Heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy

Podsumowanie

Mysi model ludzkiej endoskopowej rekonstrukcji podstawy czaszki został opracowany, który tworzy półprzepuszczalny interfejs między mózgiem a nosem za pomocą przeszczepów błony śluzowej nosa. Metoda ta pozwala naukowcom badać dostarczanie do ośrodkowego układu nerwowego leków o dużej masie cząsteczkowej, które w przeciwnym razie są wykluczane przez barierę krew-mózg, gdy są podawane ogólnoustrojowo.

Streszczenie

Dostarczanie środków terapeutycznych do mózgu jest utrudnione przez obecność bariery krew-mózg (BBB), która ogranicza przepływ związków polarnych i o wysokiej masie cząsteczkowej z krwiobiegu do tkanki mózgowej. Pewien sukces w bezpośrednim dostarczaniu u ludzi osiągnięto dzięki implantacji cewników przezczaszkowych; Metoda ta jest jednak wysoce inwazyjna i wiąże się z licznymi powikłaniami. Mniej inwazyjną alternatywą byłoby dawkowanie mózgu przez chirurgicznie wszczepioną, półprzepuszczalną błonę, taką jak błona śluzowa nosa, która jest używana do naprawy ubytków podstawy czaszki po endoskopowej operacji przeznosowego usunięcia guza u ludzi. Przenoszenie leku przez tę błonę skutecznie ominęłoby barierę krew-mózg i dyfundowałoby się bezpośrednio do mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego. Zainspirowani tym podejściem, opracowano podejście chirurgiczne u myszy, które wykorzystuje błonę śluzową przegrody dawcy wszczepioną na pozaczaszkowy chirurgiczny ubytek BBB. Wykazano, że model ten skutecznie umożliwia przenikanie związków o dużej masie cząsteczkowej do mózgu. Ze względu na to, że wiele potencjalnych leków nie jest w stanie przekroczyć bariery krew-mózg, model ten jest cenny dla przeprowadzania badań przedklinicznych nowych terapii chorób neurologicznych i psychiatrycznych.

Wprowadzenie

Leczenie chorób neurologicznych i psychiatrycznych jest poważnie utrudnione przez obecność bariery krew-mózg (BBB), która uniemożliwia ponad 95% wszystkich potencjalnych środków farmaceutycznych dotarcie do ośrodkowego układu nerwowego^1-3. Na przykład wykazano, że czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF) jest skuteczny w leczeniu choroby Parkinsona, gdy jest wstrzykiwany bezpośrednio do mózgu, jednak jest nieskuteczny, gdy jest dostarczany ogólnoustrojowo, ponieważ nie może przeniknąć do bariery^{krew-mózg 4-6}.

Powstało wiele prób obejścia tego problemu. Wykazano poprawę w ogólnoustrojowym podawaniu neuroterapeutyków poprzez zastosowanie koniugatów leków zawierających przeciwciała selektywne dla białek transportowych zlokalizowanych na śródbłonku naczyń włosowatych mózgu; Nie wykazano jednak, aby metoda ta miała zastosowanie do szerokiego zakresu produktów farmaceutycznych^7,8. Dodatkowo, osmotyczne otwarcie BBB było stosowane klinicznie, jednak metoda ta cierpi z powodu ogólnoustrojowego dawkowania leków, w przeciwieństwie do bardziej bezpośredniego dostarczania do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania⁹. Duży wysiłek włożono w optymalizację dostarczania przeznosowego w nadziei na bezpośrednie ukierunkowanie na mózg^10-12. Chociaż osiągnięto pewne sukcesy, ostateczne wyniki uzyskano tylko w przypadku leków, które posiadają endogenne receptory, takich jak insulina^13,14. Co więcej, mechanizm dostarczania przez nos jest kontrowersyjny, a dowody sugerują pośrednie przenikanie do mózgu poprzez wychwyt neuronów węchowych lub^{przez krwioobieg}. Udało się uzyskać bezpośredni, przezczaszkowy poród za pomocą wszczepialnych cewników, jednak zabieg ten jest wysoce inwazyjny i wiąże się z licznymi powikłaniami^15,16. Do tej pory nie ma ogólnej, minimalnie inwazyjnej metody dostarczania związków o dużej masie cząsteczkowej do mózgu.

