Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Summary

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO₂ pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Abstract

Dwuwarstwowe błony lipidowe tworzą błony plazmatyczne komórek i wyznaczają granice organelli subkomórkowych. W naturze błony te są niejednorodnymi mieszaninami wielu rodzajów lipidów, zawierają białka związane z błoną i są ozdobione węglowodanami. W niektórych eksperymentach pożądane jest oddzielenie właściwości biofizycznych lub biochemicznych dwuwarstwy lipidowej od właściwości naturalnej błony. Takie przypadki wymagają zastosowania systemów modelowych, takich jak gigantyczne pęcherzyki, liposomy lub podparte dwuwarstwy lipidowe (SLB). Matryce SLB są szczególnie atrakcyjne do zastosowań detekcyjnych i naśladowania interakcji komórka-komórka. W tym miejscu opisujemy nową metodę tworzenia tablic SLB. Kulki SiO₂ o średnicy submikronowej są najpierw powlekane dwuwarstwami lipidowymi, tworząc kuliste SLB (SSLB). Kulki są następnie umieszczane w szeregu mikrostudzienek o średnicy submikronowej. Technika przygotowania wykorzystuje "ściągaczkę" do czyszczenia powierzchni podłoża, pozostawiając jednocześnie SSLB, które osiadły w mikrostudzienkach. Metoda ta nie wymaga modyfikacji chemicznej substratu mikrostudzienki ani żadnych szczególnych ligandów docelowych na SSLB. Mikrostudzienki są zajęte przez pojedyncze koraliki, ponieważ średnica studzienki jest dostrojona tak, aby była nieco większa niż średnica koralików. Zazwyczaj ponad 75% studni jest zajętych, podczas gdy reszta pozostaje pusta. W buforze tablice SSLB wykazują długoterminową stabilność większą niż jeden tydzień. Wiele typów SSLB można umieścić w jednej macierzy przez osadzanie szeregowe, a tablice mogą być używane do wykrywania, co demonstrujemy, charakteryzując interakcję toksyny z gangliozydem GM1. Pokazujemy również, że pęcherzyki fosfolipidowe bez podpór kulek i błony biologiczne ze źródeł komórkowych można ułożyć w układ tą samą metodą i można zidentyfikować lipidy błonowe specyficzne dla komórki.

Introduction

Dwuwarstwowe błony lipidowe są niezbędnymi strukturami w przyrodzie. Komórkowe błony plazmatyczne i błony organelli składają się z dwuwarstw lipidowych, które zawierają szereg cząsteczek niezbędnych do życia. Wiele procesów podtrzymujących życie zachodzi na powierzchni komórek lub jest zapośredniczonych przez cząsteczki związane z błonami dwuwarstwowymi lipidów. W rzeczywistości wiele farmaceutyków ukierunkowanych na procesy lub cząsteczki znajdują się na błonach lub w błonach^1,2. Dlatego konieczne jest analityczne badanie procesów, takich jak reakcje chemiczne lub niekowalencyjne wiązania, które zachodzą na powierzchniach membrany. Ponieważ naturalne membrany mogą być trudne do odizolowania i/lub współpracy z czujnikami, wielu badaczy wykorzystuje uproszczone membrany modelowe do przeprowadzania badań analitycznych. W literaturze opisano szereg modelowych systemów membranowych, począwszy od gigantycznych pęcherzyków, które mogą mieć średnicę od dziesiątek do setek mikronów, po liposomy o wymiarach^{w skali nano 3,4}. Alternatywnie, płaskie dwuwarstwy lipidowe osadzone na stałych podłożach, tj. podparte dwuwarstwy lipidowe (SLB), mogą być tworzone na wielu różnych powierzchniach i są szeroko stosowane w zastosowaniach biofizycznych, biochemicznych i analitycznych⁵. Sprzężenie SLB z materiałami elektrycznymi lub optycznymi umożliwia badanie biochemii i biofizyki błon dzięki zastosowaniu różnych technik analitycznych. Mikroskopia fluorescencyjna⁶, elektrochemia⁷, spektroskopia optyczna⁸, mikroskopia sondy skaningowej⁹, powierzchniowy rezonans plazmonowy¹⁰ i spektrometria mas¹¹ zostały wykorzystane do badania struktury i właściwości SLB.

