Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.
Artykuł metodologiczny
Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mocne przyleganie neutrofili do komórek śródbłonka odgrywa kluczową rolę w stanach zapalnych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Proces silnej adhezji neutrofili obejmuje wiele różnych cząsteczek adhezyjnych, w tym członków rodziny integryn β2 i ich przeciwreceptory z rodziny ICAM. Ostatnio doniesiono, że naturalnie występujące warianty genetyczne zarówno w integrynach β2, jak i ICAM są związane z chorobą autoimmunologiczną. W związku z tym ilościowa zdolność adhezyjna neutrofili od osób z różnymi formami alleli tych cząsteczek adhezyjnych jest ważna do zbadania w odniesieniu do mechanizmów leżących u podstaw rozwoju autoimmunizacji. Badania adhezji w systemach komór przepływowych mogą stworzyć środowisko o naprężeniu ścinającym płynu podobnym do tego, które obserwuje się w środowisku naczyń krwionośnych in vivo. W niniejszej pracy przedstawiono metodę wykorzystującą system testów w komorze przepływowej do badania ilościowych właściwości adhezyjnych ludzkich neutrofili krwi obwodowej do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) oraz do oczyszczonych substratów ligandów. Dzięki tej metodzie można ocenić i porównać zdolności adhezyjne neutrofili od dawców z różnymi wariantami alleli w receptorach adhezyjnych. Metoda ta może być również modyfikowana w celu oceny adhezji innych pierwotnych typów komórek lub linii komórkowych.
Wprowadzenie
Warianty genetyczne zarówno w integrynach β2, jak i w ligandach ICAM są obecnie uznawane za związane z rozwojem choroby autoimmunologicznej1,2. Określenie funkcjonalnych konsekwencji tych wariantów w komórkach pochodzących od osób z tymi wariantami jest niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób te warianty przyczyniają się do patogenezy chorób autoimmunologicznych. Takie badania funkcjonalne pozwalają na określenie mechanizmów, za pomocą których naturalnie występujące warianty genetyczne kształtują odpowiedź immunologiczną zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. W konkretnym przykładzie SLE wiemy teraz, że warianty ITGAM (CD11b) i jego liganda, ICAM-1, silnie wiążą się z rozwojem choroby1,2. Ponieważ neutrofile mają kluczowe znaczenie w reakcjach zapalnych, ilościowe badanie adhezji neutrofili może dostarczyć mechanistycznego wglądu w to, jak warianty genetyczne w ITGAM/ICAM zmieniają stan zapalny.
Mocne przyleganie neutrofili do komórek śródbłonka (EC) jest procesem wysoce regulowanym i odgrywa istotną rolę w reakcjach zapalnych3,4. Silne przyleganie neutrofili następuje po początkowym zwijaniu i wychwytywaniu neutrofili w EC i ostatecznie może prowadzić do transmigracji in vivo. Procesy te obejmują wiele różnych rodzajów cząsteczek adhezyjnych, w tym ICAM-1, ICAM-2, P-selektynę, E-selektynę na komórkach śródbłonka i integryny β2 na neutrofilach5-9. W związku z tym dokładna kwantyfikacja adhezji neutrofili od dawców z różnymi wariantami alleli cząsteczek adhezyjnych będzie ważna dla zrozumienia funkcjonalnych i patologicznych konsekwencji tych wariantów genetycznych.
Eksperymentalne użycie komory przepływowej może stworzyć środowisko in vitro z naprężeniami ścinającymi płyn podobnymi do tych obserwowanych w środowisku naczyń krwionośnych in vivo10-12. Rzeczywiście, test w komorze przepływowej w połączeniu z ludzką komórką śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) może naśladować środowisko in vivo naczynia krwionośnego. Za pomocą tej metody można zbadać ogólne właściwości adhezji komórkowej w stosunku do komórki śródbłonka. Ponadto wysoce kontrolowane środowisko komory przepływowej umożliwia również ocenę wiązania komórek z oczyszczonymi ligandami adhezyjnymi, takimi jak ICAM-1, w celu ułatwienia badania specyficznych interakcji receptor-ligand.