Prezentowany tutaj jest mysi zabieg chirurgiczny, który tworzy półprzepuszczalny interfejs z mózgiem. Osiąga się to poprzez wszczepienie eksplantatu błony śluzowej¹⁷ na chirurgiczny ubytek kraniotomii u myszy. Za pomocą tej procedury wykazano, że związki rozpuszczalne o masie do 500 kDa mogą być dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego (bezpośrednio do miąższu mózgu, a także do płynu mózgowo-rdzeniowego) zarówno w sposób zależny od czasu, jak i masy cząsteczkowej¹⁸. Ta metoda omijania bariery krew-mózg jest modelem naprawy ubytków podstawy czaszki u ludzi, który wykorzystuje unaczynione przeszczepy błony śluzowej do naprawy otworów w czaszce po przeznosowej operacji endoskopowej^19,20.

Protokół

Przed operacją upewnij się, że wszystkie procedury do wykonania są zatwierdzone przez IACUC i wszelkie dodatkowe etyczne lub prawne autorytety i stosuj humanitarne praktyki leczenia zwierząt. Obejmuje to stosowanie sterylnych warunków chirurgicznych, znieczulenie myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC, smarowanie oczu myszy maścią weterynaryjną podczas operacji oraz zapewnienie opieki pooperacyjnej. Nie przystępuj do operacji, jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości, czy aspekty procedury są zatwierdzone. Wszystkie procedury wykonane w tym dokumencie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Bostońskiego.

1. Przygotowanie zwierząt i materiały chirurgiczne

1. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, które będą używane podczas operacji.
2. Upewnij się, że wszystkie techniki, które mają być wykonane, są zatwierdzone przez agencje regulacyjne ds. zwierząt.

2. Pobieranie przeszczepu błony śluzowej

1. Wybierz genetycznie identyczną mysz w podobnym wieku co mysz eksperymentalna i poddaj ją eutanazji metodą zatwierdzoną przez IACUC (tutaj: uduszenie izofluranem, a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę wokół nosa głowy myszy, odsłaniając czaszkę.
3. Za pomocą wiertarki pneumatycznej zaznacz trzema liniami, z których dwie bocznie flankują obszar nosa, a trzecia w linii z oczami, która łączy dwie linie prostopadle.
4. Wiercić brzusznie, aby oddzielić przegrodę nosową od otaczającej tkanki. Szersza ścieżka zapobiegnie uszkodzeniu błony śluzowej, ale utrudni również odizolowanie błony. Zalecane jest wąskie cięcie bliżej linii środkowej.
5. Za pomocą nożyczek odetnij przegrodę z przylegającej do niej tkanki i przechowuj ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. W tym czasie przeszczep można oczyścić, aby usunąć wszelką połączoną tkankę. Idealną sytuacją jest odsłonięcie nieuszkodzonych błon śluzowych po obu stronach przegrody chrzęstnej. Jeden przeszczep może dostarczyć błonę dwóm myszom, pod warunkiem, że powierzchnia błony jest wystarczająca do pokrycia miejsc kraniotomii. Zaleca się, aby przeszczep został użyty tak szybko, jak to możliwe, a badacz przechodzi do kroku 3, gdy tylko przeszczep zostanie odizolowany.