Tablice SLB oferują dodatkową wszechstronność w projektowaniu czujników do testów multipleksowych^12,13. Inne aplikacje wykorzystują macierze SLB do naśladowania połączenia, które tworzy się między komórkami odpornościowymi¹⁴. Metody przygotowania macierzy SLB były różne, od podejść mikroprzepływowych¹⁵ do tych, które wykorzystują fizyczne bariery między sąsiednimi łatami SLB. ¹⁶ Inne grupy wykorzystały metody drukowania¹⁷, wzorce fotochemiczne¹⁸ i różne podejścia nanoinżynieryjne¹⁹ do stworzenia matryc SLB.

W tym artykule i towarzyszącym mu filmie demonstrujemy metodę tworzenia tablic SLB poprzez umieszczanie pokrytych SLB kulek SiO₂ w uporządkowanych układach mikrodołków²⁰. Kulki SiO₂ pokryte SLB nazywamy sferycznymi dwuwarstwami lipidowymi (SSLB). Technika ta jest rozszerzeniem wcześniejszych prac, w ramach których stworzono macierze pęcherzyków fosfolipidowych i błon biologicznych pochodzących ze źródeł naturalnych²¹, z których pokazujemy również przykładowe wyniki. Inne metody układania cząstek lub pęcherzyków błony biologicznej opierały się na wzorcach specyficznych ligandów docelowych na powierzchniach, które łączą się z komplementarnymi ligandami zawartymi na powierzchni pęcherzyka. Przykłady obejmują asocjację biotyny-awidyny^22,23 i schematy hybrydyzacji DNA²⁴. Nasze podejście wymaga jedynie macierzy mikrostudzienek bez konieczności celowania lub rozpoznawania. Rozmiar SSLB jest określony przez średnicę podpór kulkowych SiO₂, które mają niską polidyspersyjność. Dostrajając średnicę mikrostudzienki tak, aby była nieco większa niż średnica SSLB, tylko jeden SSLB osadza się w każdej mikrostudzience. Ściągaczka z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) usuwa następnie z powierzchni wszystkie SSLB, które nie są unieruchomione w mikrostudzienkach. Mikrostudzienki i wynikowe matryce SSLB mają wysoką gęstość (~10⁵ SSLB/mm²) z odstępami od środka do środka wynoszącymi 3 μm i okresowością heksagonalną. Poprzez szeregowe osadzanie SSLB o różnym składzie lipidowym, możliwe jest tworzenie wieloskładnikowych macierzy z losowo rozmieszczonymi SSLB. Aby zademonstrować zdolność wykrywania matryc SSLB, wykorzystaliśmy interakcję toksyny (CTx) z gangliozydem (GM1) wbudowanym w SSLB. Dzięki naturalnym cząsteczkom błony byliśmy w stanie wykryć lipidy specyficzne dla komórek w wieloskładnikowych macierzach zawierających materiał błonowy z dwóch różnych typów komórek.

