Artykuł metodologiczny

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

DOI:

10.3791/51492

⸱

17 stycznia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na przeciwciała, które spełniają potrzeby zarówno badań podstawowych, jak i klinicznych, jest wysokie i w przyszłości znacznie wzrośnie. Oczywiste jest jednak, że tradycyjne technologie monoklonalne nie są osamotnione w tym zadaniu. Doprowadziło to do opracowania alternatywnych metod w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wysokiej jakości i odnawialne odczynniki o powinowactwie do wszystkich dostępnych elementów proteomu. W tym celu opracowano wysokoprzepustowe metody przeprowadzania selekcji z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi do zastosowań obejmujących różne antygeny i zoptymalizowane pod kątem szybkiej przepustowości i sukcesu. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano protokół, który ilustruje za pomocą demonstracji wideo równoległą selekcję klonów Fab-phage z bibliotek o wysokiej różnorodności w stosunku do setek celów przy użyciu ręcznego 96-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy lub zautomatyzowanego systemu robotyki. Korzystając z tego protokołu, pojedynczy użytkownik może wygenerować setki antygenów, równolegle wybrać przeciwciała przeciwko nim i zweryfikować wiązanie przeciwciał w ciągu 6-8 tygodni. Zwrócono uwagę na: i) realny format antygenu, ii) charakterystykę antygenu przed selekcją, iii) krytyczne etapy, które wpływają na selekcję klonów specyficznych i o wysokim powinowactwie, oraz iv) sposoby monitorowania skuteczności selekcji i charakterystyki klonów przeciwciał we wczesnym stadium. Dzięki takiemu podejściu uzyskaliśmy syntetyczne fragmenty przeciwciał (Fabs) dla wielu klas docelowych, w tym jednoprzebiegowych receptorów błonowych, wydzielanych hormonów białkowych i wielodomenowych białek wewnątrzkomórkowych. Fragmenty te są łatwo przekształcane w przeciwciała o pełnej długości i zostały zweryfikowane pod kątem wysokiego powinowactwa i swoistości. Ponadto wykazano, że są one funkcjonalne w różnych standardowych testach immunologicznych, w tym Western blot, ELISA, immunofluorescencji komórkowej, immunoprecypitacji i powiązanych testach. Metodologia ta przyspieszy odkrywanie przeciwciał i ostatecznie przybliży nas do realizacji celu, jakim jest generowanie odnawialnych, wysokiej jakości przeciwciał przeciwko proteomowi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z nadejściem ery postgenomicznej, dostępność wysokiej jakości odczynników wiążących do charakteryzowania i modulowania białek jest niezbędna do otwarcia nowych ścieżek badawczych i terapeutycznych. Przeciwciała nadal mają kluczowe znaczenie zarówno dla naukowców akademickich, jak i przemysłowych jako podstawowe narzędzia badawcze i diagnostyczne oraz potencjalne terapie. Nic dziwnego, że nastąpił imponujący wzrost liczby firm zajmujących się opracowywaniem przeciwciał na zlecenie, z których większość polega na konwencjonalnych technologiach hybrydoma do generowania niestandardowych przeciwciał. Niemniej jednak selekcja in vitro z wykorzystaniem bibliotek przeciwciał wyświetlanych przez fagi staje się potężną technologią alternatywną, która może oferować wyjątkowe korzyści i sukces tam, gdzie konwencjonalne technologie mogą napotkać ograniczenia1, 2.

W świetle znacznego zapotrzebowania na wysokiej jakości przeciwciała jako narzędzia badawcze, dwa główne wyzwania związane z generowaniem przeciwciał odnawialnych to: 1) wydajność selekcji i 2) dostępność antygenu. Wiele grup opisało już procedury selekcji in vitro, mające na celu zwiększenie przepustowości i szybkości identyfikacji przeciwciał. Opisy te szczegółowo opisują różne realne podejścia, które obejmują wybór na podstawie celów o pełnej długości3,4 lub strukturalnie powiązanych domen5,6,7, przy użyciu schematów immobilizacji antygenu3,4 opartych na kulkach6,8 lub płytkach. Ponadto coraz powszechniejsze stosowanie technologii syntezy genów9 sprawiło, że systematyczne wytwarzanie antygenów, zwłaszcza izolowanych domen, jest w miarę opłacalne i może potencjalnie złagodzić trudności w uzyskaniu wystarczających ilości oczyszczonego antygenu o pełnej długości. Wykorzystując te dwie technologie w tandemie, opracowano samodzielny i skalowalny proces generowania i selekcji przeciwciał, który umożliwiłby równoległą izolację przeciwciał dla dużych zestawów eksprymowanych domen antygenowych i ułatwił opracowanie odczynników do charakteryzowania całych klas białek powiązanych strukturalnie lub funkcjonalnie.

