Zastosowanie chromatografii gazowej do analizy zmian składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby szczura w czasie ciąży

Podsumowanie

Ciąża prowadzi do znaczących zmian w składzie kwasów tłuszczowych w tkankach matki. Profile lipidowe można uzyskać za pomocą chromatografii gazowej, aby umożliwić identyfikację i ilościowe określenie kwasów tłuszczowych w poszczególnych klasach lipidów wśród szczurów karmionych różnymi dietami wysoko- i niskotłuszczowymi w czasie ciąży.

Streszczenie

Chromatografia gazowa (GC) jest bardzo czułą metodą używaną do identyfikacji i ilościowego oznaczania zawartości kwasów tłuszczowych w lipidach z tkanek, komórek i osocza/surowicy, dając wyniki z dużą dokładnością i wysoką powtarzalnością. W badaniach metabolicznych i żywieniowych GC umożliwia ocenę zmian stężeń kwasów tłuszczowych po interwencjach lub podczas zmian stanu fizjologicznego, takich jak ciąża. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) przy użyciu wkładów aminopropylowo-krzemionkowych umożliwia oddzielenie głównych klas lipidów, w tym triacylogliceroli, różnych fosfolipidów i estrów cholesterolu (CE). GC w połączeniu z SPE wykorzystano do analizy zmian w składzie kwasów tłuszczowych frakcji CE w wątrobach dziewiczych i ciężarnych szczurów, które były karmione różnymi dietami o wysokiej i niskiej zawartości tłuszczu. Istnieje znaczący wpływ interakcji między dietą a ciążą na zawartość kwasów tłuszczowych omega-3 i omega-6 w wątrobie CE, co wskazuje, że ciężarne samice mają inną reakcję na manipulację dietą niż obserwuje się to wśród dziewiczych samic.

Wprowadzenie

Chromatografia gazowa (GC) jest dobrze znaną techniką używaną do identyfikacji i ilościowego określania inkorporacji kwasów tłuszczowych do pul lipidowych i błon komórkowych^1,2 podczas suplementacji lub stanów fizjologicznych, takich jak otyłość (i choroby pokrewne, takie jak cukrzyca) lub ciąża^3-5. Nadaje się również do analizy rodzajów i ilości tłuszczów w żywności. Jest to przydatne przy charakteryzowaniu diet eksperymentalnych, a także przy zapewnianiu, że przemysł spożywczy przestrzega przepisów. Na przykład GC może być używany do potwierdzania tożsamości i ilości kwasów tłuszczowych w produkcie, takim jak suplement diety, w celu zapewnienia, że etykietowanie jest prawidłowe i przestrzegane są przepisy^6,7. Analiza kwasów tłuszczowych może dostarczyć cennych informacji na temat metabolizmu lipidów w zdrowiu i chorobie, wpływu zmiany diety oraz wpływu zmian w stanie fizjologicznym⁸. Zastosowanie GC do badania próbek w czasie ciąży dostarczyło ważnych informacji na temat zmian w homeostazie kwasów tłuszczowych i złożonych lipidów³.

Przed chromatograficzną separacją, lipidy są zazwyczaj ekstrahowane z próbki przy użyciu rozpuszczalności lipidów w mieszaninach rozpuszczalników chloroformu i metanolu. Chlorek sodu dodaje się w celu ułatwienia rozdzielenia mieszaniny na wodne i organiczne fazy zawierające lipidy^9,10. Złożone klasy lipidów, które są przedmiotem zainteresowania, można oddzielić od całkowitego ekstraktu lipidowego przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE). Ta technika separacji eluuje klasy lipidów na podstawie ich polarności lub powinowactwa wiązania. Triacyglicerole (TAG) i estry cholesterolu (CE) są najpierw eluowane jako frakcja złożona, kolejne klasy, fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetanoloamina (PE) i nieestryfikowane kwasy tłuszczowe (NEFA) są eluowane przez zwiększenie polarności rozpuszczalnika elującego. Oddzielenie TAG od CE wykorzystuje wiązanie TAG tylko ze świeżym wkładem SPE, co pozwala na elucję CE. TAG można następnie eluować poprzez zwiększenie polarności rozpuszczalnika eluującego^9,10. Metoda ta pozwala na jednoczesne rozdzielanie wielu próbek z większą wydajnością niż w przypadku chromatografii cienkowarstwowej, co oznacza, że można analizować próbki o stosunkowo małych rozmiarach (np. <100 μl osocza lub surowicy, <100 mg tkanki)^11,12.