Prezentujemy tutaj metodę wykorzystującą system testów adhezyjnych w komorze przepływowej do badania właściwości adhezyjnych neutrofili ludzkiej krwi obwodowej do HUVEC i do oczyszczonych substratów ligandów. Zastosowanie tej metody z komórkami od dawców wykazującymi ekspresję różnych wariantów alleli cząsteczek adhezyjnych pozwala nam ocenić, w jaki sposób te warianty genetyczne mogą zmienić silną adhezję ludzkich neutrofili
.Protokół
Wszyscy dawcy zrekrutowani do tego badania wyrazili pisemną świadomą zgodę i badanie zostało zatwierdzone przez University of Alabama at Birmingham Institutional Review Board.
1. Kultura początkowa i subkultura HUVEC
- Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) in vitro w kompletnym pożywce wzrostowej, która składa się z podłoża podstawnego komórek śródbłonka (patrz wykaz materiałów) uzupełnionego czynnikami wzrostu komórek śródbłonka.
Uwaga: Czynniki wzrostu użyte w tym badaniu obejmują: 5 ng/ml ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (hEGF), 1,0 mg/ml hydrokortyzonu, 50 mg/ml gentamycyny i 50 ng/ml amfoterycyny-B (GA-1000), 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), 10 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów-zasadowego z heparyną (hFGF-B), 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego insulinopodobnego czynnika wzrostu (R3-IGF-1), 1 μg/ml kwasu askorbinowego i 22,5 μg/ml heparyny. Kompletne podłoże przygotowuje się początkowo w temperaturze 37 °C, a następnie można je przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w ciągu 1 miesiąca od przygotowania. - Aby przygotować kolbę dla komórek, kompletną pożywkę wzrostową dodaje się do kolby do hodowli tkankowej o długości 75cm2 (1 ml/5 cm2), a następnie kolbę pozostawia się do zrównoważenia do 37 °C/5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez co najmniej 30 minut. Ludzki HUVEC zostanie wysiew bezpośrednio do tej zrównoważonej kolby hodowlanej o gęstości 2 500-5 000 komórek/cm2.
- Podczas gdy podłoże się równoważy, szybko rozmrozić kriowial HUVEC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozproszyć komórki w oryginalnej fiolce do przechowywania przez wirowanie, a następnie dodać je bezpośrednio do kolby hodowlanej zawierającej wstępnie zrównoważoną kompletną pożywkę wzrostową HUVEC, aby osiągnąć gęstość 2,500-5,000 komórek/cm2. Delikatnie kołysz kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki, a następnie włóż kolbę z powrotem do inkubatora. Te komórki reprezentują teraz 1. przejście.
- Pożywkę należy zmieniać co dwa dni, aż komórki zlewają się w 70-80%.
- HUVEC można teraz zbierać z kolby hodowlanej za pomocą trypsyny/EDTA. Pożywka hodowlana jest odsysana z kolb hodowlanych, a następnie płukana PBS w celu usunięcia wszelkich pozostałości białka i wapnia z komórek. Dodaje się 0,25% roztwór trypsyny-EDTA i w ciągu 2-6 minut powinno być widoczne oderwanie komórek, co oceniano za pomocą mikroskopii świetlnej.
- Gdy 90% komórek zostanie zaokrąglonych w górę z płytki, zatrzymaj trypsynizację, dodając równą objętość 2x inhibitora trypsyny. Aby ułatwić zbieranie komórek, dodaj kolejną równą ilość kompletnej pożywki wzrostowej. Przenieść oderwane komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Odwirować oderwane komórki o masie 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 2-3 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Określ stężenie i żywotność komórek za pomocą hemacytometru i błękitu trypanowego.
- Aby wykorzystać zebrane komórki do badań, należy ponownie zasiać dodatkowe kolby o długości 75cm2 komórkami o gęstości 10 000 komórek/cm2 i przejść do kroku 2.2. Alternatywnie, komórki mogą zostać zamrożone w tym momencie do przyszłych badań. W celu zamrożenia komórek, granulować komórki przez odwirowanie przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w FBS zawierającym 10% DMSO w stężeniu 1 x 10,6 komórek/ml. Zawiesina komórek jest następnie przenoszona do kriowiali i przechowywana w temperaturze -80 °C po zamrożeniu komórek w pojemniku do zamrażania komórek.
2. Przygotowanie warstwy HUVEC
- Użycie zamrożonych HUVEC 2przejścia: odrodzenie i kultura. Jeśli używasz aktywnie rosnących komórek, przejdź do kroku 2.2.
