Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Podsumowanie

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody¹. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy protokół używany do przygotowania próbek krio-TEM zarodników Aspergillus niger, który jednak można łatwo dostosować do dowolnej liczby mikroorganizmów lub roztworów. Korzystamy z specjalnie zbudowanej stacji kriotransferowej oraz zmodyfikowanej komory przygotowania krio-SEM². Zarodniki są pobierane z hodowli, zamrażane zanurzeniowo w ciekłym błocie pośniegowym azotu i obserwowane w krio-SEM w celu wybrania interesującego regionu. Cienka blaszka jest następnie ekstrahowana za pomocą FIB, dołączana do siatki TEM, a następnie rozcieńczana do przezroczystości elektronów. Siatka jest przenoszona do uchwytu krio-TEM i do TEM w celu przeprowadzenia badań w wysokiej rozdzielczości. Dzięki wprowadzeniu chłodzonej końcówki nanomanipulatora i stacji kriotransferowej, protokół ten jest prostą adaptacją do temperatury kriogenicznej rutynowo stosowanego przygotowania próbek TEM metodą FIB. W związku z tym ma tę zaletę, że wymaga niewielkiej ilości modyfikacji istniejących instrumentów, konfiguracji i procedur; jest łatwy do wdrożenia; ma szeroki zakres zastosowań, w zasadzie taki sam jak w przypadku przygotowywania próbek cryo-TEM. Jednym z ograniczeń jest to, że wymaga umiejętnego obchodzenia się z próbkami na krytycznych etapach, aby uniknąć lub zminimalizować zanieczyszczenia.

Wprowadzenie

W tym protokole cryo-FIB/SEM jest używany do produkcji próbek TEM z określonego regionu próbki, wcześniej zidentyfikowanego z dużą precyzją przez analizę SEM. Mikroskopia elektronowa (skaningowa lub transmisyjna) analiza próbek biologicznych jest rutynową techniką stosowaną w badaniach i diagnostyce. SEM jest dość szybki i łatwy w zastosowaniu i interpretacji, ale informacje uzyskuje się tylko z powierzchni próbki i z rozdzielczością w zakresie 1,5 nm. TEM ma wyższą rozdzielczość, ale jest trudniejszy do wdrożenia, analiza obrazu jest mniej prosta, a podczas uzyskiwania informacji masowych próbki muszą być rozrzedzane do przezroczystości elektronów (o grubości mniejszej niż około 500 nm). Dodatkowym problemem jest to, że wymagania dotyczące próżni w tych instrumentach są rzadko tolerowane przez próbki zawierające wodę. W większości przypadków próbki biologiczne muszą być albo utrwalone chemicznie (zastępując wodę np. polimerami), albo wysuszone. W obu przypadkach prawdopodobne jest wystąpienie znaczących zmian w morfologii i strukturze okazu. Przygotowanie uwodnionych próbek metodą Cryo TEM wywołuje minimalne zmiany chemiczne i pozwala uzyskać próbki jak najbardziej zbliżone do ich stanu pierwotnego, zwłaszcza jeśli uzyskuje się witryfikację lodu^1-6.

FIB jest powszechnie używany do przygotowywania próbek TEM ze względu na jego liczne zalety⁷. Aby wymienić tylko kilka: zastosowanie jonów o wysokiej energii przy niemal normalnej częstości występowania minimalizuje wpływ różnic w mieleniu związanych z materiałem; Obszar wyekstrahowany z próbki zbiorczej można wybrać z dokładnością submikronową; Wydobywana jest bardzo mała ilość materiału. Najnowsze osiągnięcia techniczne umożliwiły zastosowanie FIB również do przygotowania próbek TEM w temperaturach kriogenicznych^2,8-10. Istnieje kilka zalet w porównaniu z tradycyjną metodą przygotowania kriomikrotomii^11,12 stosowaną głównie do próbek miękkiej masy, takimi jak brak mechanicznego odkształcenia blaszki warstwowej, brak śladów noża oraz możliwość przygotowania próbek kompozytowych z twardymi / miękkimi powierzchniami lub komponentami.

