Analiza proteomiczna dowolnego typu komórek jest wysoce zależna zarówno od czystości, jak i wstępnego frakcjonowania materiału wyjściowego w celu de-kompleksizacji próbki przed chromatografią cieczową metodą spektrometrii mas (MS). Stosując techniki płukania wstecznego, można uzyskać czyste plemniki od gryzoni. Po trawieniu fosfopeptydy można wzbogacić za pomocą TiO2.
Artykuł metodologiczny
Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plemniki są dość unikalne wśród typów komórek. Chociaż wytwarzany w jądrze, zarówno transkrypcja, jak i translacja genu jądrowego są wyłączane, gdy okrągła komórka prekursorowa zaczyna się wydłużać i różnicować w to, co jest morfologicznie rozpoznawane jako plemnik. Jednak plemnik jest bardzo niedojrzały, nie ma zdolności do ruchliwości ani rozpoznawania jaj. Oba te zdarzenia zachodzą, gdy plemniki przechodzą przez narząd wtórny znany jako najądrze. Podczas ~12-dniowego pasażu, który jest potrzebny, aby plemnik przeszedł przez najądrza, potranslacyjne modyfikacje istniejących białek odgrywają kluczową rolę w dojrzewaniu komórki. Jednym z głównych aspektów tego zjawiska jest fosforylacja białek. Aby scharakteryzować zdarzenia fosforylacji zachodzące podczas dojrzewania plemników, należy ustalić zarówno czyste populacje plemników, jak i wstępne frakcjonowanie fosfopeptydów. Za pomocą technik płukania wstecznego przedstawiono metodę izolacji czystych plemników o wysokiej jakości i wydajności z najądrzy dystalnych lub ogonowych. Wyjaśniono etapy rozpuszczania, trawienia i wstępnego frakcjonowania fosfoeptydów plemników za pomocą chromatografii powinowactwa TiO2. Po wyizolowaniu fosfopeptydy można wstrzykiwać do stwardnienia rozsianego w celu zidentyfikowania zarówno zdarzeń fosforylacji białek na określonych resztach aminokwasowych, jak i ilościowego określenia poziomów fosforylacji zachodzących podczas procesów dojrzewania plemników.
Wprowadzenie
Plemniki wyłoniwszy się z jądra, są bardzo zróżnicowane, ale co ciekawe, komórki te są niedojrzałe1,2. W związku z tym brakuje im pełnej funkcjonalności, w tym zdolności do pływania i wiązania się z oocytem3. Chociaż wymagane jest dalsze dojrzewanie plemników, nie może się ono odbywać drogami kanonicznymi, ponieważ na tym etapie procesu różnicowania komórek nie są one zdolne do transkrypcji genów i dalszej biosyntezy białek4. Kompetencja biologiczna jest nadawana plemnikom, gdy opuszczają jądro i wchodzą do części męskiego układu rozrodczego zwanej najądrzem5. Najądrze jest ciasno zwiniętą, wysoce zróżnicowaną rurką, która łączy przewody odprowadzające (jądra) z nasieniowodami i jest obecna u wszystkich samców ssaków6. Plemniki stopniowo nabywają swój potencjał zapłodnienia podczas zstępowania najądrza, opierając się na stale zmieniającym się środowisku świetlnym, które jest tworzone przez lokalne komórki nabłonka najądrza7. Różne czynności wydzielnicze i reabsorpcyjne obecne w środowisku najądrza działają na rzecz modyfikacji samego plemnika, zmieniając jego skład białkowy, węglowodanowy i lipidowy6. Znaczenie najądrza, a w szczególności początkowego obszaru "kaputu" tej struktury, zostało zilustrowane za pomocą technik podwiązania chirurgicznego8. Plemniki zatrzymane w jądrze przez podwiązanie przewodów odprowadzających są całkowicie pozbawione jakiejkolwiek zdolności do zapłodnienia oocytu9-11.
