Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Podsumowanie

Nasz raport opisuje unikalną metodę wizualizacji i analizy interakcji CTC/EC w raku prostaty w warunkach fizjologicznego przepływu.

Streszczenie

Przerzuty to proces, w którym komórki nowotworowe zrzucają się z pierwotnego wewnątrznaczyniowego układu krwionośnego i limfatycznego guza, uzyskując w ten sposób dostęp do wynaczynienia i tworząc niszę wtórną. Wynaczynienie komórek nowotworowych z układu krwionośnego można badać za pomocą komórek śródbłonka (EC) i komórek nowotworowych uzyskanych z różnych linii komórkowych. Początkowe badania przeprowadzono w warunkach statycznych, ale zostało dobrze udokumentowane, że EC zachowują się inaczej. w fizjologicznych warunkach przepływu. Dlatego różne zespoły komór przepływowych są obecnie używane do badania interakcji komórek nowotworowych z EC. Obecne zespoły komór przepływowych oferują powtarzalne wyniki przy użyciu różnych linii komórkowych lub płynu w różnych warunkach naprężeń ścinających. Jednakże, aby obserwować i badać interakcje z rzadkimi komórkami, takimi jak krążące komórki nowotworowe (CTC), Konieczne jest wprowadzenie pewnych zmian w konwencjonalnym zespole komory przepływowej. CTC to rzadka populacja komórek spośród milionów komórek krwi. W związku z tym trudno jest uzyskać czystą populację CTC. Zanieczyszczenie CTC różnymi typami komórek normalnie występujących w krążeniu jest nieuniknione przy użyciu obecnych technik wzbogacania lub zubożania. W niniejszym raporcie opisujemy unikalną metodę fluorescencyjnego znakowania krążących komórek raka prostaty i badania ich interakcji z EC w samoorganizującym się systemie komór przepływowych. Technika ta może być dalej stosowana do obserwacji interakcji między prostatą CTC i wszelkie białka będące przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Przerzuty to złożony, wieloetapowy proces, który pozostaje słabo poznany. Wykazano, że oś ligandu E-selektyna/selektoryna odgrywa ważną rolę w przerzutach nowotworowych poprzez promowanie pierwotnych interakcji adhezyjnych między śródbłonkiem naczyniowym a komórkami nowotworowymi^1,2. Selektyna śródbłonkowa (E) jest białkiem transbłonowym wyrażanym przez aktywowane komórki śródbłonka, podczas gdy różne ligandy E-selektyny są wyrażane przez komórki nowotworowe³. Liczne podejścia in vitro zostały z powodzeniem zastosowane do modelowania interakcji liganda E-selektyny/selektoryny między komórkami nowotworowymi a komórkami śródbłonka (EC)¹. Aby zbadać te interakcje, stosuje się różne systemy komór przepływowych do symulacji układu krwionośnego. Wśród zespołów komór przepływowych, komora przepływowa z równoległą płytką (PPFC) w połączeniu z EC jest rutynowo stosowana jako model in vitro symulujący in vivo warunki naprężenia ścinającego. W tej metodzie EC są hodowane na szalce o średnicy 35 mm, a po uzyskaniu monowarstwy EC są dołączane do PPFC i przeprowadzane są eksperymenty oparte na naprężeniach ścinających.

Jednak PPFC i inne obecne systemy mają wiele ograniczeń w badaniu interakcji adhezyjnych między krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC) pochodzącymi od pacjentów a EC, przede wszystkim dlatego, że CTC to rzadka populacja komórek, wydalanych z pierwotnego nowotworu, krążących wśród milionów komórek krwi (1 CTC na 10⁹ komórek krwi)⁴. W związku z tym, w przeciwieństwie do nieograniczonej podaży hodowanych linii komórkowych, niska liczba CTC prowadzi do bardzo niewielu i rzadkich interakcji CTC/EC, co wymaga odpowiedniej szerokości kanału przepływu do rejestrowania interakcji do analizy odtwarzania. Dodatkowo, ponieważ CTC pochodzące od pacjentów są populacją zanieczyszczoną, dlatego wymagany jest marker identyfikacyjny do śledzenia CTC w szczególności. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy nową metodę identyfikacji CTC raka prostaty (PCa), wykorzystując fakt, że praktycznie wszystkie te CTC wyrażają antygen błonowy specyficzny dla prostaty (PSMA) na powierzchni komórki^5,6. W tym raporcie wykorzystaliśmy linię komórkową raka prostaty, MDA PCa2b (MDA), aby zademonstrować potencjalną użyteczność naszego nowego systemu do badania interakcji CTC prostaty z EC, w końcu, aby zrozumieć mechanizm przerzutów.