GC to sprawdzona technika, opisana po raz pierwszy w latach 50.; zasugerowano, że faza ruchoma w ówczesnych układach ciecz-ciecz może zostać zastąpiona parą. Początkowo był używany do analizy ropy naftowej, ale szybko rozszerzył się na inne obszary, takie jak analiza aminokwasów i biochemia lipidów, która nadal cieszy się dużym zainteresowaniem. Postęp w sprzęcie i technologii GC, taki jak opracowanie kolumn kapilarnych z wcześniej stosowanych kolumn z wypełnieniem, doprowadził do naszych obecnych technik, w których kwasy tłuszczowe są w stanie być bardziej efektywnie oddzielane w niższych temperaturach, co powoduje, że GC jest rutynowo stosowana do identyfikacji i ilościowego oznaczania kwasów tłuszczowych w szerokim zakresie badań¹³.

GC wymaga derywatyzacji kwasów tłuszczowych, aby mogły stać się wystarczająco lotne, aby mogły być eluowane w rozsądnych temperaturach bez termicznego rozkładu. Zwykle wiąże się to z podstawieniem grupy funkcyjnej zawierającej wodór w celu utworzenia estrów, tioestrów lub amidów do analizy. Estry metylowe są powszechnie badanymi pochodnymi, które są wytwarzane w procesie metylacji. W tej metodzie wiązania estrowe w złożonych lipidach są hydrolizowane w celu uwolnienia wolnych kwasów tłuszczowych, które są transmetylowane w celu wytworzenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME). Otrzymany profil FAME, określony za pomocą GC, jest określany jako skład kwasów tłuszczowych i może być łatwo porównany między różnymi grupami doświadczalnymi^9,10. Technika ta pozwala na pomiar zarówno proporcji poszczególnych kwasów tłuszczowych, jak i ich stężeń.

Oprócz wykorzystania GC do analizy kwasów tłuszczowych w badaniach żywieniowych i w przemyśle spożywczym, technika ta może być stosowana w szerokim zakresie dziedzin analitycznych. Na przykład analizy środowiskowe z wykorzystaniem GC obejmują pomiar zanieczyszczenia wody środkami owadobójczymi, a analizy gleby mierzą zawartość chlorobenzenu. W toksykologii GC był również używany do identyfikacji nielegalnych substancji w próbkach moczu i krwi osób; Taki wzmacniacz osiągów sportowych¹² i zdolność do rozdzielania złożonych mieszanin węglowodorów sprawia, że technika ta jest popularna w przemyśle naftowym do analizy petrochemicznej¹².

Ciąża wiąże się ze znaczącymi zmianami w składzie kwasów tłuszczowych w tkankach matki, szczególnie w zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych omega-3 (n-3) i omega-6 (n-6) (PUFA)³. W obecnym badaniu pokazujemy zastosowanie GC w pomiarze kwasów tłuszczowych, opisując jego zastosowanie w analizie składu kwasów tłuszczowych w tkance wątroby pobranej od dziewiczych i ciężarnych szczurów karmionych dietami nisko- i wysokotłuszczowymi o różnych źródeł ropy naftowej. Przedstawione tutaj diety eksperymentalne to dieta niskotłuszczowa oparta na oleju sojowym, dieta oparta na wysokotłuszczowym oleju sojowym (130,9 g tłuszczu całkowitego/kg tłuszczu całkowitego) lub dieta oparta na wysokotłuszczowym oleju lnianym (dieta 130,9 g tłuszczu całkowitego/kg), podawana przez 20 dni. Pełny skład składników odżywczych i kwasów tłuszczowych tych diet został opisany wcześniej¹⁴. Dieta oparta na oleju sojowym jest bogata w kwas linolowy (18:2n-6) i zawiera pewną ilość kwasu α-linolenowego (18:3n-3), podczas gdy dieta oparta na oleju lnianym jest bogata w kwas α-linolenowy. Te diety wysokotłuszczowe reprezentują różne proporcje kwasu linolowego do α-linolenowego (odpowiednio proporcje 8:1 i 1:1). Metoda izolacji poszczególnych klas lipidów i analizy za pomocą GC jest dobrze ugruntowana i zwalidowana i została opublikowana wcześniej¹⁰, ale bez szczegółowego opisu technicznego, który znajduje się w niniejszym dokumencie.