W tym celu opracowano zintegrowany potok, który łączy in silico identyfikację ekspresyjnych domen antygenowych, syntezę genów, wysokoprzepustową bakteryjną ekspresję antygenów i skalowalne selekcje przeciwciał wyświetlanych na podstawie fagów. Rurociąg ten wymaga jedynie podstawowej infrastruktury dostępnej dla większości laboratoriów zajmujących się naukami przyrodniczymi (w tym bibliotek przeciwciał, które są coraz częściej dostępne na podstawie licencji lub umowy o transferze materiałów), ale jest również podatny na automatyzację do użytku na skalę przemysłową. Korzystając z tego protokołu, możliwe jest wygenerowanie setek domen antygenowych oznaczonych powinowactwem i rutynowe izolowanie wysoce specyficznych fragmentów przeciwciał do wielu z tych antygenów.

Technologia wyświetlania fagów wykazała kompatybilność z szeroką gamą formatów rekombinowanych odczynników powinowactwa, w tym domenami Fab, scFv i autonomicznymi Fv oraz rosnącą gamą małych 'alternatywnych struktur' (zaprojektowane białka powtórzeń ankyryny (DARPINS), fibronektyna (Fn), domeny lipokaliny i wieleinnych10). Dyskusja ogranicza się w tym przykładzie do izolacji fragmentów przeciwciał Fab, chociaż zakłada się, że metody te można dostosować do innych typów bibliotek. Korzystając z tej technologii, z powodzeniem wybrano Fabs o niskim powinowactwie nanomolowym do małych, znakowanych domen białkowych, w tym domen czynnika transkrypcyjnego, domen SH2, białek wiążących RNA i innych, z których wiele wiąże białko o pełnej długości i jest funkcjonalnych w testach immunologicznych, takich jak immunofluorescencja, immunoprecypitacja i immunohistochemia. Co ważne, rekombinowane klony wiążące są w pełni odnawialne i mogą być ponownie generowane z konstruktów ekspresyjnych poprzez produkcję bakteryjną, oferując zwiększoną spójność, odtwarzalność i opłacalność, co uzasadnia koszt rygorystycznej walidacji klonów.

W tym protokole i towarzyszącym mu filmie pokazane są podstawowe metody selekcji przeciwciał z bibliotek wyświetlanych przez fagi przy użyciu unieruchomionych domen antygenowych. Ta szczególna metoda wykorzystuje domeny białkowe znakowane GST unieruchomione przez pasywną adsorpcję w płytkach mikrodołkowych, chociaż z powodzeniem zastosowano również inne znaczniki11,12,13 i formaty selekcyjne13,14,2. Szczegółowo omówiono krytyczne kwestie dotyczące konfiguracji i przeprowadzania selekcji z równoległym monitorowaniem parametrów selekcji mającym na celu identyfikację i wyizolowanie specyficznie wzbogaconych przeciwciał klonalnych w celu walidacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja antygenu

UWAGA: Domeny antygenowe mogą być syntetyzowane i klonowane przez różnych komercyjnych dostawców do odpowiedniego konstruktu wyrażeń indukowanych przez IPTG.

  1. Przekształć konstrukty ekspresyjne w chemicznie kompetentne, odporne na T1-fagi komórki BL21 E. coli, mieszając 10 ng kodującego DNA w 20 μl 1X KCM na lodzie na 96-dołkowej płytce PCR, a następnie dodając 20 l chemicznie kompetentnych komórek.
  2. Inkubować mieszaninę komórka/DNA na lodzie przez 20 minut, w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ponownie na lodzie przez 2 minuty, a następnie uratować za pomocą 100 μl wstępnie podgrzanego, super optymalnego bulionu z pożywką glukozową (SOC), przykryć oddychającą uszczelką płytkową i wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm.
  3. Umieść 5 μl przekształconych komórek na płytkach Luria-Bertani (LB)/agar uzupełnionych karbenicyliną (100 g / ml) i hoduj O/N w celu uzyskania pojedynczych kolonii używanych do wytwarzania zapasów glicerolu.
  4. Zaszczepić 1 ml pożywki 2YT/carb 5 μl glicerolu i rosnąć przez 12 godzin w temperaturze 37 °C w 96-dołkowym bloku głębokim z wytrząsaniem przy 200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm.
  5. Zaszczepić pożywkę NZY15 (uzupełnioną 0,05% glukozy, 2% laktozy i 100 g/ml karbenicyliny) rozcieńczeniem tej kultury w stosunku 1:40, a następnie wstrząsać przez 6-8 godzin w temperaturze 30 °C i 200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm.
  6. Osadzanie bakterii i oczyszczanie białek antygenowych w wysokiej przepustowości na 96-dołkowej płytce filtracyjnej zawierającej 100 μl żywicy Ni-NTA zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami16,17.
  7. Oznaczyć stężenie oczyszczonych białek za pomocą testu wiązania barwnika Bradforda18 i scharakteryzować wielkość i czystość poprzez separację i wizualizację 10-50 μg barwienia Coomassie na żelu stronicowym SDS (patrz rysunek 2).
    UWAGA: Na tym etapie białka można dalej scharakteryzować za pomocą metod, które oceniają agregację białek19 lub fałdowanie20 w zależności od charakteru antygenu i wymagań procesu selekcji.

