Method Article

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

DOI:

10.3791/51492

⸱

January 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na przeciwciała, które spełniają potrzeby zarówno badań podstawowych, jak i klinicznych, jest wysokie i w przyszłości znacznie wzrośnie. Oczywiste jest jednak, że tradycyjne technologie monoklonalne nie są osamotnione w tym zadaniu. Doprowadziło to do opracowania alternatywnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysokiej jakości i odnawialne odczynniki o powinowactwie do wszystkich dostępnych elementów proteomu. W tym celu opracowano wysokoprzepustowe metody przeprowadzania selekcji z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi do zastosowań obejmujących różne antygeny i zoptymalizowane pod kątem szybkiej przepustowości i sukcesu. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano protokół, który ilustruje za pomocą demonstracji wideo równoległą selekcję klonów Fab-phage z bibliotek o wysokiej różnorodności w stosunku do setek celów przy użyciu ręcznego 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy lub zautomatyzowanego systemu robotyki. Korzystając z tego protokołu, pojedynczy użytkownik może wygenerować setki antygenów, równolegle wybrać przeciwciała przeciwko nim i zweryfikować wiązanie przeciwciał w ciągu 6-8 tygodni. Zwrócono uwagę na: i) realny format antygenu, ii) charakterystykę antygenu przed selekcją, iii) krytyczne etapy, które wpływają na selekcję klonów specyficznych i o wysokim powinowactwie, oraz iv) sposoby monitorowania skuteczności selekcji i charakterystyki klonów przeciwciał we wczesnym stadium. Dzięki takiemu podejściu uzyskaliśmy syntetyczne fragmenty przeciwciał (Fabs) dla wielu klas docelowych, w tym jednoprzebiegowych receptorów błonowych, wydzielanych hormonów białkowych i wielodomenowych białek wewnątrzkomórkowych. Fragmenty te są łatwo przekształcane w przeciwciała o pełnej długości i zostały zweryfikowane pod kątem wysokiego powinowactwa i swoistości. Ponadto wykazano, że są one funkcjonalne w różnych standardowych testach immunologicznych, w tym Western blot, ELISA, immunofluorescencji komórkowej, immunoprecypitacji i powiązanych testach. Metodologia ta przyspieszy odkrywanie przeciwciał i ostatecznie przybliży nas do realizacji celu, jakim jest generowanie odnawialnych, wysokiej jakości przeciwciał przeciwko proteomowi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z nadejściem ery postgenomicznej, dostępność wysokiej jakości odczynników wiążących do charakteryzowania i modulowania białek jest niezbędna do otwarcia nowych ścieżek badawczych i terapeutycznych. Przeciwciała nadal mają kluczowe znaczenie zarówno dla naukowców akademickich, jak i przemysłowych jako podstawowe narzędzia badawcze i diagnostyczne oraz potencjalne terapie. Nic dziwnego, że nastąpił imponujący wzrost liczby firm zajmujących się opracowywaniem przeciwciał na zlecenie, z których większość polega na konwencjonalnych technologiach hybrydoma do generowania niestandardowych przeciwciał. Niemniej jednak selekcja in vitro z wykorzystaniem bibliotek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja antygenu

UWAGA: Domeny antygenowe mogą być syntetyzowane i klonowane przez różnych komercyjnych dostawców do odpowiedniego konstruktu wyrażeń indukowanych przez IPTG.