Protokół

UWAGA: wszystkie parametry podane w tym protokole są ważne dla wskazanych tutaj instrumentów i modeli. Niektóre z tych parametrów (oznaczone w tekście gwiazdką) mogą się różnić, jeśli używany jest inny producent lub model.

1. Uruchomienie FIB/SEM

1. Zamontuj specjalnie zbudowaną końcówkę zimnego nanomanipulatora (NM) bez dołączania oplotów Cu do antyskaminatora (AC). Zamiast tego upewnij się, że warkocze są połączone z resztą NM powyżej punktu izolacji, aby zapobiec ładowaniu się podczas etapu ostrzenia (1.2).
   1. Zamknij komorę SEM, przepompuj do wysokiej próżni i zobrazuj końcówkę NM.
   2. Jeśli końcówka jest, wygięta lub zanieczyszczona poprzednim użyciem, naostrz ją za pomocą wiązki jonów: wybierz wielokątne wzory frezowania wzdłuż boków końcówki, tak aby po frezowaniu końcówka zwężała się do 1 μm lub mniej.
   3. Po wyfrezowaniu boków końcówki należy ręcznie obrócić o 90° cały pręt NM od zewnątrz komory SEM.
   4. Dostosuj wzory frezowania wielokątnego, aby dostosować się do obróconej końcówki i powtórz frezowanie pod innym kątem.
2. Gdy końcówka zostanie naostrzona na mniej niż 1 μm, wycofaj NM i włóż igłę systemu wtrysku gazu (GIS); zmień położenie igły tak, aby znajdowała się około 1 mm powyżej odległości roboczej (zamiast zwykłych 175 μm).
3. W przypadku stosowania prekursora Pt należy zmienić jego temperaturę roboczą na 24-26 °C (zamiast zwykłych 40 °C). Te kroki są potrzebne do kriodepozycji¹³ z Pt.
4. Otwórz komorę SEM i przygotuj FIB/SEM do trybu kriogenicznego, montując stolik na kriopróbkę i prąd przemienny.
5. Przełącz NM do pozycji włożonej i podłącz jego oploty Cu do AC. Uważaj, aby przypadkowo nie dotknąć końcówki NM. System jest chłodzony z włożonym NM, aby upewnić się, że utrata elastyczności oplotu Cu w temperaturach kriogenicznych nie będzie utrudniać ruchu NM.
6. Przedmuchiwać rury do chłodzenia suchym azotem przez kilka minut.
7. Przepompuj komorę przygotowania kriogenicznego i główną komorę próbki do wysokiej próżni.
8. Dodaj ciekły azot do Dewarsa, aby schłodzić obie komory. Poczekaj, aż zostanie osiągnięta żądana temperatura.

