj wymaga dużej liczby komórek pierwotnych do analizy. Może to uniemożliwić analizę komórek pierwotnych z małych zwierząt. Ponadto potrzeba unieruchomienia oczyszczonych ligandów adhezji w aktywnej/dostępnej konformacji może ograniczać zakres ligandów. Stosowanie białek fuzyjnych Fc znacznie zwiększa szanse na osiągnięcie właściwej konformacji ligandu na powierzchni płytki. Mimo to, nasza metoda ma znaczną elastyczność, aby pozwolić na ilościową analizę zdarzeń adhezji. Te badania znacznie poprawią nasze zrozumienie par receptor-liganda adhezji oraz potencjalnego znaczenia funkcjonalnego wariantów genetycznych w tych białkach w patogenezie chorób u ludzi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest sponsorowana przez Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 i NIH UL1-TR00165. Dziękujemy dr Robertowi P. Kimberly za jego ciągłe wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsin/EDTALife technologies25200-056z Czerwonym Fenolem
2x inhibitor TrypsynyLife technologiesR-002-100
35 mm naczynie do hodowli tkankowejCorning Inc.430165Standardowa powierzchnia przeznaczona do hodowli tkankowej
75 cm2 kolba do hodowli tkankowejCorning Inc.430641Standardowa powierzchnia przeznaczona do hodowli tkankowej
Kamera CCDDage-MTIModel 300T-RC
Pojemnik do zamrażania komórek BiocisionBCS-045
EBM-2Lonza Inc.CC-3156Podstawowe środowisko do hodowli HUVEC
EGM-2 BulletkitLonza IncCC-4176Czynniki wzrostu HUVEC dla podstawowego środowiska
FBSLife technologies10082-147Certyfikowane, termicznie inaktywowane
ŻelatynaSigmaG9391z byczej skóry
HemocytometrFisher scientific02-671-51B
FibronektynaSigmaF2006z ludzkiej osocza
Komora przepływowaGlyco Tech31-001Okrągła komora przepływowa dla 35 mm naczyń
fMLPSigma47729
Histopaque-11191Sigma11191Ciężki Ficoll
HUVECLonza Inc.CC-2517A
ICAM-1R&D Systems720-ICChimera Fc
Środek do separacji limfocytówMediatech Inc.25072CVLekki Ficoll
MikroskopZeissAxiovert 100
Środowisko RPMI 1640Life technologies11875z L-glutaminą i Czerwonym Fenolem
Proteina ASigmaP6031Resuspendowana w PBS
P-SelectinaR&D Systems137-PSChimera Fc
Pompa strzykawkowaKD ScientificKDS270
TNF-αLife technologiesPHC3015Rekombinowana ludzka białko
Roztwór niebieskiego trypanu, 0,4%Life technologies15250-061

Bibliografia

  1. Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
  2. Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
  3. Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
  4. Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
  5. Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
  6. Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
  7. Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
  8. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
  9. Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
  10. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
  11. van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
  12. Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
  13. Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
  14. Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
  15. Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
  16. Kucik, D. F., Wu, C. . Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
  17. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
  18. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
  19. Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
  20. Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

S owa kluczowe Adhezja Neutrofil wKom rki EndotelialneZapalenie2 IntegrynaICAMChoroba AutoimmunologicznaKomora Przep ywowaNapr enie SzyboweHUVECReceptory Adhezyjne Adhezja Neutrofil wKom rki EndotelialneZapalenie2 IntegrynaICAMChoroba AutoimmunologicznaKomora Przep ywowaNapr enie SzyboweHUVECReceptory Adhezyjne

Powiązane artykuły