  1. Przekształć konstrukty ekspresyjne w chemicznie kompetentne, odporne na T1-fagi komórki BL21 E. coli, mieszając 10 ng kodującego DNA w 20 μl 1X KCM na lodzie na 96-dołkowej płytce PCR, a następnie dodając 20 l chemicznie kompetentnych komórek.
  2. Inkubować mieszaninę komórka/DNA na lodzie przez 20 minut, w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ponownie na lodzie przez 2 minuty, a następnie uratować za pomocą 100 μl wstępnie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany tutaj został użyty do równoległego izolowania fragmentów przeciwciał do różnych strukturalnie i funkcjonalnie powiązanych domen antygenowych z kombinatorycznych bibliotek Fab wyświetlanych na fagach. Problemy związane z dostępnością antygenu można w wielu przypadkach obejść poprzez identyfikację in silico wyrażalnych domen antygenu, które są odpowiednie do selekcji przeciwciał23. Poprzez sprzężenie ekspresji antygenu z selekcją przeciwciał w tym samym laboratorium (ryc. 1) moż.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas przeprowadzania selekcji przeciwciał in vitro , dwoma głównymi determinantami sukcesu selekcji są: 1) izolacja dobrze sfałdowanych celów antygenowych do selekcji oraz 2) dostępność biblioteki przeciwciał o wysokiej różnorodności funkcjonalnej. W wielu przypadkach dostępność wystarczających ilości dobrze sfałdowanego białka o pełnej długości może być ograniczona. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest wykorzystanie domen zidentyfikowanych na podstawie analizy bioinformatycznej22

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować NIH Common Fund – Protein Capture Reagents Program za sfinansowanie rozwoju linii selekcji i charakterystyki przeciwciał Recombinant Antibody Network oraz Canadian Foundation for Innovation za sfinansowanie zakupu platformy selekcji robotów.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MATERIAŁY
Nowy Brunszwik Wytrząsarka inkubatorowa Innova44EppendorfM1282-0004
Liquidator 96-kanałowy ręczny system pipetowania stołowegoAnachem LtdLIQ-96-200
Wytrząsarka do mikropłytekVWR12620-926
ThermoScientific Wirówka stołowa Sorvall ST-40Thermo Product
ELx405 Select Deep Well Microplate WasherBiotekELX405USD
Niestandardowy zautomatyzowany robot do wyboru fagów o wysokiej przepustowościS& P Robotics
Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 50 mlVWR21008-178
Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1,7 ml probówki do mikrowirówekCorningMCT-175-L-C
96-dołkowa/384-dołkowa płytka MaxisorpSigmaM9410-1CS
Corning 96-dołkowy blok głębinowy z dnem w kształcie litery VCorning3960
Axygen Mini-tubka 96-dołkowa sterylna mikropłytka niebieskie pudełkoCorningAXY-MTS-06-C-R-S
Oddychająca samoprzylepna folia uszczelniająca do płytekVWR60941-084
ODCZYNNIKI
NazwaFirmaNumer
glikol polietylenowyBioshop PEG800.1
ekstraktdrożdżowy BioshopYEX401.1
bio-tryptonBioshopTRP402.1
N-Z aminaSigmaC7290
glukozaSigmaG8270-1KG
laktozaBioshopLAC234
glicerolBioshopGLY001.500
karbenicylina BioshopCAR544.10
kanamycynaBioshopKAN201.25
tetracyklina BioshopTET701.25
Tween 20BioshopTWN510.500
monozasadowy fosforan potasuBioshopPPM302.1
dwuzasadowy fosforan soduAnachemia84486-440
chlorek soduBioshopSOD001.10
chlorek potasuBioshopPOC308.1
chlorek wapniaBioshopCCL302.500
siarczan magnezuEMDMX0070-1
chlorek magnezuBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe Barwnik żelowy DNAInvitrogenS33102
kwas fosforowyAcros Organics201140010
lizozymBioshopLYS702.25
benzonazaNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
inhibitorów proteazy tabletkiRoche11 836 170 001
Żywica Ni-NTA Qiagen1018240
1,000x pomocniczy (M13K07) zapas (1013 faga na ml)NEBN0315S
specyficzne dla M13 (anty-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
Substrat TMB: wymieszaj równe objętości TMB i sub2O2 sub KPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Polimeraza TaqGenscriptE00007
EgzonukleazaGE Healthcare EZ0073X-EZ
Fosfataza alkaliczna z krewetkamiGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525katalogowy koktajl HRP sprzężone przeciwciało

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phage DisplayAntibody SelectionHigh ThroughputSynthetic LibrariesFab PhageAntigen ImmobilizationParallel SelectionLiquid HandlerRobotic AutomationELISA Validation

Related Articles