2. Zamrażanie próbki

1. 1. Zamontuj dwie siatki TEM dla próbek FIB na uchwycie transferowym SEM. Zabezpiecz je, dokręcając odpowiednie śrubokrętem.
   2. Zamontuj króciec próbki odpowiedni dla próbki i dodaj część próbki. W zależności od rodzaju próbki, próbkę można utrwalić za pomocą kleju kriogenicznego lub zacisku. Używaj jak najmniejszych ilości, aby zapewnić optymalne zamrażanie.
   3. Zamontuj uchwyt transferowy SEM na urządzeniu do transferu próżniowego (VTD).
2. 1. Dodaj ciekły azot do stacji błota pośniegowego i pompuj w dół, aby uzyskać błoto pośniegowe azotu.
   2. Otwórz stację spłukania i zanurz uchwyt transferowy SEM. Pompuj ponownie, aż gotowanie zostanie zakończone i ponownie uzyskasz błoto pośniegowe. Należy zauważyć, że błoto pośniegowe etan lub propan lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem są bardziej odpowiednimi technikami do uzyskania witryfikacji próbki.
3. 1. Wsunąć uchwyt transferowy SEM do komory próżniowej VTD i uszczelnić go.
   2. Odpowietrzyć stację błota pośniegowego i śluzę powietrzną komory przygotowania kriogenicznego.
   3. Dopasuj uszczelkę VTD do śluzy powietrznej komory przygotowania kriogenicznego i pompy.
   4. Po osiągnięciu dobrego poziomu podciśnienia zatrzasnąć sworzeń śluzy powietrznej, aby otworzyć uszczelkę VTD i zewnętrzną śluzę powietrzną; włożyć uchwyt transferowy SEM. Na stykach ślizgowych w komorach przygotowawczych znajdują się oznaczenia wskazujące pozycję próbki do rozpylania i pękania.
4. W razie potrzeby próbka może być: rozbita zimnym nożem; poddana sublimacji przez ustawienie wyższej temperatury (zwykle -100 °C); pokryta Au/Pd lub Pt za pomocą rozpylacza na zimno (300 V, 10 mA, 60 s dla nasadki Au/Pd 2-3 nm)*. Sublimacji nie należy stosować w przypadku próbek zeszklonych, aby uniknąć ich rekrystalizacji.
5. 1. Użyj zimnego noża, aby otworzyć pokrywy ochronne szczelin siatki TEM.
   2. Doprowadzić zimny stolik w komorze na próbkę do wysokości odbioru (16 mm*).
   3. Wyłączyć HT w FIB/SEM i otworzyć wewnętrzną śluzę powietrzną.
   4. Użyj VTD, aby przenieść uchwyt SEM do komory na próbkę. W tym kroku może pomóc przyciemnienie oświetlenia w pomieszczeniu.
   5. Gdy uchwyt SEM znajdzie się w zimnym stage, odłącz VTD, popychając i obracając.
   6. Wsuń pręt VTD do końca do komory próżniowej VTD i zamknij wewnętrzną śluzę powietrzną, zewnętrzną śluzę powietrzną i uszczelkę VTD. Zewnętrzną śluzę powietrzną można teraz odpowietrzyć, aby usunąć uszczelkę VTD. Ten ostatni krok nie jest wymagany, ale jest zalecany, ponieważ pręt VTD może zostać łatwo przemieszczony przez przypadkowy, co może spowodować uszkodzenie VTD lub śluzy powietrznej.