2. Przygotowanie i miareczkowanie biblioteki fagów

  1. Pobrać pojedynczą kolonię komórek E. coli odpornych na fagi T1 do 1 ml pożywki 2YT uzupełnionej 50 μg/ml tetracykliny.
  2. Po wizualnym ustaleniu wzrostu komórek należy rozcieńczyć kulturę w większej objętości 2YT uzupełnionej 50 μg/ml tetracykliny, aby zapewnić wystarczającą objętość komórek do infekcji (zwykle 45 μl na rozcieńczenie biblioteki, patrz poniżej).
  3. Przygotuj bibliotekę do użycia, wytrącając faga z buforu magazynowego z 1/5 objętości autoklawowanego 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) inkubując na lodzie przez 30 minut i granulując wytrącony przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wytrącony w odpowiedniej objętości 1x PBS pH 7,4, 0,2% BSA i 0,05% Tween (PBT), dostosowując do odpowiedniego stężenia faga dla selekcji (jeśli to konieczne), aby zapewnić odpowiednie pokrycie biblioteki. Zobacz Krok 2.9 i dyskusję.
  5. Rozcieńczyć 5 μl podwielokrotności faga w 45 μl 1x PBS pH 7,4 na sterylnej płytce wielodołkowej, wymieszać i utworzyć serię 10-krotnych rozcieńczeń w tym samym buforze.
  6. Dodać 5 μl każdego rozcieńczenia faga do 45 μl komórek E. coli odpornych na fagi T1 we wzroście w fazie logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,8) na innej płytce wielodołkowej, przykryć oddychającą uszczelką i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 30 minut w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm.
  7. Umieścić 5 μl zakażonych komórek z każdej studzienki na wstępnie podgrzanej płytce agarowej uzupełnionej 100 g/ml karbenicyliny i hodować O/N w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania widocznych kolonii.
  8. Obliczyć całkowity/ml w następujący sposób:
    /ml = liczba kolonii na płytce karbenicyliny w najbardziej rozcieńczonej próbce x 200 x 10i (gdzie i = maksymalna liczba rozcieńczeń, w których widoczne są kolonie).
  9. Aby określić liczbę powlekanych studzienek antygenowych w celu zapewnienia pokrycia różnorodności biblioteki, oblicz w następujący sposób:
    Wymagana liczba powlekanych studzienek antygenowych =
    Pożądane pokrycie zagięcia * różnorodność biblioteki
    # faga na 100 μl

3. Wybór przeciwciał z bibliotek wyświetlanych przez fagi

3.1) Unieruchomienie antygenu

  1. Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą wpływać na jakość antygenu i ułatwić rozcieńczanie, należy przygotować podstawową płytkę białkową antygenu znormalizowaną do 100-krotnych stężeń roboczych (np. 500 g / ml) i podwielokrotnić do niewiążących płytek 96-dołkowych.
  2. Przygotować płytki pokryte antygenem z podstawowych roztworów białkowych na jeden dzień przed każdą rundą selekcji, rozcieńczając je z płytek podstawowych PBS.
  3. Pokryj 96-dołkowe płytki polistyrenowe o wysokim poziomie wiązania białka 100 μl białka antygenowego znakowanego GST lub ujemnego białka kontrolnego (GST, BSA, neutrawaryna itp.) w stężeniu 5 μg/ml w PBS. Wstrząsnąć przy 250 obr./min w temperaturze 4 °C O/N na wytrząsarce do mikropłytek.
  4. Usunąć roztwór białkowy z powlekanych mikropłytek, zablokować płytki pokryte antygenem i ujemną selekcją 200 μl buforu blokującego (0,2% BSA w 1x PBS pH 7,4) i wstrząsać z prędkością 250 obr./min w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny.
  5. Po zablokowaniu należy czterokrotnie umyć zablokowane płytki pokryte białkiem 200 μl 1x PBS pH 7,4 z 0,05% buforem Tween (PT) ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do mikropłytek.

3.2) Wstępne oczyszczanie biblioteki i inkubacja antygenu fagowego

  1. Zubożyć bibliotekę klonów fragmentów przeciwciał wyświetlanych z niespecyficznymi (lub znacznikami) wiążącymi fagiami poprzez przeniesienie 100 μl (1012 fagów) przygotowanej biblioteki fagów w buforze PBT do liczby studzienek pokrytych ujemnym białkiem kontrolnym lub białkiem znacznika wolnego powinowactwa (np. GST) odpowiadającym liczbie celów i inkubować fagi w studzienkach przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    UWAGA: Jako alternatywny lub dodatkowy sposób selekcji negatywnej, inkubacja może być również przeprowadzana w obecności nadmiaru (5-25 μM) rozpuszczalnego znacznika powinowactwa do białek (np. GST) w celu dalszego usunięcia klonów wiążących znaczniki i zwiększenia odzysku określonych klonów wiążących cel.
  2. Przenieść supernatant fagowy z selekcji negatywnej na płytki pokryte antygenem i inkubować przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 250 obr./min w celu wychwycenia specyficznych klonów wiążących.
  3. Usunąć niezwiązany i przemyć studzienki mikropłytki 8-15 razy buforem PT ręcznie lub za pomocą myjki do mikropłytek. Usuń nadmiar buforu płuczącego tuż przed elucją.