Nasza metodologia może być stosowana do różnych eksperymentów opartych na ścinaniu, symulujących układ naczyniowy in vivo ^7-9. Oprócz badania interakcji PCa CTC/EC, obecny system komór przepływowych może być łatwo przystosowany do analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub interakcji komórek nowotworowych z EC. Łatwość demontażu i ponownego montażu komory przepływowej, mikroszkiełko III ^(0,1) (zwane dalej mikroszkiełkiem), umożliwia hodowlę EC pod wpływem perfuzji i stymulowanie EC różnymi cytokinami w celu indukowania ekspresji białka. Poza tym hodowane EC, rekombinowane białka, takie jak selektyna E i P, mogą być pokryte mikroszkiełkiem, a interakcje z komórkami nowotworowymi można obserwować w warunkach przepływu laminarnego¹⁰.

Protokół

1. Hodowla HUVEC na mikroszkiełkach do obserwacji interakcji CTC-śródbłonek

1. Pod kapturem do hodowli tkankowej najpierw przepłukać mikroszkiełko o szerokości kanału 1 mm za pomocą PBS. Delikatnie pokryć mikroszkiełko 200 μl 50 μg/ml fibronektyny (rozpuszczonej w PBS) za pomocą 1 ml strzykawki Luer-lock.
2. Przykryj mikroszkiełko pokrywką i trzymaj je w kapturze do hodowli tkankowych przez 30 minut. Powolne dozowanie płynu do mikroszkiełka zapobiega tworzeniu się pęcherzyków w kanale.
3. Przeprowadzić 200 μl ciepłej (37 °C) pożywki wzrostowej HUVEC (pożywka M199, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg/ml heparyny, 100 μg/ml czynnika wzrostu komórek śródbłonka i L-glutamina) na mikroszkiełku i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Podczas perfuzji należy przygotować zawiesinę komórek HUVEC.
4. Przepłukać HUVEC PBS i dodawać 0,05% trypsyny-EDTA przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować HUVEC w 2 ml pożywki wzrostowej przy 180 x g przez 5 min.
5. Zmierzyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru neubauerowskiego i przygotować 10⁷ komórek HUVEC/100 μl pożywki wzrostowej. Następnie ostrożnie wyjmij pożywkę z wlotu mikroszkiełka za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
6. Doprowadzić mikroszkiełko do poziomu oczu i za pomocą 1 ml strzykawki Luer-lock delikatnie przelać 200 μl przygotowanego stężenia HUVEC do kanału. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Jeśli pojawią się bąbelki, kontynuuj perfuzję przez nieco dłuższy czas, aż bąbelki dostaną się do kanału wylotowego.
7. Umieść równą objętość (~80 μl) pożywki HUVEC zarówno na wlocie, jak i wylocie mikroszkiełka. Zapobiega to przepływowi komórek w dowolnym kierunku.
8. Przykryć szkiełko i przechowywać je w inkubatorze (37 °C) przez 1,5 godziny.

2. Przygotowanie zespołu komory przepływowej do nocnej hodowli HUVEC na mikroszkiełku

1. Umieść sterylną strzykawkę o pojemności 20 ml, żeńskie i męskie złącza Luer, rurkę i pompę strzykawkową w inkubatorze na 15 minut.
2. Aby uzyskać minimalną objętość martwą, użyj rurki o średnicy wewnętrznej 0.04 cala. Mniejsza średnica rurki zapobiega tworzeniu się pęcherzyków.
3. Napełnić strzykawkę o pojemności 20 ml ciepłym (37 °C) podłożem HUVEC (12 ml). Przymocować rurkę ze złączami do strzykawki. Usuń bąbelki. Podłącz ten zespół do mikroszkiełka.
4. Całkowicie napełnij wlot mikroszkiełka mediami HUVEC. Przynieść napełnioną strzykawkę o pojemności 20 ml dołączoną do łącznika obok mikroszkiełka. Delikatnie przymocuj łącznik do mikroszkiełka.
5. Przenieś zestaw do inkubatora i podłącz go do pompy strzykawkowej ustawionej na szybkość ścinania 10 μl/min. Pozostawić komórki O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
6. Następnego dnia zdemontuj zestaw, wyjmując złącze dołączone do wlotu mikroszkiełka.
7. Aby zwiększyć ekspresję selektyny E na ECs, przygotuj świeżą pożywkę wzrostową zawierającą IL-1β w stężeniu 10 ng/ml w 4 ml pożywki. Odessać podłoże do strzykawki o pojemności 10 ml. Wyjąć pożywkę z wlotu mikroszkiełka i podłączyć strzykawkę do szkiełka.
8. Ustawić pompę strzykawkową na szybkość ścinania 10 μl/min na 4 godziny w inkubatorze.