- Szybko rozmrozić kriowial zawierający 2. pasaż HUVEC z kroku 1.8 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś komórki z kriowialu do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 10 ml pożywki wzrostowej.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant w celu usunięcia pozostałości DMSO.
- Zawiesić osad komórkowy z kompletną pożywką wzrostową i przenieść komórki do kolby o długości75 cm2. Dodać pożywkę wzrostową do całkowitej objętości około 20-25 ml i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Zbadaj wzrokowo kulturę komórkową pod kątem zbiegu każdego dnia ze zmianami pożywki co dwa dni. Zwykle w ciągu 2-4 dni komórki osiągną 80-90% zbieżności, po czym będą gotowe do użycia w teście w komorze przepływowej.
- Aby przygotować naczynie do hodowli, które będzie używane w komorze przepływowej (patrz sekcja 5), należy dodać 1 ml 10 μg/ml fibronektyny i 0,05% (m/v) żelatyny do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i kilkakrotnie odpipetować, aby upewnić się, że cała powierzchnia płytki jest pokryta. Usuń nadmiar roztworu fibronektyny i żelatyny i susz płytkę na powietrzu przez co najmniej 30 minut, aby zoptymalizować tworzenie matrycy białkowej. Roztwór fibronektyny i żelatyny można ponownie użyć do 10 razy.
- Zbierz komórki HUVEC z kroku 2.2 za pomocą trypsyny-EDTA, jak opisano w krokach 1.5-1.7. Wysiewaj 500 000 komórek do każdego powlekanego naczynia do hodowli tkankowej. Dodać 2 ml pożywki wzrostowej do każdego naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Pozwól komórkom rosnąć do zbieżności, jak w kroku 2.2. Komórki powinny być codziennie sprawdzane wizualnie ze zmianami podłoża co dwa dni. Przed testem w komorze przepływowej należy zalać HUVEC ludzkim α TNF- o stężeniu 20 ng / ml przez 4-6 godzin, aby zwiększyć i stymulować ekspresję cząsteczki adhezyjnej.
3. Oczyszczona powłoka ligandowa
- Narysuj okrąg o średnicy 0,5 cm markerem lub pisakiem na środku naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm.
- Tabliczka 20 μl 20 μg/ml białka A w zaznaczonym obszarze. Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić roztwór białka A, aby pokryć cały obszar w okręgu o średnicy 0,5 cm. Ważne jest, aby nie dotykać ani nie drapać powierzchni naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Umyj płytkę pokrytą białkiem A 3x 1 ml PBS (pH 8,0).
- Płytka 50 μl 1% BSA w zaznaczonym obszarze, aby zablokować niespecyficzne wiązanie na płytce. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- Umyć zablokowaną płytkę 3 razy 1 ml PBS, jak w kroku 3.3.
- Przygotować roztwory białek chimerycznych ligandów receptora adhezji Fc do powlekania. W tym eksperymencie użyto roztworu chimery ICAM-1/Fc w stężeniu 25 μg/ml i chimery P-Selectin/Fc w stężeniu 0,5 μg/ml w PBS (pH 8,0).
- Pokryj zaznaczony obszar 50 μl podłoża. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Naczynie należy zużyć w ciągu dwóch dni, a pokryty obszar nie powinien wyschnąć. W razie potrzeby dodać PBS, aby utrzymać 50 μl roztworu na płytce.
4. Separacja neutrofili (wszystkie etapy wykonywane w temperaturze pokojowej)
- Po uzyskaniu świadomej zgody należy pobrać krew uczestnika przez flebotomię do probówki do pobrania krwi przeciwzakrzepowej lub wakutainera (EDTA lub heparyna). Po pobraniu krwi rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 za pomocą PBS przed rozdzieleniem.
- Przygotować dwuwarstwowy Ficoll do oddzielania PBMC i neutrofili w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Najpierw dodaj 15 ml ciężkiego Ficollu (patrz Lista materiałów, ρ=1.118-1.120), a następnie ostrożnie ułóż 10 ml lekkiego Ficollu (patrz Lista materiałów, ρ=1.077-1.080) na wierzch ciężkiego Ficollu. Powinna istnieć ostra granica między lekkimi warstwami Ficoll i ciężkimi Ficoll. Na koniec ostrożnie ułóż 25 ml rozcieńczonej próbki krwi na wierzchu lekkiego Ficollu, nie naruszając warstwy Ficoll.