3.3) Elucja, infekcja i amplifikacja fagów

  1. Wcześnie w dniu selekcji należy pobrać pojedynczą kolonię komórek E. coli odpornych na fagi T1 do 1 ml pożywki 2YT uzupełnionej 50 μg/ml tetracykliny i hodować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm lub równoważnej.
  2. Po ustaleniu wzrostu komórek i zobaczeniu go gołym okiem, zwiększ objętość pożywki za pomocą 2YT uzupełnionego 50 ug/ml tetracykliny, aby zapewnić wystarczającą objętość komórek do infekcji (zwykle 100 μl na studnię selekcyjną).
  3. Hodować komórki do osiągnięcia OD600 0,4–0,8 (około 5-7 godzin), a następnie, aby wymyć związany, dodać 100 μl komórek do umytej płytki antygenowej i wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Dodać faga pomocniczego M13K07 do końcowego stężenia 1 x10 10 jtk/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  5. Przenieść komórki do 1,2 ml 2YT uzupełnionego 150 μg/ml karbenicyliny i 75 μg/ml kanamycyny w 96-dołkowym bloku studni głębinowej z dnem V i hodować O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej o średnicy 2,5 cm.

3.4) Przygotowanie fagów i powtarzające się rundy selekcji

  1. Bakterie osadkowe przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Wymieszać równe objętości supernatantów fagowych z powtórzonych płytek w mini-probówce 96-dołkowej sterylnej niebieskiej płytki do mikropłytek, zneutralizować 1/10 objętości 10X PBT i wymieszać. Powtórzyć rundy selekcji (zaczynając od kroku 3.1.1) przez 3-4 rundy lub do momentu zaobserwowania wzbogacenia (patrz punkty 4 i 7.) w porównaniu z białkiem kontroli ujemnej.
    UWAGA: We wczesnych rundach selekcji, gdy nie oczekuje się znaczącego/wykrywalnego wzbogacenia (tj. rundy 1 i 2), kwantyfikacja mian wejściowych i wyjściowych fagów (opisana w sekcji 7 i reprezentatywne wyniki pokazane na rysunku 3) może być pomocna w zapewnieniu minimalnych stężeń fagów dla udanej selekcji (opisanej w Dyskusji) i jest bardziej odpowiednia niż zbiorcze testy ELISA.

4. Charakterystyka za pomocą testu ELISA w puli

  1. Pokryć 96-dołkowe płytki polistyrenowe o wysokim stopniu wiązania białka 100 μl białka antygenowego znakowanego GST lub ujemnego białka kontrolnego (GST, BSA, neutrawarydyna itp.) w stężeniu 2 μg/ml zgodnie z sekcją 3.1 i wstrząsnąć w temperaturze 4 °C O/N.
  2. Usunąć nadmiar antygenu, zablokować płytkę 200 μl buforu blokującego z wytrząsaniem przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej przy 250 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek i przemyć czterokrotnie buforem PT o objętości 200 μl, ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płytek.
  3. Nałożyć 100 μl supernatantu fagowego (rozcieńczonego w stosunku 1:10-1:20 w buforze PBT), wstrząsać z prędkością 250 obr./min przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć płytkę osiem razy buforem PT o objętości 200 μl.
  4. Dodać 100 μl anty-M13-HRP (1:5 000 w buforze PBT). Wytrząsać z prędkością 200 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyć płytkę sześciokrotnie 200 μl buforu PT i dwukrotnie 200 μl PBS.
  5. Nałożyć 100 μl podłoża TMB w proporcji 1:1 i rozwijać przez 5–15 minut (lub do momentu uzyskania znacznego koloru), następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 100 μl 1 M H3PO4 i odczytać płytkę przy 450 nm.
  6. Ogólnie rzecz biorąc, wzbogacenie w pulach fagowych można zaobserwować w rundach 3–4 jako stosunek wiązania swoistego do niespecyficznego wiązania >2 (patrz ryc. 4)
    UWAGA: Warto zauważyć, że wysoki bezwzględny sygnał wiązania na białku znacznika powinowactwa wskazuje na wzbogacenie spoiw specyficznych dla znacznika (a nie docelowych wiążących), a wysoki bezwzględny sygnał wiązania na białku kontroli ujemnej wskazuje na wzbogacenie niespecyficznych lub "lepkich" spoiw
    7. .

5. Selekcja, sekwencjonowanie i charakterystyka klonów

5.1) Izolacja pojedynczych klonów Fab-fagów

  1. W celu wyizolowania pojedynczych klonów do sekwencjonowania i charakterystyki, należy zainfekować 1/10objętości amplifikowanej puli fagowej do opornych na fagi komórek E. coli odpornych na fagi T1 w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 = 0,4-0,8) na okrągłodennej płytce do mikromiareczkowania, przykryć oddychającą płytką i inkubować z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia w pożywce 2YT i rozłożyć na płytkach na oddzielnych płytkach agarowych uzupełnionych 100 g/ml karbenicyliny.
  3. Pobrać pojedyncze kolonie w 450 μl pożywki 2YT/carb uzupełnionej fagiem 1 x 109 M13K07/ml i hodować O/N w mini-probówce 96-dołkowej sterylnej mikropłytki niebieskiej inkubowanej w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  4. Bakterie osadkowe przez wirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Supernatant klonalny fagowy może być stosowany do sekwencjonowania klonów Fab-phage (zgodnie z opisem w sekcji 5.4) lub do bezpośrednich wiążących klonów testów ELISA w celu określenia swoistości wobec unieruchomionych antygenów (zgodnie z opisem w sekcjach 5.3 i 21), dla których reprezentatywne wyniki przedstawiono na rycinie 5.