3. Przygotowanie komórek raka prostaty znakowanych anty-PSMA (J591-488)

1. Podczas inkubacji IL-1β HUVEC należy przygotować komórki PCa znakowane anty-PSMA J591-alexa488. Dodaj 0,05% trypsyny-EDTA do komórek MDA na 1 minutę. Nie wystawiaj komórek na działanie trypsyny przez dłuższy czas, ponieważ może to wpływać na glikopeptydy obecne na powierzchni komórki. Zamiast trypsyny można również użyć odczynnika do dysocjacji komórek bez enzymów. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
2. Zawiesić osad komórek MDA w 1 ml buforu H/H (zrównoważony roztwór soli Hanksa/0,1% HSA/10 mM HEPES/1 mM CaCl₂). Dodaj przeciwciało anty-PSMA J591-alexa488 w stężeniu 20 μg/ml przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu. Ponownie zawiesić komórki podczas inkubacji.
3. Po 30 minutach odwirować roztwór komórek o stężeniu 800 x g przez 5 minut. Odessać i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu H/H. Policz znakowane komórki MDA i doprowadź końcowe stężenie do 1x10⁶ komórek/ml. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml komórkami MDA oznaczonymi J591-488 i usuń pęcherzyki.

4. Przygotowanie CTC znakowanych anty-PSMA (J591-488) wzbogaconych od pacjentów z PCa

1. Pobrać 7,5 ml krwi od pacjentów z rakiem prostaty do niebieskiej probówki (zawierającej cytrynian sodu). Delikatnie rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 w 0,1% BSA/1 mM EDTA/PBS.
2. Dodać 5,3 ml Ficoll-paque plus do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Warstwę rozcieńczonej krwi na wierzchu ficoll-paque. Wirować przy 400 x g przez 30 min.
3. Wstępnie pokryj wszystkie rurki lub końcówki stykające się z CTC 2% FBS/RPMI-1640/ 1 mM CaCl₂/ 4 mM MgCl₂ (bufor R/S), aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu CTC z powierzchniami. Utrzymuj temperaturę 4 °C pożywek i mających kontakt z CTC.
4. Zebrać frakcję komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) zawierającą CTC z granicy faz w innej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforu R/S. Wirować przy 400 x g przez 8 min.
5. Zawiesić osad i ponownie przemyć w buforze R/S o stężeniu 400 x g przez 8 min. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w buforze H/H. Dodać przeciwciało anty-PSMA J591-488 w stężeniu 20 μg/ml przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.
6. Po 30 minutach odwirować PBMC zawierające CTC znakowane J591-488 w temperaturze 800 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić w buforze H/H. Napełnić próbkę strzykawką o pojemności 1 ml (wstępnie pokrytą buforem R/S).