Protocol

1. Mikrofabrykacja podłoża do tablicy Microwell

1. Zacznij od 4-calowej płytki krzemowej ze 100 nm termicznie wyhodowanego tlenku.
2. Wirować fotorezystem SPR-955 0,7 na płytce z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sek.
3. Piec na płycie grzewczej w temperaturze 115 °C przez 90 sekund.
4. Eksponuj fotorzyst.
   1. Użyj maski, która utworzy otwory o wielkości 1 μm ułożone w sześciokątny układ z okresem 3 μm, gdzie tablica obejmuje obszar o wymiarach 2 mm x 2 mm.
   2. Naświetl płytkę w stepperze i-line, używając kroku o wielkości 6 mm i ekspozycji 200 mJ/cm².
5. Piec na płycie grzewczej w temperaturze 115 °C przez 90 sekund.
6. Wywołaj za pomocą wywoływacza wirowego, aby umieścić 2 kałuże CD-26 na płytce krzemowej, co daje łączny czas wywoływania 90 sekund.
7. Dokładnie spłucz ultraczystą wodą DI i osusz N₂.
8. Wytrawiaj tlenek w wytrawiaczu jonów reaktywnych przez 6 minut z 50 sccm Ar, 25 sccm CF₄ i 50 sccm CHF₃ płynących pod ciśnieniem 75 mTorr.
9. Wytrawiaj krzem w wytrawiaczu jonowym ICP do głębokich rowów przez 2 minuty z 63 sccm C₄F₈, 27 sccm SF₆, 40 sccm Ar i 10 sccm O₂ płynących pod ciśnieniem 14 mTorr.
10. Spłucz acetonem, metanolem i izopropanolem, aby usunąć opór.
11. Umieścić w kąpieli o natężeniu H₂SO₄:H₂O₂ 1:1 na 10 min w celu oczyszczenia powierzchni.
12. Dokładnie spłucz ultraczystą wodą DI i osusz N₂.
13. Osadzanie 1,080 A z Al₂O₃ przez osadzanie warstw atomowych w temperaturze 250 °C.

2. Przygotowanie ściągaczki z poli(dimetylosiloksanu)

1. Jeśli to możliwe, pracuj w pomieszczeniu czystym. W przeciwnym razie pracuj w możliwie najczystszym środowisku.
2. Zaopatrz się w plastikową szalkę Petriego (lub inny czysty pojemnik jednorazowego użytku) o bokach ≥13 mm.
3. W tym naczyniu wlej 5 g utwardzacza PDMS, a następnie 50 g środka bazowego PDMS (lub czegokolwiek o proporcjach 1:10, co w większości wypełni szalkę Petriego). Dokładnie wymieszaj jednorazową plastikową pipetą lub prętem.
4. Usuń pęcherzyki, umieszczając zmieszany PDMS w komorze z linią próżniową, stosując próżnię, aż pęcherzyki wyjdą z mieszaniny (około 30 min).
5. Jeśli nie znajduje się jeszcze na szalce Petriego, wlej PDMS na szalkę Petriego, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
6. Utwardzać przez noc na płycie grzejnej w temperaturze >50 °C (działa również wyższa temperatura przez krótszy czas).
7. Za pomocą nowej/czystej żyletki ostrożnie przytnij prostokątny kawałek o wymiarach około 2.5 x 2.5 cm, utrzymując górną powierzchnię tak czystą, jak to możliwe. Usuń czystymi kleszczami. Odetnij jedną krawędź (do 1,5 cm), naciskając żyletkę jednym ruchem, aby górna krawędź była jak najbardziej ostra (będzie to krawędź używana w procesie ściągania).
8. Oczyść acetonem, metanolem, alkoholem izopropylowym i ultraczystą wodą DI, a następnie wysusz czystym azotem. Przechowywać na czystej szalce Petriego.

3. Przygotowanie pęcherzyków

1. Zebrać podstawowe roztwory lipidów zawierające 25 mg/ml fosfatydylocholiny jaj (PC) i 1 mg/ml soli 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisaminy, rodaminy, B-sulfonylo) amonowej (Rho-DPPE) w chloroformie oraz 0,5 mg/ml roztworu podstawowego monosialogangliozydu GM1 w chloroformie/metanolu (2:1 v/v).
2. W małej szklanej fiolce przygotuj mieszaninę, która daje 97% mol PC, 2 mol% GM1 i 1 mol% Rho-DPPE, dodając 18,9 μl 25 mg / ml PC, 39,6 μl 0,5 mg / ml GM1 i 7,9 μl 1 mg / ml Rho-DPPE za pomocą szklanych strzykawek.
3. Uwaga: Materiał uzupełniający dla Nair et al.²⁵ zawiera doskonały, konfigurowalny arkusz kalkulacyjny Excel do obliczania ilości lipidów potrzebnych do stworzenia pęcherzyków o dowolnym pożądanym składzie.
4. Umieścić fiolkę w eksykatorze próżniowym i usunąć rozpuszczalnik, pozostawiając fiolkę w próżni na 6 godzin.
5. Przygotować roztwór wodny o stężeniu 0,1 M NaCl. Dodać 0,5 ml 0,1 M roztworu NaCl do fiolki zawierającej wysuszony film lipidowy.
6. Pozostaw wodną mieszaninę lipidów na noc.
7. Krótko zmieszaj wir, aby utworzyć zawiesinę pęcherzyków, a następnie sonikuj przez 20 minut w sonikatorze do kąpieli w temperaturze pokojowej.
8. Wytłacz zawiesinę pęcherzyków przez membranę poliwęglanową o wielkości porów 100 nm. Przepuścić zawiesinę pęcherzyków przez filtr 17x.
9. Przechowywać wytłaczane pęcherzyki w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C.