5.2) Wyrażenie klonów Fab do charakteryzacji

  1. Po sklonowaniu do odpowiedniego wektora ekspresji (patrz Dyskusja), należy pobrać pojedyncze kolonie E. coli przekształcone za pomocą konstruktów ekspresyjnych w 1 ml pożywki 2YT/carb na 96-dołkowej płytce z głęboką dowartością za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety i rosnąć przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Można to zrobić ręcznie lub za pomocą automatycznego zbieracza kolonii.
  2. Przenieś 40 μl kultury hodowlanej do 1,5 ml pożywki NZY uzupełnionej glukozą/laktozą/glicerolem w 96-dołkowym bloku studni głębokiej zgodnie z metodologią Studier i wsp.15
    UWAGA: Alternatywnie, komórki mogą być hodowane przez 3-4 godziny (OD 0,8-1,0) w niesuplementowanej ekspresji białka indukowanej przez dodanie 1 mM IPTG.
  3. Przykryj blok(i) hodowli oddychającą uszczelką i odciągaj klony Fab przez 6-8 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Obracać płytki o wymiarach 4 000 x g przez 15 minut, aby osadzać komórki bakteryjne, usunąć supernatant, przykryć płytki uszczelką foliową i zamrozić granulki w temperaturze -20 °C do czasu lizy.
  4. Uwolnić wyrażone Fabs z zebranych osadów za pomocą 100 μl buforu do lizy (Tris HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 z 1 mg/ml lizozymu i 10 U benzonazy/ml kultury i inhibitorów proteazy) i wytrząsać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać surowy supernatant lizatu do wykorzystania we wstępnej charakterystyce specyficzności za pomocą płytek ELISA (patrz sekcja 5.3).

5.3) Charakterystyka klonu za pomocą bezpośredniego wiązania Clonal Fab ELISA

  1. Unieruchomić antygeny zgodnie z opisem w sekcji 3.1, zamiast tego podając 30 μl antygenu 2 μg/ml w PBS do studzienek na płytce 384-dołkowej. Poczwórne układy antygenów w płytce mogą ułatwić przenoszenie odczynników przy użyciu 96-kanałowych głowic dozujących. Umyć i zablokować płytki ELISA zgodnie z sekcją 3.1.
  2. Oczyszczone lizaty pobrane z sekcji 5.2 mogą być naniesione bezpośrednio na unieruchomiony antygen w celu oceny wiązania. Inkubować 30 μl lizatu na studzienkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    UWAGA: Oczyszczone białko klonu Fab można stosować naprzemiennie, rozcieńczając do 10 μg/ml w buforze PBT i nakładając 30 μl każdego klonu do zablokowanych studzienek zawierających antygen lub ujemne białko kontrolne (GST, BSA itp.) i rozwijając się w taki sam sposób, jak opisano poniżej. Alternatywnie, Fab-phage można również stosować poprzez rozcieńczenie 10 μl supernatantu fagowego (opisanego w sekcji 5.1) w 20 μl buforu PBT (1:3) i wykrycie za pomocą przeciwciał anty-M13-HRP (opisane w krokach 4.4 - 4.5)
  3. Usunąć nadmiar lizatu i przepłukać studzienki ręcznie lub za pomocą automatycznej płytki przepłukanej 8x 100 μl buforu PT i usunąć nadmiar buforu.
  4. Inkubować 30 μl rozcieńczonego w stosunku 1:5 000 drugorzędowego przeciwciała anty-FLAG w buforze PBT przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  5. Przemyć, rozwinąć i określić ilościowo zgodnie z sekcjami 4.3 – 4.5.
    UWAGA: Reprezentatywne wyniki ilustrujące zarówno specyficzne, jak i niespecyficzne klony wiążące przedstawiono na rysunku 5.

5.4) Sekwencjonowanie klonów

  1. Przygotować główną mieszankę PCR, jak wskazano w tabeli 2.
  2. Dodać 2 μl odpowiedniej matrycy do PCR (supernatant fagowy lub ponownie zawieszona kolonia bakteryjna zawierająca pojedynczy fagi) do 20 μl głównej mieszaniny PCR przygotowanej z odpowiednimi starterami w studzienkach płytki PCR.
    UWAGA: Do sekwencjonowania zarówno genów łańcuchów ciężkich, jak i lekkich wymagane są oddzielne mieszanki główne.
  3. Uruchom reakcję PCR, korzystając z parametrów wymienionych w Tabeli 2 – Ustawienia PCR.
  4. Sprawdź powodzenie reakcji PCR, mieszając 5 μl zakończonej reakcji z barwnikiem ładującym na 1% żelu agarozowym, uzupełnionym barwnikiem wizualizacyjnym DNA i obrazowaniem na transiluminatorze 300 nm.
  5. Dodać 2 μl produktu PCR do 10 μl sterylnej wody zawierającej po 0,2 μl egzonukleazy i fosfatazy alkalicznej krewetek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie inaktywować enzymy w temperaturze 80 °C przez 10 minut w celu usunięcia nadmiaru starterów w ramach przygotowań do sekwencjonowania.