3. Mielenie jonowe

1. Włącz wysokie napięcie na obu kolumnach i ustaw odpowiednie parametry obrazowania (napięcie przyspieszające: 10 kV dla wiązki elektronów, 30 kV dla wiązki jonów; wielkość plamki: 3; odległość robocza: 5 mm, prąd wiązki jonów: 10-100 pA dla obrazowania, 1-3 nA dla frezowania)*.
2. Użyj wiązki elektronów, aby znaleźć interesującą cechę i uzyskać obrazy w celu udokumentowania stanu próbki przed ekstrakcją blaszki.
3. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania (ROI) do ekstrakcji należy go oznaczyć za pomocą wzoru wiązki jonów, chyba że topografia samej próbki pozwala na łatwą identyfikację ROI nawet po osadzeniu Pt. Aby zwiększyć precyzję, użyj metody opisanej przez Petterssona i wsp. ¹⁴ Oznaczenia powinny być głębokie, szerokie i na tyle daleko, aby były nadal widoczne po pokryciu przez osadzanie cryo-Pt (które jest nieselektywne i obejmuje kilka^mm2 powierzchni próbki).
4. Podgrzać gaz prekursorowy do temperatury 24-26 °C i wprowadzić igłę GIS na wysokość około 1 mm powyżej powierzchni próbki (patrz również krok 1.3).
5. Podczas obrazowania wiązką elektronów otwórz zawór gazowy na kilka sekund. Szybkość osadzania cryo-Pt wynosi 100-500 nm/s lub więcej, w zależności od odległości igły GIS, chropowatości próbki i systemu użytkownika. Wskazane jest przeprowadzenie kilku depozycji testowych w celu określenia optymalnych parametrów.
6. Osadzanie surowego krio-Pt jest bardzo szorstkie i niejednorodne. Utwardź osad nad ROI za pomocą wiązki jonów o natężeniu 1,000 pA przy małym powiększeniu (na przykład 2,000X). W przeciwieństwie do osadzania kriogenicznego, to utwardzanie jest selektywne i powinno być wykonywane tylko na ROI. Celem tego pierwszego krioosadzania jest ochrona powierzchni próbki przed uszkodzeniem wiązki jonów i zmniejszenie zasłony podczas rozrzedzania jonów¹³.
7. Przechylić próbkę pod kątem 52° tak, aby powierzchnia była prostopadła do wiązki jonów. Zmiel dwa tarasowe rowy po obu stronach ROI. Typowe wymiary wykopów to 20-30 μm w kierunku (X) równoległym do lameli do wydobycia, 10-15 μm w kierunku prostopadłym (Y) oraz o zmiennej, nachylonej głębokości (Z), przy czym najgłębszy punkt znajduje się blisko ROI. Nachylenie powinno wynosić 45-55°. W niektórych instrumentach rowy tarasowe można frezować tylko z najgłębszym punktem na górze. W takim przypadku należy frezować jeden pod ROI, a następnie obrócić obraz o 180° i frezować drugi po drugiej stronie. Głębokość frezowania można wybrać, jeśli znana jest szybkość napylania materiału. W przypadku większości próbek mrożonych uwodnionych można zastosować szybkość rozpylania lodu⁷.
8. Przechylić próbkę z powrotem do 0° i użyć wiązki jonów, aby odciąć boki i spód blaszki, upewniając się, że ślady cięcia przechodzą przez całą lamelę (powinny pozostawić ślady frezowania na tarasowych zboczach wyfrezowanych w poprzednim kroku). Pozostawić tylko dwa małe mostki łączące blaszkę z resztą próbki.
9. Włóż igłę GIS (może to nieznacznie przesunąć próbkę). Manewruj NM tak, aż jego końcówka znajdzie się w fizycznym kontakcie z blaszką, najlepiej z boku. Upewnij się, że NM nie zasłania wiązki jonów view dwóch małych mostów łączących.