- Odwirować probówkę o sile 250 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Hamulec wirnika wirówki powinien być wyłączony na czas tych wirów, aby zminimalizować potencjalne zakłócenie separacji komórek podczas zwalniania wirnika pod koniec wirowania. Po odwirowaniu obecne są następujące warstwy (od góry do dołu): górna warstwa to osocze, po której następuje warstwa PBMC na wierzchu lekkiej warstwy Ficoll, warstwa neutrofili z niewielką liczbą czerwonych krwinek (RBC) znajduje się między lekkim i ciężkim Ficollem, a następnie ciężką warstwą Ficoll i RBC na dnie probówki.
- Zebrać i przenieść warstwę neutrofili do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety do przenoszenia, dodać PBS do końcowej objętości 50 ml i odwirować przy 225 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Po odwirowaniu nadal mogą występować erytrocyty zmieszane z neutrofilami. Odessać supernatant do oznaczenia 10 ml. Zawiesić osad neutrofili-RBC przez delikatne mieszanie probówki (lub krótkie wirowanie z małą prędkością), a następnie ponownie przemyć 50 ml PBS.
- Po drugim przemyciu odessać supernatant. Aby usunąć zanieczyszczające erytrocyty, ponownie zawiesić granulowane komórki w pozostałym PBS przez mieszanie (lub krótkie wirowanie), dodać 25 mlH2Oi delikatnie wirować przez 10 sekund w celu lizy RBC.
- Dodać 25 ml 1,8% NaCl i natychmiast wymieszać przez odwirowanie przy 225 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zanieczyszczające erytrocyty powinny teraz zostać poddane lizie, pozostawiając białą osadę komórek neutrofilowych.
- Przemyć osad komórek neutrofilowych za pomocą PBS.
- Ponownie zawiesić wyizolowane neutrofile w pożywce RPMI z 10% FBS i określić stężenie komórek pod mikroskopem świetlnym za pomocą hemocytometru.
- Dostosuj gęstość komórek do 500 000 komórek/ml za pomocą kompletnego podłoża RPMI-10% FBS.
5. Test adhezji w komorze przepływowej
- Zamontuj komorę przepływową. Umieścić na stole mikroskopowym szalkę o średnicy 35 mm zawierającą zbiegające się HUVEC lub oczyszczone ligandy receptora adhezyjnego. Połącz równoległą komorę przepływu płytki z pompą strzykawkową, systemem próżniowym i pozostaw jedną linię otwartą dla wejścia neutrofili. Włóż komorę przepływową na górę płyty i zamocuj zespół komory przepływowej13. (Patrz rysunek 1)
- Uruchom program do nagrywania wideo na komputerze podłączonym do mikroskopu. Dostosuj pole i ostrość mikroskopu, aż pojawi się czyste pole z w pełni rozwiniętymi komórkami HUVEC lub pole w obszarze powłoki liganda.
- Za pomocą pompy strzykawkowej przepłukać komorę przepływową medium RPMI. Upewnij się, że w komorze lub przewodzie wejściowym neutrofili nie ma pęcherzyków powietrza.
- W razie potrzeby neutrofile można zagruntować małą dawką (10-8 M) fMLP przez 10 minut. Pozwoli to na dopasowanie podstawowego poziomu aktywacji neutrofili u różnych dawców14.
- Za pomocą pompy strzykawkowej wstrzyknąć neutrofile do komory przepływowej z określonymi prędkościami (w tym badaniu stosuje się prędkość 350 μl/min, co odpowiada naprężeniu ścinającemu 1,5 dyn/cm2). Nagraj wideo. Ponieważ adhezja neutrofili może wystąpić szybko, film o długości 4-5 minut jest zwykle wystarczający do ilościowego określenia zdarzeń adhezji do analizy.
- Komórkę przylegającą definiuje się jako komórkę, która porusza się o mniej niż jedną średnicę komórki w ciągu 5 sekund po powierzchni pokrytej HUVEC lub ligandem15,16. Policz całkowitą liczbę przylegających komórek w polu obecnym w nagranym wideo przy użyciu tej reguły. Nagrywając filmy o podobnej długości z neutrofilami różnych dawców, można obliczyć przylegające komórki/min, aby porównać właściwości adhezyjne między różnymi dawcami.