6. Skalowanie dla automatycznych wyborów

6.1) Obsługa cieczy za pomocą pipet

  1. Przygotuj 1% (w/v) błękit bromofenolowy w wodzie i usuń nierozpuszczalne cząstki za pomocą filtra o pojemności 0,45 ml.
  2. Aby określić liniowy zakres absorbancji na czytniku płytek, należy przygotować rozcieńczenie 1% błękitu bromofenolowego w wodzie w stosunku 1:1 000 i kontynuować dwukrotne seryjne rozcieńczenia (łącznie 16 rozcieńczeń).
  3. Przenieść 100 μl każdego rozcieńczenia na płaską płytkę 96-dołkową i odczytać absorbancję przy 590 nm. Wykreślić absorbancję bezwzględną w funkcji współczynnika rozcieńczenia i wybrać rozcieńczenie na środkowym lub górnym końcu zakresu liniowego dla kolejnych badań.
  4. Dodać błękit bromofenolowy do wody lub do roztworu, który będzie pipetowany na podstawie rozcieńczenia wybranego w poprzednim kroku, w objętości wystarczającej do pipetowania do trzech 96-dołkowych płytek plus martwa objętość w zbiorniku.
  5. Skalibruj pipetor jednokanałowy, aby dostarczyć objętość testową, pipetując wodę na wagę analityczną (100 μl wody waży 100 mg w temperaturze pokojowej).
  6. Używając skalibrowanego pipetora, przenieść objętość badawczą barwionego roztworu do co najmniej trzech dołków płaskiej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i odczytać ich absorbancję przy 590 nm, w trzech powtórzeniach.
  7. Zważyć trzy puste płaskodenne płytki 96-dołkowe na wadze analitycznej i zanotować ich masę.
  8. Pobrać pipetę z objętości testowej ze zbiornika do każdej z trzech płytek 96-dołkowych i zmierzyć ich absorbancję przy 590 nm, w trzech egzemplarzach.
  9. Zważ każdą płytkę i oblicz różnicę masy.
  10. Po pierwsze, należy ocenić, czy absorbancja w każdym studzience jest jednorodna w zakresie tolerancji (np. +/- 5%) i czy są zgodne z absorbancjami uzyskanymi przez pipetowanie ręczne za pomocą skalibrowanego pipetmana. Jeśli poszczególne kanały są stale dostarczane za dużo lub za mało (na przykład patrz rysunek 6), postępuj zgodnie z procedurami naprawy i powtarzaj procedurę oceny, aż wszystkie kanały dostarczą jednakowe głośności.
  11. Po drugie, gdy potwierdzimy, że wszystkie kanały dostarczają jednolite objętości, sprawdź dokładność tej objętości, obliczając średnią różnicę masy na studzienkę. Na przykład idealnie skalibrowany zestaw do obsługi cieczy na 100 μl dostarczy 9,60 g wody na talerz lub 0,10 g wody na studzienkę. Jeśli rzeczywista dostarczona objętość jest stale wyższa lub niższa od zamierzonej objętości, można zastosować współczynnik korygujący, tj. zaprogramować 110 μl, aby faktycznie dostarczyć 100 μl.
    UWAGA: W przypadku małych objętości, np. 10 μl, należy użyć dziesięciokrotnie więcej błękitu bromofenolowego w barwionym roztworze i ręcznie podwielokrotnić 90 μl wody na 96 płytek dołkowych, aby upewnić się, że absorbancje są mierzalne i mieszczą się w zakresie liniowym.

6.2) Automatyczne mycie płyt

  1. Unieruchomić dodatnie białka docelowe i ujemne białka kontrolne w oddzielnych studzienkach składających się z 96 mikropłytek (dwie płytki dla każdego badanego stanu), jak opisano w sekcji 3.1.
  2. Blokować niespecyficzne miejsca wiązania przez inkubację z roztworem blokującym przez jedną godzinę w RT.
  3. Dodać identyczne 100 μl podwielokrotności 1013 jtk/ml wiążącego cel roztworu Fab-fagowego w PBT do wszystkich studzienek na wszystkich płytkach i inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  4. Umyć dwie płytki w zależności od każdego stanu, jedną płytkę do zakażenia i miareczkowania oraz jedną płytkę do testu ELISA.
  5. Ocenić skuteczność płukania poprzez bezpośrednie zakażenie bakteriami i miareczkowanie (jak opisano w sekcji 3.3 (bez dodatku M13K07) i 7.2.1) lub opracowanie za pomocą przeciwciała anty-M13 HRP i substratu kolorymetrycznego (jak opisano w sekcji 4).
  6. Miana fagów z określonych klonów często dają w zakresie 10,5–10, 7 fagów/ml z unieruchomionego białka, z którym klon wiąże się specyficznie. Należy spodziewać się pewnego szczątkowego wiązania z białkiem kontroli ujemnej (np. BSA) i na ogół obserwuje się 102-10 5 fagów/ml, jednak bardzo niskie miana (tj. <101) mogą sygnalizować zbyt rygorystyczne mycie, co może zagrozić selekcji.
  7. W przypadku wiązania fagów określonych metodą ELISA należy porównać bezwzględne sygnały wiązania dla dodatnich i ujemnych białek kontrolnych, aby określić, czy mycie robotem jest równoważne z ustalonymi wynikami mycia rąk (ryc. 7).