Protokół

1. Procedury na zwierzętach

1. Wszystkie prace ze zwierzętami powinny być wykonywane zgodnie z ustawą Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986).
2. Mate Wistar szczury w wieku 10 tygodni przez hodowlę monogamiczną i potwierdzają ciążę przez pojawienie się czopa dopochwowego. Zapisz to jako 1 dzień ciąży i rozpocznij eksperymentalną dietę. W przypadku dziewiczych samic trzymaj każdego szczura indywidualnie i rozpocznij eksperymentalną dietę.
3. Po karmieniu eksperymentalnymi dietami przez 20 dni poddaj szczury eutanazji przez uduszenie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
4. Użyj kleszczy preparacyjnych i nożyczek, aby odsłonić jamę brzuszną i wyciąć wątrobę poprzez przecięcie więzadeł, które łączą wątrobę z przeponą, przednią ścianą brzucha, żołądkiem i dwunastnicą. Umyć wątrobę w PBS i zamrozić w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie całkowitego ekstraktu lipidowego⁹

1. Dodaj sita molekularne (aby napełnić 1/10 pojemnika z rozpuszczalnikiem) do wszystkich rozpuszczalników, aby uzyskać "suche" rozpuszczalniki. Wszystkie prace związane z rozpuszczalnikiem należy wykonywać w dygestorium.
2. Pokrój około 100 mg mrożonej wątroby i zważ. Umieść chusteczkę w probówce w wiaderku z lodem i dodaj 0,8 ml lodowatego 0,9% NaCl. Homogenizuj tkankę.
3. Dodać wzorce wewnętrzne rozpuszczone w 1 ml/mg suchego chloroformu: metanol (2:1, v/v) zawierający butylowany hydroksytoluen (BHT; 50 mg/l) jako przeciwutleniacz. Na 100 mg wątroby szczura dodać 100 μg wzorca CE (heptadekanian cholesrylu 17:0). Uwaga: Chloroform i BHT są niebezpieczne.
4. Dodać 5,0 ml suchego chloroformu: metanolu (2:1, v/v) zawierającego BHT (50 mg/l).
5. Dodać 1,0 ml 1 M NaCl, dokładnie wymieszać przez wirowanie, aż mieszanina będzie jednolita. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
6. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut, przy niskim hamowaniu w temperaturze pokojowej.
7. Pobrać dolną fazę za pomocą szklanej pipety Pasteura, przenieść do nowej szklanej probówki z nakrętką i wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.

3. Rozdzielanie klas lipidów przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)¹⁰

1. Podłącz zbiornik SPE do pompy próżniowej i umieść wkład SPE z krzemionką aminopropylową na zbiorniku.
2. Umieść nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną TAG i CE w stojaku na zbiornik pod kolumną, aby zebrać pierwszą frakcję.
3. Całkowity ekstrakt lipidowy rozpuścić w 1,0 ml suchego chloroformu i zawirować.
4. Nanieść próbkę do kolumny za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przesączenia się do rurki z nakrętką pod wpływem grawitacji. Gdy nie spadną już żadne krople, usuń pozostałą ciecz za pomocą próżni.
5. Eluować frakcję TAG i CE w próżni, przemyć kolumnę 2 x 1,0 ml popłuczyny suchego chloroformu.
6. Po usunięciu całej cieczy wysuszyć frakcję TAG i CE pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
7. Umieść nową szklaną rurkę z zakrętką oznaczoną jako PC w tacy zbiornika pod kolumną.
8. Eluować frakcję PC w próżni z dodatkiem 2 x 1,0 ml suchego chloroformu: metanolu (60:40, v/v) aż do usunięcia całej cieczy z kolumny.
9. Usunąć i wysuszyć frakcję PC w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
10. Umieścić nową szklaną rurkę z nakrętką z oznaczeniem PE w tacy zbiornika i wymyć frakcję PE z dodatkiem 1,0 ml suchego metanolu w próżni.
11. Usunąć i wysuszyć frakcję PE w azocie w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
12. Umieścić nową szklaną rurkę z zakrętką oznaczoną NEFA w tacy zbiornika i wymyć frakcję NEFA w próżni przez dodanie 2 x 1,0 ml płukania suchego chloroformu: metanol: lodowaty kwas octowy (100:2:2, v/v/v). Uwaga: Lodowaty kwas octowy jest niebezpieczny.
13. Pobraną frakcję NEFA usunąć i wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
14. Umieść nowy wkład SPE z krzemionką aminopropylową na zbiorniku SPE i umieść szklaną rurkę z zakrętką w tacy zbiornika pod wkładem, aby zebrać odpady.
15. Umyj kolumnę 3 płuczkami suchego heksanu w próżni, a następnie ostatnim 1,0 ml płukaniem grawitacyjnym. Nie dopuścić do wyschnięcia wkładu (przekręć kanały kolumny wkładu do pozycji zamkniętej, gdy poziom heksanu jest zbliżony do matrycy wkładu). Uwaga: Heksan jest niebezpieczny.
16. Wymień rurkę odpływową na nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną CE.
17. Rozpuścić wysuszoną frakcję TAG i CE (przygotowane w kroku 3.6) w 1,0 ml suchego heksanu i odwirować. Nanieść to na kolumnę za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przesączenia pod wpływem grawitacji.
18. Gdy nie spadnie już żadne krople, usuń pozostałą ciecz pod próżnią.
19. W próżni przemyć kolumnę 2 x 1,0 ml płukania suchego heksanu w celu wymycia CE i suchej zebranej frakcji pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.
20. Umieścić nową szklaną rurkę z nakrętką oznaczoną TAG w tacy zbiornika i wymyć TAG z dodatkiem 2 x 1,0 ml płukania suchego heksanu: metanolu: octanu etylu (100:5:5) w próżni.
21. Pobraną frakcję na sucho pod azotem w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia. Uwaga: Octan etylu jest niebezpieczny.