10. 1. Otwórz zawór GIS na kilka sekund i monitoruj osadzanie kriogeniczne poprzez ciągłe obrazowanie wiązką elektronów.
    2. Po osadzeniu kriogenicznym dodatkowej warstwy 1-2 μm Pt, zamknij zawór.
    3. Utwardzać Pt (patrz krok 2.6) tylko w kilku μm wokół punktu, w którym NM styka się z blaszką.
    4. Użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę. Dwa mostki łączące powinny zostać wyfrezowane, podobnie jak wszelki nadmiar Pt, który mógł utworzyć nowe punkty kontaktowe między blaszką a resztą próbki. Nie należy jeszcze wciągać igły GIS.
11. Ostrożnie manewrować NM, aby wydobyć blaszkę z rowów i przesunąć ją co najmniej 500 μm nad powierzchnię próbki. Dopiero po tym kroku należy schować igłę GIS.
12. Obniż stolik na próbkę o kilka mm i przesuwaj go, aż jedna z siatek TEM znajdzie się w polu widzenia. Przesuń obszar mocowania na siatce do pozycji roboczej i włóż igłę GIS.
13. 1. Ostrożnie manewruj NM, aby dołączona blaszka zetknęła się fizycznie z obszarem mocowania na siatce TEM. Nie powinno być nacisku ani naprężenia między blaszką, siatką TEM i NM.
    2. Otwórz zawór gazowy na kilka sekund i krioosadzaj dodatkową warstwę Pt o grubości 1-2 μm.
    3. Utwardzać Pt (patrz krok 2.6) tylko w odległości kilku μm wokół punktu styku między blaszką a siatką TEM.
14. Użyj prądu o wysokiej wiązce jonów, aby odciąć lamelę od NM. Można to osiągnąć poprzez wyfrezowanie końcówki NM lub boku próbki. W pierwszym przypadku końcówka będzie musiała zostać ponownie naostrzona przed następnym użyciem, jak opisano w kroku 1.2.
15. OPCJONALNIE: na tym etapie możliwe jest użycie VTD do pobrania uchwytu transferowego SEM i przechowania go O/N w Dewarze wypełnionym ciekłym azotem. To przenoszenie i magazynowanie O/N może spowodować tworzenie się lodu na powierzchni blaszki, jeśli kryształki lodu są już obecne i/lub jeśli ciekły azot jest wystawiony na działanie wilgotnego powietrza; Ale takie zanieczyszczenie zostanie usunięte przez następny krok w stosunkowo krótkim czasie. Z uwagi na to, że wykonanie poprzednich etapów mogło zająć kilka godzin, może to być właściwe, ponieważ po następnym kroku takie przechowywanie O/N nie jest zalecane, ponieważ nie byłoby innego sposobu na usunięcie zanieczyszczenia lodem niż sublimacja (której nie można przeprowadzić, jeśli ma być utrzymana witryfikacja próbki).
16. Przechyl próbkę pod kątem 52° i użyj wiązki jonów, aby rozrzedzić ją do przezroczystości elektronów⁷. Zaleca się rozpoczęcie od wyższych, bardziej szorstkich prądów wiązki, aby usunąć masę i przystąpić do dokładnego polerowania powierzchni za pomocą prądów dolnej wiązki, ostatecznie zmniejszając również napięcie przyspieszające. Ostateczna grubość lameli powinna wynosić 100-200 nm lub mniej w przypadku analizy ultrastruktury w TEM 100-200 kV lub do 500 nm w przypadku tomografii w TEM 300 kV, w zależności od składu próbki. Podczas rozcieńczania naprężenia wewnętrzne próbki mogą powodować zwijanie się lub wyginanie blaszki. W takim przypadku należy ograniczyć przerzedzony obszar. Stało się tak na przykład na rysunkach 11 i 12.