6.3) Dekontaminacja myjki do płyt

  1. Aby rozpocząć, uruchom protokół dekontaminacji, który ma zostać przetestowany.
    UWAGA: Zalecamy użycie co najmniej podwójnej całkowitej objętości linii oraz zalanie i namoczenie głowicy pralki przez 5 minut w 0.5% podchlorynu sodu, świeżo rozcieńczonym z dostępnego w handlu wybielacza (zwykle 6% podchlorynu sodu).
  2. Zalać i namocz głowicę pralki na 5 minut w sterylnej (autoklawowanej) wodzie, a na koniec zalej system, aż przewody będą pełne powietrza.
  3. Zalać linie sterylną wodą lub buforem do mycia.
  4. Umyj sterylną 96-dołkową mikropłytkę raz, wyjmij ją z pralki i zamknij sterylną uszczelką płytki. To jest płyta kontrolna przed zanieczyszczeniem.
  5. Podwielokrotność 100 μl supernatantu z amplifikowaną kulturą fagową O/N do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej.
  6. Umyj płytkę zawierającą raz, a następnie wyjmij ją z myjki i uszczelnij plastikową lub foliową uszczelką płytkową. To jest tabliczka kontrolująca zanieczyszczenia.
  7. Postępuj zgodnie z testowanym protokołem dekontaminacji. W tym przykładzie powtórz kroki 6.3.1 i 6.3.2.
  8. Umyj sterylną mikropłytkę raz, a następnie wyjmij ją z myjki i uszczelnij. To jest płytka testowa do dekontaminacji.
  9. Płytka 50 μl E. coli w fazie logarytmicznej do płytki miareczkowej; jest to płytka kontrolna przed zakażeniem.
  10. Rozszczelnić 96-dołkowe płytki do wstępnego zanieczyszczenia, zanieczyszczenia i odkażania i dodać 100 μl E. coli w fazie wzrostu logarytmicznego do wszystkich studzienek, używając nowych końcówek dla każdej studzienki.
  11. Uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 200 obr./min.
  12. Umieścić 50 μl zakażonych komórek z trzech losowych dołków każdej płytki 96-dołkowej na 10 cm płytkach 2YT/carb i inkubować w temperaturze 37 °C O/N.
  13. Przenieść 50 μl zakażonych komórek ze wszystkich studzienek każdej płytki do płytek głębokich zawierających 1 ml 2YT plus 100 g/ml karbenicyliny na studzienkę i hodować O/N w temperaturze 37 °C.
  14. Powtórz protokół odkażania i pozostaw przewody myjki suche.
    UWAGA: Nie należy obserwować wzrostu O/N na płytkach lub w płynnym podłożu na płytkach do kontroli przed infekcją, kontroli przed zanieczyszczeniem lub dekontaminacji. Na płytce do kontroli zanieczyszczeń należy obserwować wiele kolonii i wzrost; W przeciwnym razie nie można wyciągnąć żadnych wniosków na temat skuteczności protokołu dekontaminacji. Idealnie byłoby, gdyby płyty dekontaminacyjne nie powodowały tworzenia kolonii i wzrostu O/N w żadnej ze studzienek w płytach O/N. Rygorystyczność protokołu dekontaminacji można zwiększyć dzięki wyższym stężeniom wybielacza, dłuższemu czasowi namaczania i dodatkowym cyklom.

7. Miareczkowanie wejść/wyjść

7.1) Miareczkowanie fagów wejściowych

  1. Rozcieńczyć 5 μl podwielokrotności faga do 50 μl sterylnie przefiltrowanym PBS i wymieszać.
  2. Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenie w sterylnie przefiltrowanym PBS do 10:10 za pomocą pipety wielokanałowej lub pipetora 96-kanałowego.
  3. Inokulować 5 μl rozcieńczonego faga do 45 μl komórek E. coli odpornych na fagi T1 w logarytmicznej fazie wzrostu (OD 0,6-0,8) i inkubować pod przykrytą oddychającą uszczelką przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Umieścić 5 μl zakażonych komórek na płytce LB/agar uzupełnionej 100 μg/ml karbenicyliny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  5. Stężenie faga można oszacować na podstawie najbardziej rozcieńczonej próbki, w której pojawiają się kolonie, zgodnie z obliczeniami opisanymi w sekcji 2.8.