5. Przygotowanie zestawu mikroskopu, pompy strzykawkowej i komory przepływowej

1. Włącz mikroskop odwrócony i ustaw oświetlenie Kohlera na obiektyw 10X. Ustawić pompę strzykawkową na tym samym poziomie, co stolik na próbki w mikroskopie i ustawić ją na naprężenie ścinające 1 dyn/^cm2 (~ 10 μl/min).
2. Otwórz oprogramowanie Zeiss Axiovision. Wybierz cel na ekranie komputera. Utwórz nowy folder w opcji narzędzi w oprogramowaniu.
3. Otwórz opcję inteligentnych eksperymentów w Axiovision i dostosuj ustawienia, aby nagrywać krótkie 30-sekundowe filmy przez 30 minut.
4. W przypadku fluorescencyjnego wideo na żywo ustaw opcje obrazu - Ekspozycja 12 ms, 2 x 2 bin, 5 Wzmocnienie. Parametry te pomagają w uzyskiwaniu filmów zbliżonych do liczby klatek na sekundę wideo (~ 23 klatki na sekundę) za pomocą aparatu Zeiss mRm.
5. Aby wyświetlić na ekranie komputera pełną szerokość kanału przepływowego przy obiektywie 10 X, należy użyć adaptera C-mount (interfejs 0,63 x f/60 mm).
6. Włącz lampę rtęciową.
7. Umieścić strzykawkę i łącznik zawierający komórki na pompie strzykawkowej.
8. Przynieś z inkubatora HUVEC stymulowane przez IL-1β. Przymocuj złącze do wypełnionego kanału wlotowego mikroszkiełka zawierającego HUVEC.
9. Podłącz kanał wylotowy do złącza dołączonego do rurki. Umieść rurkę w naczyniu lub stożkowej rurce o pojemności 15 ml, aby zebrać przepływ.
10. Rozpocząć infuzję przez mikroszkiełko z prędkością 10 μl/min. Obserwuj interakcje między komórkami śródbłonka a znakowanymi komórkami MDA lub znakowanymi CTC pochodzącymi od pacjentów pod filtrem 488 nm pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
11. Rozpocznij nagrywanie eksperymentu w formie 30-sekundowych krótkich filmów. Podczas analizy odtwarzania zmierz prędkość toczenia. Prędkość toczenia mierzy się, dzieląc odległość przebytą przez komórki w czasie.

6. Barwienie immunologiczne mikroszkiełka

1. Usuń pożywkę z wlotu i wylotu mikroszkiełka po perfuzji komórek MDA na HUVEC stymulowanych IL-1β przez 10 minut.
2. Za pomocą końcówki o pojemności 200 μl umieść ciepły (37 °C) PBS zawierający wapń i magnez we wlocie mikroszkiełka na 5 minut. Przechyl mikroszkiełko, używając jego pokrywki jako podpory na stole. Utrzymuj mikroszkiełko w pozycji pochylonej przez wszystkie inkubacje podczas barwienia immunologicznego.
3. Napraw HUVEC poprzez perfuzję ciepłego 2% formaldehydu do wlotu
4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Płukać dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.
5. Dodaj triton-X 100 (0,1%) w 5% BSA w PBS przez 10 minut w RT.
6. Płukać dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Blok z 5% BSA w PBS przez 30 min.
7. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem kozim anty-VE-kadheryną (1:100) w 2,5% BSA O/N w temperaturze 4 °C.
8. Następnego dnia myj dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Dodaj wtórne przeciwciało anty-kozie 647 osła na 45 min. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.
9. Inkubować w RT z humanizowanym sprzężonym przeciwciałem J591-alexa488 przez 1 godzinę.
10. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Dodaj DAPI na 5 minut. Myć wodą destylowaną przez 5 min.
11. Dodaj PBS (lub mowiol do długotrwałego przechowywania). Wizualizuj mikroszkiełko pod mikroskopem konfokalnym.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje hodowlę O/N monowarstwy EC na mikroszkiełku. Skale na rysunku 1A pokazują, że 100% mikroszkiełka jest widoczne przy użyciu obiektywu 5X, podczas gdy 70% jest widoczne przy użyciu obiektywu 10X (Rysunek 1B). W przypadku oddziaływań za pośrednictwem selektyny E komórki toczące się na krawędziach nie są brane pod uwagę, co sprawia, że ponad 70% mikroszkiełka jest dostępne do nagrywania wideo i analizy odtwarzania. Z naszego doświadczenia wynika, że począt...

Dyskusja

Ze względu na niską liczbę CTC w komórkach krwi, trudno jest wyizolować CTC jako czystą populację komórek. W celu zbadania interakcji CTC/EC, rzadka i nieczysta populacja CTC stawia dwa główne wyzwania: a) Identyfikacja CTC w komórkach krwi; b) Obserwacja interakcji CTC/EC.

Aby przezwyciężyć pierwsze ograniczenie związane z identyfikacją CTC prostaty wśród komórek krwi, wykorzystaliśmy fakt, że praktycznie wszystkie komórki nowotworowe prostaty wyrażają PSMA^6<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Rurka plastikowa	Cole Parmer	EW-96115-08
Męska adapter Luer	GlycoTech	31-001
Żeńska adapter Luer	GlycoTech	31-001
Pompa strzykawkowa	Chemyx Inc	Fusion 100
Strzykawka Luer-lock	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Śródbłonek Mitogen	Technologie biomedyczne	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anty-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Laboratorium Onkologii
Interleukina-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparyna	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Wydział Chirurgii		dostarczony przez Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x obiektyw	Zeiss Plan Neofluar
Bezenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02