4. Transfer kriogeniczny do TEM

1. 1. Przepłukać stację kriotransferową suchym azotem przez kilka minut.
   2. Dodać ciekły azot do Dewara TEM AC i do stacji kriotransferowej.
   3. Włóż uchwyt TEM do kriotransferu w odpowiednie gniazdo stacji kriotransferu i napełnij go również Dewarem. Poczekaj, aż każdy składnik osiągnie żądaną temperaturę (około 15 minut). Jeśli to możliwe, należy podłączyć sterownik uchwytu TEM do kriotransferu, aby monitorować temperaturę podczas transferu. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że końcówka uchwytu TEM (gdzie znajduje się czujnik temperatury) będzie stykać się ze stacją kriotransferową i dlatego ostygnie znacznie szybciej niż reszta uchwytu TEM. Dlatego zaleca się, aby czas potrzebny do schłodzenia całego uchwytu do kriotransferu TEM został wcześniej zmierzony i aby system mógł ulec termalizacji przez co najmniej taki czas.
   4. Napełnij kubek kriogeniczny ciekłym azotem i zanurz w nim: narzędzie do zaciskania próbki TEM, śrubokręt i pęsetę, aby schłodzić ich końcówki do żądanej temperatury. Wszystkie narzędzia powinny być odpowiednio izolowane na drugim końcu, aby nie spowodować zimnych oparzeń dłoni operatora.
2. Dopasuj VTD do zewnętrznej śluzy powietrznej. Doprowadzić zimny stopień do wysokości transferu (16 mm*). Wyłącz wysokie napięcie.
3. 1. Otwórz uszczelkę VTD, zewnętrzną śluzę powietrzną i wewnętrzną śluzę powietrzną.
   2. Użyj pręta VTD, aby zablokować się w uchwycie transferowym SEM, popychając i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
   3. Wciągnąć uchwyt transferowy SEM do komory kriopreparacji.
   4. Użyj zimnego noża, aby zamknąć pokrywy ochronne kratek TEM. Jest to konieczne, aby zmniejszyć ewentualne zanieczyszczenie lodem podczas przenoszenia.
   5. Użyj pręta VTD, aby przenieść próbkę do komory próżniowej VTD.
   6. Zamknij śluzy powietrzne i uszczelnij.
4. Odpowietrzyć zewnętrzną śluzę powietrzną i odłączyć VTD. Dopasuj VTD do portu SEM stacji kriotransferowej. Podczas płukania suchym azotem użyj kołka na stacji, aby otworzyć uszczelkę VTD i wsuń uchwyt transferowy SEM do Dewara stacji kriotransferowej.
5. 1. Dodaj tyle ciekłego azotu, aby poziom w stacji kriotransferowej był wystarczająco wysoki, aby po prostu zanurzyć próbkę.
   2. Użyj wcześniej schłodzonego śrubokręta, aby otworzyć jedną z pokryw i poluzować odpowiednią, która utrzymuje kratkę TEM na miejscu.
   3. Użyj wcześniej schłodzonej pęsety, aby wybrać siatkę TEM i umieścić ją w uchwycie TEM.
   4. Użyj chłodzonego pierścienia sześciokątnego, aby przymocować siatkę TEM do uchwytu TEM.
   5. Zamknij migawkę uchwytu TEM do kriotransferu. Etap przenoszenia próbki ma kluczowe znaczenie i może być utrudniony przez gazowy azot, który zmniejsza widoczność małej próbki TEM.
   6. Odłączyć stację kriotransferową od systemu pompowania i przetransportować ją w pobliże TEM wraz ze sterownikiem grzałki uchwytu TEM do kriotransferu.
   7. Uruchom pompę turbomolekularną TEM, aby przepompować linię podkładową do śluzy powietrznej TEM.
   8. Ustaw stolik na próbki TEM pod kątem -70°.
   9. Ustaw najkrótszy czas pompowania śluzy (30-60 sekund), z tylko jednym cyklem przedmuchiwania suchym azotem gazowym.
6. Upewnij się, że przesłona ochronna na uchwycie kriotransferu TEM jest zamknięta. Wyjmij uchwyt TEM ze stacji kriotransferowej i włóż go do przechylonego goniometru (ciekły azot wyleje się z uchwytu TEM Dewara). Rozpocznie się cykl pompowania. Po zakończeniu cyklu ustaw goniometr tak, aby przechylił się z powrotem do 0° i jednocześnie przytrzymaj uchwyt TEM tak, aby nie obracał się wraz z goniometrem. Włóż go całkowicie do TEM. Na tym etapie uchwyt kriotransferu TEM powinien być podłączony do sterownika grzałki w celu monitorowania temperatury. Procedura wkładania uchwytu próbki do TEM może się różnić w zależności od TEM. Dlatego zaleca się skontaktowanie się z producentem TEM w celu uzyskania odpowiedniej procedury.
7. Napełnij uchwyt TEM do kriotransferu Dewara. Poczekaj, aż próżnia w TEM osiągnie akceptowalny poziom.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano: FIB/SEM z podwójną wiązką wyposażony w nanomanipulator i komorę do kriopreparacji; TEM z uchwytem do kriotransferu; prototypową stację do kriotransferu. Noże antykontaminacyjne (AC) komory do kriopreparacji oraz końcówka nanomanipulatora (NM) zostały zmodyfikowane przez firmę Gatan. W porównaniu do standardowej komory do kriopreparacji, noże AC są większe, aby zapewnić lepszy radiator dla końcówki NM. Ponadto AC jest wyposażony w zaciski do podłączenia miedzianych splotów (Cu) w celu wymiany ciepła z końcówką NM. Układ pneumatyczny FIB/SEM został zmodyfikowany tak, aby NM mógł zostać wprowadzony i pozostać wewnątrz nawet po odpowietrzeniu komory z próbką. Należy zauważyć, że parametry zastosowane w tej pracy są najlepiej dostosowane do wyżej wymienionego sprzętu; parametry te mogą wymagać korekty podczas pracy z innymi typami urządzeń. Podczas pracy z tym protokołem należy przestrzegać standardowych środków ostrożności przy obchodzeniu się z kriogenami, ciekłym azotem i systemami próżniowymi.