Wyniki
Przedstawiono przykłady wiązania neutrofili do komory przepływowej pokrytej oczyszczonym ligandem (ICAM-1/P-Selectin) (Rycina 2) oraz wiązania neutrofili w teście z komorą przepływową pokrytą komórkami HUVEC (Rycina 3). Jak pokazano na rycinach, neutrofile nadal gromadzą się/przylegają do pokrytej powierzchni lub komórek HUVEC w warunkach ciągłego przepływu. W naszych typowych warunkach eksperymentalnych możemy zaobserwować 50-70 ludzkich neutrofili silnie przylegających do pokrytej powierzchni lub komórek HUVEC podczas czterominutowego okresu rejestracji. Jednakże warianty alleliczne cząsteczek adhezyjnych neutrofili lub warianty alleliczne w podłożu (oczyszczony ligand lub HUVEC) mogą znacząco zmienić ilościową adhezję neutrofili14.
Oceniliśmy również zależność czasową zdarzeń adhezji neutrofili zaobserwowanych w naszych badaniach. Przy zachowaniu stałych warunków przepływu istnieje możliwość, że właściwości adhezyjne komórek zmieniają się w czasie. Jednak w stosunkowo krótkich odstępach czasu w naszych badaniach nie zaobserwowano żadnych spójnych różnic w tempie adhezji wraz z upływem czasu. Na przykład ocena adhezji w punktach czasowych 1-2 min w porównaniu do adhezji obserwowanej między 3-4 min nie wykazuje spójnych różnic. Oczywiście, jeśli komórki są stymulowane podczas eksperymentu adhezyjnego, można spodziewać się zmian właściwości adhezyjnych w czasie.
W naszych badaniach kontrolowaliśmy aktywację neutrofili wywołaną izolacją poprzez celowe primowanie komórek niską dawką fMLP (10-8 M) przez 10 min przed badaniem. Komórki śródbłonka (w naszych badaniach HUVEC) również wymagają uprzedniej aktywacji w celu zwiększenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych dla optymalnej trwałej adhezji leukocytów. W przypadku braku wstępnej obróbki, komórki śródbłonka (HUVECs) wykazują bardzo niską adhezję neutrofili. W naszych badaniach stosowaliśmy traktowanie TNFα w stężeniu 10 ng/ml przez 4-6 h przed użyciem. Do wstępnej aktywacji komórek śródbłonka można również użyć IL-1β (10 ng/ml) oraz LPS (0,5-1 µg/ml). Co ważne, niepoddane obróbce komórki HUVEC mogą służyć jako kontrola negatywna w celu potwierdzenia, że adhezja komórek jest wynikiem specyficznych (zależnych od receptorów) oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka. Alternatywnie, w celu oceny specyficzności adhezji można zastosować przeciwciała antyreceptorowe do zablokowania konkretnych receptorów.
Rysunek 1. Konfiguracja komory przepływowej na stoliku mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Przekroje z przykładowego filmu przedstawiającego adhezję neutrofili do powierzchni pokrytej ICAM-1/P-Selectiną w różnych punktach czasowych (A: punkt czasowy 0, B: punkt czasowy 1 min, C: punkt czasowy 2 min oraz D: punkt czasowy 4 min). Stężenie ICAM-1 wynosi 25 µg/ml, a P-Selectiny 0.5 µg/ml. Prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 µl/min przy gęstości neutrofili 500,000 cells/ml.
Rysunek 3. Zrzuty ekranu z przykładowego filmu przedstawiającego adhezję neutrofili do powierzchni pokrytej komórkami HUVEC w różnych punktach czasowych (A: punkt czasowy 0, B: punkt czasowy 1 min, C: punkt czasowy 2 min oraz D: punkt czasowy 4 min). Prędkość przepływu neutrofili wynosi 350 µl/ml przy gęstości neutrofili 500,000 cells/ml.