4. Przygotowanie FAME z CE¹⁰

1. Dodać 0,5 ml suchego toluenu do oddzielonej frakcji CE (zebranej w kroku 3.19) i odwirować. Uwaga: Toluen jest niebezpieczny.
2. Przygotować odczynnik metylacyjny (suchy metanol o zawartości 2% (v/v)_H2SO4), którego ilość wymagana jest 1,0 ml na próbkę. Dozować objętość suchego metanolu do szklanego lub odpowiedniego plastikowego pojemnika z pokrywką i dodawać kroplami wymaganą ilość _H2SO4, a następnie mieszać przez inwersję. Uwaga: Kwas siarkowy jest niebezpieczny.
3. Dodać 1,0 ml odczynnika metylującego do próbek rozpuszczonych w suchym toluenie, szczelnie zakryć probówki i delikatnie wymieszać.
4. Podgrzewać próbki przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.
5. Po 2 godzinach zdejmij probówki z ognia. Po ostygnięciu dodać 1,0 ml roztworu neutralizującego (0,25 M KHCO₃ 0,5 M_{K 2}CO₃ ). Uwaga: Wodorowęglan potasu i węglan potasu są niebezpieczne.
6. Dodaj 1,0 ml suchego heksanu i odwiruj.
7. Wirować przy 250 x g przez 2 min, hamowanie przy niskim poziomie w temperaturze pokojowej.
8. Zbierz górną fazę, która zawiera FAME, i przenieś do nowej jednorazowej szklanej rurki bez zakrętki.
9. Pobrany FAME należy wysuszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.

5. Usuwanie zanieczyszczenia wolnym cholesterolem z CE FAME¹⁴

(Wolny cholesterol może zanieczyścić próbkę; zobacz na rysunku 1 na przykład ślady chromatografu z usuwaniem wolnego cholesterolu i bez niego).

1. Umieść rurkę odpływową w zbiorniku SPE i umieść wkład SPE z żelem krzemionkowym na zbiorniku.
2. Przepłukać kolumnę 3 x 1 ml przepłuczyny suchego heksanu w próżni i 1 x 1 ml pod wpływem grawitacji.
3. Usuń mycie odpadów i wlej nową rurkę odpływową do zbiornika.
4. Rozpuść CE FAME w 1 ml suchego heksanu, wiruj.
5. Nanieść na kolumnę za pomocą szklanej pipety Pasteura i pozostawić do przepuszczenia pod wpływem grawitacji.
6. Przepłukać kolumnę 3 x 1 ml popłuczyny heksanu w próżni.
7. Usuń myte odpady i umieść nową rurkę bez zakrętki w zbiorniku oznaczonym CE FAME.
8. Eluować CE FAME za pomocą 2 x 1 ml suchego heksanu: eter dietylowy (95:5 v/v) przemywa.
9. Suszyć w atmosferze azotu w temperaturze 40 °C. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia. Uwaga: Eter dietylowy jest niebezpieczny.

6. Przeniesienie FAME do fiolki GC Auto Sampler

1. Dodać 75 μl suchego heksanu do próbki, odwirować i przenieść do fiolki z automatyczną próbką GC.
2. Dodać kolejne 75 μl suchego heksanu do próbki, odwirować i przenieść do tej samej fiolki z automatyczną próbką GC. Na tym etapie próbki można zakryć i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.