Metodę przetestowano z dobrymi wynikami na różnych rodzajach próbek, od roztworów lub matryc polimerowych zawierających nanocząstki, po organizmy jednokomórkowe i nicienie. Przykłady poszczególnych etapów procedury przedstawiono na Rysunkach 1-12 na przykładzie zarodników A. niger barwionych tetratlenkiem osmu i nadmanganianem potasu. Zarodniki są najpierw obrazowane za pomocą SEM (Rysunek 1), aby zidentyfikować miejsce ekstrakcji. W tym przypadku wystarczający był przekrój poprzeczny dowolnego zarodnika, jednak możliwe jest ustawienie ROI dla ekstrakcji z submikrometrową precyzją, aby na przykład przeciąć konkretną komórkę w określonej odległości od błony komórkowej. Po zidentyfikowaniu interesującej cechy wykonuje się pierwszy etap kriodepozycji Pt (Rysunek 2), aby chronić próbkę przed uszkodzeniami wywołanymi wiązką podczas trawienia jonowego. Próbkę przechyla się pod kątem 52°, aby przejść do pierwszych etapów trawienia (Rysunek 3): rozpylania dwóch rowów po obu stronach lameli. Następnie próbkę przywraca się do pozycji wyjściowej i poddaje dalszemu trawieniu, tak aby pozostały jedynie dwa małe mostki łączące ją z materiałem zbiorczym (Rysunek 4). Chłodzony nanomanipulator zostaje doprowadzony do kontaktu z lamelą (Rysunek 5), a kolejna kriodepozycja Pt lutuje je ze sobą (Rysunek 6). Następnie małe mostki łączące są wytrawiane, a NM przesuwa lamelę w pobliże obszaru mocowania siatki TEM (Rysunek 7), gdzie zostaje ona przylutowana za pomocą końcowej kriodepozycji Pt (Rysunek 8). Następnie NM zostaje oddzielony od lameli (Rysunek 9), która jest cieńczona wiązką jonową do uzyskania przezroczystości dla elektronów (Rysunek 10 oraz 11). Lamela jest ostatecznie przenoszona do TEM (Rysunek 12), gdzie można zastosować obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, spektroskopię, tomografię i inne techniki.

Rycina 1. Obraz cryo-SEM zarodników A. niger przed osadzaniem Pt.

Rysunek 2. Ten sam obszar co na Rysunku 1 po osadzaniu Pt, ale przed utwardzaniem.

Rycina 3. Obraz Cryo-SEM tego samego obszaru co na Rycini 2, pochylony o 52º, po osadzaniu Pt i utwardzaniu, podczas procesu frezowania rowka (patrz krok 3.7).

Rycina 4. Lamela przygotowana do wycięcia (lift-out).

Rysunek 5. Końcówka zimnego nanomanipulatora styka się z lamelą.

Rysunek 6. Druga krio-depozycja Pt jest wykorzystywana do przylutowania nanomanipulatora do lamelli.

Rysunek 7. Zimny nanomanipulator służy do przeniesienia lamelli do obszaru mocowania na siatce TEM.

Rysunek 8. Ponownie zastosowano kriodepozycję w celu przymocowania lamelli do siatki TEM.

Rysunek 9. Lamela została odcięta od nanomanipulatora i jest teraz gotowa do przechowywania lub do cieńczenia aż do uzyskania przezroczystości dla elektronów.