| Gatunki | Lokalizacja | Naprężenie ścinające (dyn/cm²2) |
| Człowiek | Tętnica szyjna wspólna | 11.6 |
| Człowiek | Tętnica skrzelowa | 6.5 |
| Człowiek | Tętnica udowa wspólna | 4.3 |
| Człowiek | Aorta nadnerczowa | 7.3 |
| Człowiek | Aorta nadtrzonkowa | 4.2 |
| Człowiek | Tętnica udowa powierzchowna | 4.4 |
| Człowiek | Żyłki | 0.5-5.0 |
| Człowiek | Pierwsze tętniczki siatkówki | 40.2 |
| Człowiek | Drugie tętniczki siatkówkowe | 0.001 |
| Człowiek | Pierwsze żyły siatkówkowe | 23.2 |
| Człowiek | Drugorzędowe żyły siatkówkowe | 0.43 |
| Pies | Tętnica szyjna wspólna | 15.8 |
| Królik | Tętnica szyjna wspólna | 23.3 |
| Szczur | Tętnica szyjna wspólna | 46.6 |
| Mysz | Tętnica szyjna wspólna | 64.8 |
| Pies | Tętnica udowa wspólna | 9.8 |
| Królik | Tętnica udowa wspólna | 156.8 |
| Szczur | Tętnica udowa wspólna | 65.9 |
Tabela 1. Przykładowe naprężenia ścinające w różnych narządach i gatunkach.
* opracowano na podstawie referencji 13, 16, 19 i 20.
Dyskusja
Protokół ten kieruje separacją i izolacją minimalnie aktywowanych neutrofili w celu dokładnego ilościowego określenia adhezji neutrofili w warunkach zwykłego stresu. Adhezja neutrofili jest krytycznym procesem w zapaleniu. Ponieważ wykazano, że warianty genetyczne w wielu cząsteczkach w tym procesie predysponują do rozwoju choroby autoimmunologicznej1,2, wymagany jest system testowy zdolny do ilościowej oceny twardej adhezji ludzkich neutrofili. Metoda opisana w tym protokole pozwala na dokładne i ilościowe określenie potencjału klejenia twardego neutrofili w kontrolowanym środowisku in vitro w warunkach czystego stresu. Metoda ta pozwala zatem na bezpośrednie porównanie ilościowej adhezji neutrofili między osobnikami zgenotypowanymi w celu określenia znaczenia zmienności genetycznej w cząsteczkach adhezyjnych14.
Kilka etapów tej metody zasługuje na dokładne rozważenie, aby uzyskać wysoce ilościowe i powtarzalne wyniki. W preparacie HUVEC bardzo ważne jest osiągnięcie 100% zbieżności komórek przed użyciem ich w komorze przepływowej. W przypadku stosowania powierzchni pokrytych oczyszczonym ligandem, nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia obszaru powłoki podłoża, aby uniknąć denaturacji liganda. Ponadto przygotowanie ludzkich neutrofili ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Kluczowe kwestie związane z izolacją neutrofili od krwi obejmują delikatne obchodzenie się z nimi poprzez zminimalizowanie wirowania w celu uniknięcia aktywacji, utrzymywanie komórek w temperaturze pokojowej (tj. krew nie powinna być przechowywana na lodzie, a etapy wirowania powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej) oraz zakończenie izolacji i eksperymentu w jak najkrótszym czasie. Istnieją dodatkowe metody izolacji neutrofili, które można również wykorzystać do przygotowania komórek do tych testów17,18.
Z praktycznego punktu widzenia testy adhezyjne z użyciem świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili należy rozpocząć w ciągu 3-6 godzin po upuszczaniu flebotomii u uczestnika. Ponieważ neutrofile są niezwykle wrażliwe na obchodzenie się z nimi, wydłużony czas między pobraniem krwi a użyciem może mieć wpływ na wyniki testu. Dokładne określenie stężenia komórek obojętnochłonnych przed testem w komorze przepływowej jest również konieczne w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników.
Podczas testu w komorze przepływowej ważne jest, aby uważnie monitorować nagranie wideo, aby upewnić się, że prędkość przepływu jest stała i nie ma turbulencji na całej długości eksperymentu. Zmiany prędkości przepływu lub obecność turbulencji wymagałyby powtórzenia eksperymentu. Po eksperymencie ważne jest również, aby ocenić pod mikroskopem pozostałe neutrofile, aby upewnić się, że neutrofile nie zlepiają się. Zlepianie się w tym momencie wskazywałoby, że neutrofile uległy aktywacji, co może znacząco zmienić gęstość neutrofili podczas eksperymentu.