7. Analiza za pomocą chromatografu gazowego¹⁴

1. Analizuj FAME na chromatografie gazowym. Przykładowa konfiguracja: 30 m x 0,25 μm x 0,25 mm BPX-70 kolumna kapilarna z topionej krzemionki z protokołem temperatury:
   Temperatura początkowa 115 °C, przytrzymaj 2 min, rampa 10 °C/min do 200 °C, przytrzymaj 18,5 min, rampa 60 °C/min do 245 °C, przytrzymaj 4 min.
   Kolumna: hel gazowy, natężenie przepływu 1,0, ciśnienie 14,6 i prędkość 29,
   Wtryskiwacz: Temperatura = 300 °C.
   Detektor: przepływ wodoru 40,0, przepływ powietrza 184,0, gaz uzupełniający Hel, przepływ 45,0, temperatura = 300 °C.
2. Ustaw odpowiedni współczynnik podziału (np. 25:1 dla analizy CE FAME).
3. Określ obszar pod każdym pikiem za pomocą odpowiedniego oprogramowania i zidentyfikuj FAME w porównaniu ze standardami. Patrz rysunek 2 dla przykładu chromatogramów.
4. Użyj obszaru pod danymi piku, aby obliczyć udział poszczególnych kwasów tłuszczowych jako procent całkowitych kwasów tłuszczowych.
5. Obliczyć bezwzględne stężenia kwasów tłuszczowych, dzieląc powierzchnię wzorca wewnętrznego przez dodaną ilość. Podziel powierzchnię każdego kwasu tłuszczowego przez ten wynik, aby uzyskać bezwzględne stężenia każdego kwasu tłuszczowego w ilości użytej tkanki.

Wyniki

Sukces tej metody zależy od dokładnego przestrzegania protokołu i użycia czystych rozpuszczalników i odczynników w celu zredukowania 'szumu' i zanieczyszczeń, które mogą pojawić się na chromatogramie. Zanieczyszczone próbki są trudniejsze do analizy, co obniża dokładność obliczeń obszaru pod krzywą. Jeżeli protokół jest przestrzegany prawidłowo, należy otrzymać chromatogram z wyraźnie symetrycznymi, dobrze zdefiniowanymi pikami i minimalnym szumem tła, jak pokazano na rysunku 3. Jeśli doszło do zanieczys...

Dyskusja

Chromatografia gazowa jest dokładną techniką do analizy kwasów tłuszczowych, a jej wysoka odtwarzalność sprawia, że technika ta jest odpowiednia do analiz klinicznych. Należy użyć odpowiednich kolumn GC w celu umożliwienia identyfikacji kwasów tłuszczowych będących przedmiotem zainteresowania, przy czym dostępne kolumny mają różnice w polarności fazy stacjonarnej, długości kolumny i średnicy wewnętrznej. Zastosowanie w tej metodzie analizy kolumny kapilarnej ze stopionej krzemionki zapewnia dobrą stabilność termiczną i w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metanol	Fisher Scientific	M/4056/17'CAUTION	' Opary - Chloroform klasy HPLC
	Fisher Scientific	C/4966/17'UWAGA	' Opary - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	CAUTION' Pyły - Bezwodny
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Bezwodny
heksan	Fisher Scientific	H/0406/17'CAUTION	' Opary - HPLC Grade
Lodowcowy kwas octowy	Sigma- Aldrich	695084	UWAGA' Oparzenia - 99.85%
Kwas siarkowy	Sigma- Aldrich	339741	CAUTION' Burns - 99.999%
Węglan potasu	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Odczynnik klasy
Wodorowęglan potasu	Sigma- Aldrich	237205	99,7% octan
etylu	Fisher Scientific	10204340	CAUTION" Opary - 99+% GLC SpeciFied
Toluen	Fisher Scientific	T/2300/15'CAUTION	' Opary
Eter dietylowy	Sigma- Aldrich	309966	CAUTION' Opary
Azot (beztlenowy) butla	BOC	44-w	'UWAGA' Gaz sprężony - ryzyko wybuchu
Wkłady SPE z krzemionki aminopropylowej	Agilent	12102014	Wkład - Masa kulki 100 mg
Żel krzemionkowy Kartridże SPE	Agilent	14102010	Cartridge - Masa kulek 100 mg
Sejwy molekularne	Sigma- Aldrich	334324	Granulki, AW-300, 1,6 mm
Szklane pipety Pasteura	Fisher Scientific	FB50251