4. Tworzenie sferycznych dwuwarstw lipidowych

1. Zbierz kulki SiO₂ o średnicy 700 nm. Koraliki są dostarczane w wodzie destylowanej o stężeniu podstawowym 1,4 x 10¹¹ kulek/ml.
2. W probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml przygotuj zawiesinę o stężeniu 1,5 x^{10 10} kulek/ml, dodając 107 μl roztworu podstawowego kulek do 893 μl 0,1 M NaCl.
3. Odwiruj zawiesinę, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszana.
4. Odwirować zawiesinę o sile 1 700 x g przez 20 minut, a następnie odrzucić supernatant. Zawiesić kulki w 1 ml 0,1 M NaCl. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby dokładnie umyć koraliki.
5. Aby utworzyć SSLBs, w 1,5 ml probówce Eppendorfa dodać 25 μl zawiesiny kulek SiO₂ do 200 μl zawiesiny pęcherzyków o stężeniu 1 mg/ml. Zmieszaj mieszaninę i odstaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na tym etapie stężenie SSLB powinno wynosić 1,7 x 10⁹ SSLBs/ml.
6. Wirować przy 1 700 x g przez 20 minut w celu osadzania SSLBs. Granulka powinna wydawać się różowa z powodu pęknięcia pęcherzyków z Rho-DPPE na kulkach.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 225 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH = 7,4. Powtórz kroki 4.6-4.7 jeszcze dwa razy, aby usunąć wszelkie niepęknięte pęcherzyki z zawiesiny SSLB.

5. Montaż tablicy SSLB

1. Rozszczepić płytkę z układami mikrodołków, w wyniku czego uzyskuje się prostokątne kawałki z 4-6 matrycami mikrodołków na sztukę.
2. Wymieszaj zawiesinę SSLB, a następnie umieść 10 μl zawiesiny SSLB na każdym układzie mikrodołków. Nie odpoczywaj przez 1 godzinę, aby SSLB mogły osiąść na powierzchni.
3. Delikatnie umyj chip układu mikrostudzienkowego PBS z butelki do mycia, a następnie zanurz w kąpieli PBS przygotowanej w płytkim naczyniu.
4. Po zanurzeniu delikatnie umieść ściągaczkę PDMS równo z chipem macierzy mikrodołków i delikatnie przesuń ją po powierzchni 5x, aby usunąć SSLB, które nie są unieruchomione w mikrodołkach.
5. Chwyć chip układu mikrostudzienkowego pęsetą i delikatnie potrząśnij w kąpieli PBS, aby usunąć nadmiar SSLB.
6. Szybko wyjmij wiór z wanny ściągaczki i umieść w świeżej kąpieli PBS do dalszego użycia. Upewnij się, że górna powierzchnia chipa pozostaje mokra, aby zachować SSLB.

Uwaga: Opisana powyżej metoda montażu może być użyta do stworzenia tablic naturalnych cząstek błony, takich jak cząsteczki mieliny wyizolowane z mózgu myszy lub pęcherzyki fosfolipidowe bez podparcia kulki SiO₂. Praca ta została szczegółowo opisana w Wittenberg et al.²¹ i reprezentatywne wyniki przedstawiono poniżej.