7.2) Pitracje fagów wyjściowych

  1. Po elucji faga związanego z płytką przez dodanie komórek E. coli, rozcieńczyć 5 μl podwielokrotności komórek zakażonych fagami do 50 μl za pomocą autoklawowanej pożywki 2YT
  2. Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenie w autoklawowanych pożywkach 2YT do 10:6 za pomocą pipety wielokanałowej lub pipetora 96-kanałowego.
  3. Umieścić 5 μl zakażonych komórek na płytce agarowej uzupełnionej 100 μg/ml karbenicyliny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  4. Stężenie fagów można oszacować na podstawie najbardziej rozcieńczonej próbki, w której występują kolonie, zgodnie z obliczeniami szczegółowo opisanymi w sekcji 2.8.
    UWAGA: W obu przypadkach (tj. wejściowych i wyjściowych mian fagów), porównanie z liczebnością kolonii zarówno dla tetracykliny (całkowita liczba komórek), jak i kanamycyny (miano faga pomocniczego) może być również pouczające.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany tutaj został użyty do równoległego izolowania fragmentów przeciwciał do różnych strukturalnie i funkcjonalnie powiązanych domen antygenowych z kombinatorycznych bibliotek Fab wyświetlanych na fagach. Problemy związane z dostępnością antygenu można w wielu przypadkach obejść poprzez identyfikację in silico wyrażalnych domen antygenu, które są odpowiednie do selekcji przeciwciał23. Poprzez sprzężenie ekspresji antygenu z selekcją przeciwciał w tym samym laboratorium (ryc. 1) moż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas przeprowadzania selekcji przeciwciał in vitro , dwoma głównymi determinantami sukcesu selekcji są: 1) izolacja dobrze sfałdowanych celów antygenowych do selekcji oraz 2) dostępność biblioteki przeciwciał o wysokiej różnorodności funkcjonalnej. W wielu przypadkach dostępność wystarczających ilości dobrze sfałdowanego białka o pełnej długości może być ograniczona. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest wykorzystanie domen zidentyfikowanych na podstawie analizy bioinformatycznej22

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować NIH Common Fund – Protein Capture Reagents Program za sfinansowanie rozwoju linii selekcji i charakterystyki przeciwciał Recombinant Antibody Network oraz Canadian Foundation for Innovation za sfinansowanie zakupu platformy selekcji robotów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MATERIAŁY
Nowy Brunszwik Wytrząsarka inkubatorowa Innova44EppendorfM1282-0004
Liquidator 96-kanałowy ręczny system pipetowania stołowegoAnachem LtdLIQ-96-200
Wytrząsarka do mikropłytekVWR12620-926
ThermoScientific Wirówka stołowa Sorvall ST-40Thermo Product
ELx405 Select Deep Well Microplate WasherBiotekELX405USD
Niestandardowy zautomatyzowany robot do wyboru fagów o wysokiej przepustowościS& P Robotics
Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 50 mlVWR21008-178
Plastikowa stożkowa probówka Falcon: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1,7 ml probówki do mikrowirówekCorningMCT-175-L-C
96-dołkowa/384-dołkowa płytka MaxisorpSigmaM9410-1CS
Corning 96-dołkowy blok głębinowy z dnem w kształcie litery VCorning3960
Axygen Mini-tubka 96-dołkowa sterylna mikropłytka niebieskie pudełkoCorningAXY-MTS-06-C-R-S
Oddychająca samoprzylepna folia uszczelniająca do płytekVWR60941-084
ODCZYNNIKI
NazwaFirmaNumer
glikol polietylenowyBioshop PEG800.1
ekstraktdrożdżowy BioshopYEX401.1
bio-tryptonBioshopTRP402.1
N-Z aminaSigmaC7290
glukozaSigmaG8270-1KG
laktozaBioshopLAC234
glicerolBioshopGLY001.500
karbenicylina BioshopCAR544.10
kanamycynaBioshopKAN201.25
tetracyklina BioshopTET701.25
Tween 20BioshopTWN510.500
monozasadowy fosforan potasuBioshopPPM302.1
dwuzasadowy fosforan soduAnachemia84486-440
chlorek soduBioshopSOD001.10
chlorek potasuBioshopPOC308.1
chlorek wapniaBioshopCCL302.500
siarczan magnezuEMDMX0070-1
chlorek magnezuBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe Barwnik żelowy DNAInvitrogenS33102
kwas fosforowyAcros Organics201140010
lizozymBioshopLYS702.25
benzonazaNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
inhibitorów proteazy tabletkiRoche11 836 170 001
Żywica Ni-NTA Qiagen1018240
1,000x pomocniczy (M13K07) zapas (1013 faga na ml)NEBN0315S
specyficzne dla M13 (anty-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
Substrat TMB: wymieszaj równe objętości TMB i sub2O2 sub KPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Polimeraza TaqGenscriptE00007
EgzonukleazaGE Healthcare EZ0073X-EZ
Fosfataza alkaliczna z krewetkamiGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525katalogowy koktajl HRP sprzężone przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254(2007).
  4. Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
  5. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
  6. Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
  7. Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
  8. Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
  9. Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
  10. Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
  11. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
  12. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  13. Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
  14. Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
  16. Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
  17. McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
  18. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  19. den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
  20. Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
  21. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
  22. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
  23. Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
  24. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
  25. Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Display fagowyselekcja przeciwciabiblioteki syntetycznefagi Fabunieruchamianie antygenuselekcja r wnoleg arobot do pipetowaniaautomatyzacja robotycznawalidacja metod ELISA

Powiązane artykuły