3. Chirurgiczne wszczepienie przeszczepu błony śluzowej

1. Korzystając ze standardowych, aseptycznych zabiegów chirurgicznych na myszach, znieczulij i zamontuj mysz w ramce stereologicznej. Użyj około 2% izofluranu w czystym tlenie za pomocą urządzenia do znieczulania gryzoni.
2. Unieruchom mysz w aparacie stereotaktycznym z nausznikami i uchwytem na nos. Nałóż maść okulistyczną na oczy i szoruj skórę głowy betadyną i 75% etanolem przez trzy rundy. Za pomocą nożyczek lub trymera do włosów usuń sierść na głowie. Odsłoń czaszkę żyletką i wypoziomuj głowę. Wykonaj kraniotomię powyżej miejsca mózgu, które zostanie podane. Na przykład, celując w prążkowie, wytnij okrągły otwór o średnicy 1,25 mm w czaszce (wyśrodkowany na AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) za pomocą wiertarki pneumatycznej. Zwilż wiercony obszar sterylną solą fizjologiczną i użyj żyletki, aby usunąć czaszkę.
3. Ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą końcówki igły. Dodatkowo można to osiągnąć poprzez nałożenie minimalnej ilości kleju tkankowego na wilgotną powierzchnię opony twardej. Gdy ta warstwa stwardnieje, można użyć ruchu bocznego za pomocą końcówki żyletki, aby usunąć membranę.
4. Umieść błonę śluzówkową nad powierzchnią mózgu, zwracając szczególną uwagę, aby strona nabłonka była skierowana z dala od rany. Najlepiej zrobić to, przenosząc całą przegrodę na powierzchnię czaszki przylegającą do miejsca kraniotomii za pomocą pęsety. Za pomocą końcówki nożyczek chirurgicznych ściągnij błonę z chrząstki na powierzchnię czaszki i mózgu. Nie pozwól, aby membrana wyschła ani nie dotykaj jej żadnym materiałem chłonnym. Przeszczep powinien obficie zachodzić na wszystkie kostne krawędzie miejsca kraniotomii.
5. Przykryj przeszczep sterylnym kawałkiem nitrylu. Zapobiega to przyleganiu skóry do przeszczepu podczas gojenia. Nitryl musi być wystarczająco duży, aby pokryć całą błonę śluzówkową. W razie potrzeby przyciąć nadmiar membrany. Unikaj jakiegokolwiek ruchu nitrylu po jego kontakcie z przeszczepem.
6. Zamknij skórę sterylnym szwem 5-0 i pozwól myszy dojść do siebie przez 3-7 dni przed przejściem do następnego kroku. Należy uważać, aby nie zaburzyć bariery nitrylowej ani przeszczepu błony śluzowej podczas zamykania skóry.

4. Podawanie roztworu dozującego

1. Po zabezpieczeniu znieczulonej myszy w ramie stereotaktycznej należy przeciąć szew nożyczkami i usunąć nadmiar skóry wokół czaszki.
2. Usuń barierę nitrylową i oczyść powierzchnię czaszki. Użyj sterylnych wacików z solą fizjologiczną i bawełnianymi wacikami, aby oczyścić obszar, aż przeszczep będzie widoczny. Może być konieczne przecięcie przeszczepu brzytwą, jeśli urósł większy niż pożądana powierzchnia.
3. Jeśli eksperyment będzie trwał dłużej niż kilka dni, rozsądnie jest wszczepić co najmniej dwie czaszki, aby wzmocnić implant głowy.
4. Umieść studzienkę nad przeszczepem tak, aby krawędzie stykały się z czaszką. Nałóż klej cyjanoakrylowy na styku studni i czaszki. Napełnij studzienkę sterylną solą fizjologiczną i sprawdź, czy nie ma wycieków. Studzienki wykonane są z ciętych igieł strzykawkowych.
5. Nałóż cement kostny na czaszkę, aby zabezpieczyć studnię na miejscu.
6. Usuń sól fizjologiczną ze studzienki za pomocą pipety. Umyj studzienkę kilka razy, aby sprawdzić, czy klej nie wyciekł do środka. Dodaj żądane rozwiązanie; W tym przypadku stosuje się 50 μl dekstranu fluorescencyjnego. Oczekuje się, że rozpuszczalne w wodzie związki o podobnej polarności będą zachowywać się tak samo jak dekstran. Dostarczanie związków hydrofobowych lub zawiesin nie zostało zbadane tą metodą.
7. Zakryj górną część studzienki za pomocą okrągłego kawałka nitrylu przymocowanego do góry za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Upewnij się, że klej nie styka się z zawartością studzienki.