6. Test wiązania toksyny

1. Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml w PBS.
2. Przygotować roztwór o pożądanym stężeniu podjednostki B sprzężonej z toksyną Alexa 488 w PBS z 2 mg/ml BSA.
3. Wyjmij chip macierzy SSLB z kąpieli PBS i odchodź większość roztworu PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Pozostaw na chipie tylko tyle PBS, aby utrzymać nawodnienie tablicy SSLB.
4. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, dodaj 200 μl roztworu BSA 2 mg/ml do układu macierzy SSLB. Odstaw na 1 godzinę w nawilżonym pudełku.
5. Za pomocą mikropipety usuń 200 μl roztworu z górnej części układu matrycy SSLB.
6. Dodaj 200 μl roztworu toksyny do chipa macierzy SSLB i odstaw na 1 godzinę w wilgotnym pudełku.
7. Delikatnie umyj chip macierzy SSLB za pomocą PBS z butelki do mycia, aby usunąć niezwiązaną toksynę.
8. Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Przed obrazowaniem należy przykryć chip z szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 40 mm.
9. Matryce obrazowe za pomocą mikroskopu pionowego przy użyciu zestawów filtrów odpowiednich dla interesujących nas fluoroforów.
10. Analizuj intensywność fluorescencji poszczególnych SSLB w macierzy za pomocą funkcji automatycznej analizy cząstek w oprogramowaniu ImageJ.
11. Skompiluj średnie intensywności fluorescencji z poszczególnych SSLB w histogramy, które podsumowują intensywności SSLB znalezionych na danej tablicy.

Results

Gdy kulki SiO₂ są mieszane z roztworem pęcherzyków składających się z fosfolipidów, fluorescencyjnych lipidów i innych lipidów, takich jak gangliozydy, pęcherzyki pękają na powierzchni kulki SiO₂, tworząc SSLB, jak pokazano schematycznie na rysunku 1a. Po umyciu SSLB kroplę roztworu SSLB umieszcza się na matrycy mikrodołkowej, a kulki pozostawia się do osiadania na powierzchni. (Rysunek 1b1) Można to również zrobić za pomocą zawiesiny pęcherzyków fosfolipidowych lub...

Discussion

W tej pracy pokazujemy, że monodyspersyjne kulki SiO₂ pokryte podpartymi dwuwarstwami lipidowymi mogą być układane w układy mikrodołkowe bez potrzeby celowania w ligandy na dwuwarstwach lipidowych lub powierzchni substratu, a tablice można wykorzystać do charakteryzowania interakcji toksyna-lipid. Stała dysocjacji, którą obliczyliśmy dla wiązania CTx/GM1, wypada korzystnie, biorąc pod uwagę dużą rozbieżność wartości w literaturze, z poprzednim raportem Wintera i wsp., w którym do obliczenia stałej dys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-calowe wafle krzemowe	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 fotorezystor	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 deweloper	MicroChem	CD-26
i-line stepper		Canon	2500 i3
wytrawiacz jonowy reaktywny Vision 320	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Wytrawiacz jonów reaktywnych do głębokich rowów	Plasma Therm	SLR-770
System usuwania warstw atomowych	Zestaw Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poli(dimetylosiloksan)	Kleje Ellsworth	184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG
Fosfatydylocholina jaj	Avanti Polar Lipids	840051C
Sól 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina, rodamina, B, sulfonylo)amonowa	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Koraliki krzemionkowe	Bangs Laboratories	SS03N/4666	Opakowanie na pojemniku na koraliki informuje, że koraliki mają średnicę 900 nm. Jednak po rozpraszaniu światła i mikroskopii elektronowej ustaliliśmy, że kulki mają średnicę około 700 nm.
Podjednostka B toksyny, sondogat molekularny Alexa 488		C-34775
Przeciwciało antyoligodentrocytowe IgM O4, koniugat NorthernLights 557	R& D Systems	NL1326R
Sondy molekularne	FM1-43	T-3136
Wirówka Eppendorf MiniSpin	Fisher Scientific	05-401-09