Komora przepływowa wytwarza prawie jednorodne naprężenie czyste w komorze (τ = 6Qμ / (wh2), gdzie Q = natężenie przepływu, μ = lepkość dynamiczna, a w = szerokość komory przepływu, h = wysokość komory przepływu15). W naszych badaniach zastosowaliśmy natężenie przepływu 350 μl/min dla adhezji neutrofili, co powoduje naprężenie czyste 1,5 dynes/cm2 (w=0,25 cm, h=0,01 cala, lepkość wody w temperaturze 37 °C (0,007 poise) zastosowano jako przybliżenie lepkości mediów RMPI). W przypadku określonej komory przepływowej można zmienić natężenie przepływu, aby osiągnąć różne poziomy czystego stresu, aby naśladować różne warunki fizjologiczne. Typowe fizjologiczne naprężenie ścinające w naczyniach krwionośnych człowieka może wynosić od 0,5 do 5,0 dyn/cm 13,16. Naprężenia ścinające w innych naczyniach krwionośnych i u innych zwierząt wymieniono w tabeli 1113,16,19 20.
Chociaż nasza metoda koncentrowała się na badaniu adhezji ludzkich neutrofili, metoda ta nie ogranicza się do neutrofili i może być łatwo zastosowana do badań adhezji lub walcowania innych typów komórek z prostymi modyfikacjami. Ponadto podłoża w tej metodzie można zmieniać do różnych celów.
Chociaż protokół ten można łatwo dostosować do różnych badań, istnieją pewne ograniczenia. Zaimplementowany tutaj protokół wymaga dużej liczby komórek pierwotnych do analizy. Może to wykluczyć analizę komórek pierwotnych od małych zwierząt. Dodatkowo, konieczność unieruchomienia oczyszczonych ligandów adhezyjnych w aktywnej/dostępnej konformacji może ograniczać zakres ligandów. Zastosowanie białek fuzyjnych Fc znacznie zwiększa szanse na osiągnięcie prawidłowej konformacji liganda na powierzchni płytki. Niemniej jednak nasza metoda ma znaczną elastyczność, która umożliwia ilościową analizę zdarzeń adhezji. Badania te znacznie poszerzą naszą wiedzę na temat par receptor-ligand adhezyjny oraz potencjalnego znaczenia wariantów genetycznych w tych białkach w patogenezie chorób człowieka.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest sponsorowana przez Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 oraz NIH UL1-TR00165. Dziękujemy dr Robertowi P. Kimberly'emu za jego nieustające wsparcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% Trypsyna / EDTA | Technologie życia | 25200-056 | z czerwienią fenolową |
| 2x inhibitor trypsyny | Technologie życia | R-002-100 | |
| 35 mm naczynie do hodowli tkankowych | Corning Inc. | 430165 | Standardowa powierzchnia poddana hodowli tkankowej |
| 75 cm2 kolba do hodowli tkankowych | Corning Inc. | 430641 | Standardowa kamera CCD z powierzchnią poddaną hodowli tkankowej |
| Dage-MTI | Model 300T-RC | ||
| Pojemnik do zamrażania komórek | Biocyzja | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC wzrost podłoża podstawowego |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | Czynniki wzrostu HUVEC dla podłoża podstawowego |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certyfikowana, inaktywowana termicznie |
| żelatyna | Sigma | G9391 | skóry bydlęcej |
| Fisher scientific | 02-671-51B | ||
| Fibronektyna | Sigma | F2006 | z ludzkiego osocza |
| Komora przepływowa | Glyco Tech | 31-001 | Okrągła komora przepływowa do szalek 35 mm |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Pożywka do separacji limfocytów | Mediatech Inc. | 25072CV | Lekki mikroskop Ficoll |
| Zeiss | Axiovert 100 | ||
| RPMI 1640 średni | Technologie życia | 11875 | z L-glutaminą i białkiem czerwieni fenolowej |
| A | Sigma | P6031 | ponownie zawiesiny w PBS |
| P-Selectin | R& D Systems | 137-PS | Fc chimera Pompa |
| strzykawkowa | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Technologie życiowe | PHC3015 | Rekombinowany |
| roztwór błękitu trypanowego białka ludzkiego, 0,4% | Technologie życia | 15250-061 |
Bibliografia
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745(2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
Przedruki i uprawnienia