5. Analiza dostarczania przezśluzówkowego

1. Po upływie pożądanego czasu znieczulij mysz i zamień zawartość studzienki na roztwór niebieskiego barwnika Evana. Ten barwnik służy do sprawdzenia, czy przeszczep był nienaruszony.
2. Po 30 minutach mocno znieczulij mysz, usuń roztwór barwnika i poddaj eutanazji poprzez dekapitację.
3. Ręcznie usuń implant i usuń mózg za pomocą nożyczek chirurgicznych. Uważaj, aby utrzymać przeszczep na miejscu.
4. Po usunięciu mózgu należy błyskawicznie zamrozić w roztworze izobutanu schłodzonym w suchej kąpieli lodowej.
5. Zanurz mózg w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój na plasterki o wielkości 50 μm.
6. Umieść żądane plasterki bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym.
7. Zobrazuj plasterek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, gdy tylko roztwór OCT wyschnie.

Wyniki

Uzyskanie wystarczająco dużego eksplantu przegrody nosowej jest kluczowe dla kolejnych etapów. Można to osiągnąć poprzez wiercenie w miejscu na czaszce myszy dawcy wskazanym na Rysunku 1a. Cięcie wzdłuż tej ścieżki pozwoli uzyskać eksplant o odpowiedniej wielkości, jak pokazano na Rysunku 1b. Jeśli głębokość wiercenia będzie niewystarczająca, przeszczep zostanie ucięty, co utrudni pozyskanie błony o rozmiarze wystarczającym do pokrycia powierzchni mózgu. Odradza się wiercenie bardziej bo...

Dyskusja

Najtrudniejszym etapem opisanej w niniejszym dokumencie procedury jest pomyślne przeniesienie odpowiednio dobranej błony śluzowej na powierzchnię mózgu. Ten krok jest znacznie łatwiejszy, jeśli pobrana przegroda nosowa jest wystarczająco duża i dobrze oczyszczona. Jeśli brzuszna część przegrody jest ścięta, należy uzyskać nowy przeszczep. Kąt wiercenia powinien być prostopadły do głowy myszy, aby zapewnić, że błona śluzówkowa nie zostanie uszkodzona przez wiertło. Jeśli zostanie wybrana szersza niż zalecana ścieżka wierc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Drobne nożyczki studenckie	Fine Science Tools	91461-11
Wiertarka pneumatyczna	MTI Dental	333-CB
Wiertło
Kleszcze	Fine Science Tools	91106-12
0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań USP	Abbott Laboratories	4925
Polistyrenowa szalka Petriego	Fisher	08-757-12	do tymczasowego przechowywania przeszczepu
Sterylizator koralików	Fine Science Tools	18000-45
System tlenu/izofluranu	SurgiVet	V720100
	Physitemp	TCAT-2LV
Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt	KOPF	Model 940
Maść do
Golarka
Aplikatory z bawełnianą końcówką	Fisher	23-400-106
7,5% Providone			Betadine peeling chirurgiczny
70% etanol
Ostrze chirurgiczne nierdzewny	Feather	2976#10
Rękojeść skalpela - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% nadtlenek			do czyszczenia czaszki
Klej tkankowy Vetbond	3M	1469SB
Igły	Becton, Dickinson and Company	305176	końcówka igły odcięta i używana również
Strzykawki	Becton, Dickinson and Company	309597
Rękawice nitrylowe	Denville Scientific Inc	G4162	do zamykania studni i ochrony przeszczepu
5-0 Nylonowa nić
Uchwyt na igłę Student Halsey	Fine Science Tools	91201-13
Klej			specjalnie super klej
Zestaw cementu dentystycznego, 1 lb, różowy nieprzezroczysty	Stoelting	51458
Izobutan (2-metylobutan)	Aldrich	M32631	do kąpieli w suchym lodzie
Suchy lód

System kontroli temperatury oczuelektryczna jod Hydogen do szwów cyjanoakrylowy dostępny