Rysunek 10. Etap pośredni procesu cieńczenia, z kilkoma widocznymi zarodnikami w przekroju poprzecznym.

Rysunek 11. Obraz Cryo-SEM próbki po końcowym cieńczeniu; większość pozostałych zarodników musiała zostać usunięta poprzez frezowanie, ponieważ lamelka zaczęła się zwijać.

Rysunek 12. Złożony obraz cryo-TEM lamelli. Część podstawki Al została włączona do lamelli (czarna strzałka).

Dyskusja

Protokół ten jest dość prostą adaptacją do temperatur kriogenicznych standardowego przygotowania próbek FIB/TEM stosowanego w materiałoznawstwie w RT. W wyniku tej metody próbki TEM są wolne od odkształceń mechanicznych i śladów noża (główna wada mikrotomii), chociaż może wystąpić zasłonięcie, jeśli powierzchnia próbki jest niejednorodna. Można to zmniejszyć poprzez krioosadzanie warstwy wierzchniej (w tej pracy użyto Pt), utwardzanej do uzyskania gładkiej i pozbawionej cech¹³. Można również przygotować próbki ze składnikami o bardzo różnej twardości bez ryzyka, że pękną one pod wpływem naprężeń podczas przygotowania. Naprężenia wewnętrzne mogą nadal powodować wyginanie się lub zwijanie cienkiej lameli, w takim przypadku rozmiar przekroju musi zostać zmniejszony. Wadą w porównaniu z innymi metodami jest możliwość zmiany struktury biologicznej w wyniku ekspozycji na wiązkę jonów i ewentualnego zagnieżdżenia się jonów w próbce. Wady te występują również w RT do przygotowania próbek w materiałoznawstwie¹⁵. Można je zmniejszyć, kończąc rozcieńczanie końcowym etapem polerowania przy najniższym napięciu przyspieszającym jony (500-1 000 V). Ten bardzo delikatny etap polerowania usunie uszkodzoną warstwę z lameli.

Ze względu na charakter kriodepozycji (kroki 3.5, 3.10 i 3.13), duże części próbki zostaną pokryte, zasłaniając w ten sposób widok pierwotnej powierzchni. Może to utrudnić śledzenie zwrotu z inwestycji, chyba że używa się wielu oznaczeń, jak sugerowano w kroku 3.3.

Podczas kroków 4.5 i 4.7 cienka blaszka może wejść w kontakt z powietrzem. Należy tego unikać, ponieważ spowodowałoby to tworzenie się kryształków lodu przez wilgoć w powietrzu na powierzchni próbki, co mogłoby doprowadzić do zasłonięcia ważnych cech. Czynności te powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe, ale jednocześnie niewłaściwe obchodzenie się z nimi podczas przenoszenia może spowodować utratę samej próbki. Zaleca się, aby użytkownik przećwiczył te kroki, używając pustych siatek TEM przed podjęciem próby na prawdziwej próbce.

W materiałoznawstwie instrument FIB stał się główną metodą przygotowania próbek TEM w ciągu dekady od jego komercjalizacji. Ponieważ może być stosowany na praktycznie każdej próbce, eliminuje konieczność dostosowywania techniki przygotowania do rodzaju próbki. Jesteśmy głęboko przekonani, że to samo może się zdarzyć w temperaturach kriogenicznych, dzięki procedurze opisanej tutaj. Jego zastosowanie do większych próbek jest nadal uzależnione od możliwości ich kriokonserwacji w stanie zeszklonym, ale techniki takie jak zamrażanie wgłębne lub zamrażanie wysokociśnieniowe^3,5 mogą okazać się optymalnymi rozwiązaniami tego problemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strata DB 235	FEI		FIB/SEM
Omniprobe 100	Oxford Instruments		Nanomanipulator
Alto 2500	Gatan		Komora przygotowania kriogenicznego
Uchwyt kriogeniczny model 626	Gatan		Uchwyt transferowy Cryo TEM
Tecnai F30	FEI		TEM