Oprócz środowiska najądrza, szlaki transdukcji sygnału w plemnikach działają w celu potranslacyjnej modyfikacji istniejącego dopełniacza plemników. Na przykład plemniki z wczesnych regionów najądrza wykazują różne wzorce fosforylacji białek w porównaniu z tymi ostatnimi regionami5,12. Nie jest to zaskakujące, ponieważ istnieją ogromne różnice w możliwościach plemników z tych regionów. Na przykład plemniki z wczesnego najądrza caput są immotylitowe. W przeciwieństwie do tego, plemniki z okolicy ogona będą ulegać postępowej ruchliwości do przodu po umieszczeniu w pożywce izotonicznej. Ponieważ plemniki najądrza nie są zdolne do biosyntezy białek de-novo, wszystkie wewnętrzne szlaki regulujące funkcję plemników muszą uchodzić przez modyfikacje potranslacyjne (PTM). W związku z tym wydaje się oczywiste, że proteomika, a w szczególności badanie PTM, takich jak fosforylacja, musi być głównym impulsem, jeśli mamy zrozumieć dojrzewanie plemników.
Alternatywna metoda pozyskiwania plemników z najądrzy za pomocą retro-płukaniawstecznego 13-16. Choć technika ta jest z pewnością bardziej czasochłonna i wymaga od operatora większych umiejętności, uzyskane plemniki niezmiennie wykazują czystość przekraczającą 99,99%. Ponadto, w przeciwieństwie do wszystkich innych technik, plemniki można wyizolować w stanie spoczynku, co umożliwia zbadanie, w jaki sposób inicjowana jest ruchliwość plemników. Ponieważ przygotowanie próbki jest najważniejszym aspektem analizy proteomicznej, izolacja plemników stała się jednym z najważniejszych aspektów badań proteomicznych plemników. Protokół ten zawiera wyjaśnienie, w jaki sposób plemniki są izolowane z ogona najądrza. Następnie przedstawiono procedurę wzbogacania fosforeptydem TiO2, ze szczególnym odniesieniem do sposobu ekstrakcji peptydów z wysoce zróżnicowanych plemników. Podejście SM można zastosować do rozróżnienia zmieniających się fosfopeptydów, jeśli porówna się plemniki najądrza ogonowego w jednym stanie (nieruchome lub niezdolne) do innego (ruchliwe, uzdolnione, reagujące akrosomem itp.), co czyni to skutecznym podejściem do badania funkcji plemników.
Protokół
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i potraw
- Przygotować 200 ml roztworu roboczego Biggers Whitten and Whitten (BWW)17, dodając 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H2KO4P i 0,294 gMgSO4 do 1 l wody Milli-Q. Jest to roztwór podstawowy, który można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.
- Z roztworu podstawowego dodać 420 mgNaHCO 3-, 200 mg glukozy, 6 mg pirogronianu sodu, 600 mg albuminy surowicy bydlęcej, 0,74 ml mleczanu sodu i 4,0 ml buforu HEPES do 193 ml bulionu BWW. Jest to roztwór roboczy, który jest zawsze przygotowywany świeży w ciągu dnia i równoważony do 37 °C przed użyciem.
- Aby wykonać kaniulę, weź rurkę z polietylenu (PE) o średnicy wewnętrznej 0,4 mm i średnicy zewnętrznej 1,1 mm i przytrzymaj na małym ogniu (zwykle płomień metanolu), aby rurka zaczęła się topić. Natychmiast wyciągnij rurkę na zewnątrz, aby rozciągnąć i zwęzić średnicę zewnętrzną.
- Wytnij w celu uzyskania zwężenia jednego końca, co pozwala na łatwiejszą kaniulację nasieniowodów.
- Przyciąć drugi koniec kaniuli na około 15 cm. Włóż igłę 30 G do końca i podłącz do niej strzykawkę o pojemności 3 ml (całkowicie wsuniętą).
- Wykonaj ustnik ssący, przecinając rurkę PE o długości 20 cm (średnica wewnętrzna 4,2 mm, średnica zewnętrzna 6,4 mm). Włóż ustnik do jednego końca.
- Włóż uchwyt szklanej rurki mikrokapilarnej i samą szklaną mikrokapilę (zwykle 3 μl dla myszy, 40 μl dla szczura).
2. Usuwanie najądrzy z myszy
- Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC procedurami specyficznymi dla każdej instytucji.
- Weź zwierzę i wykonaj małe nacięcie w mosznie, aby odsłonić najądrza. Wyciągnij jądro i najądrze z jamy za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich #5.
- Przeciąć nasieniowody tak, aby co najmniej 1-2 cm pozostały przyczepione do najądrza ogona. Ponadto należy przeciąć proksymalne przewody odprowadzające i tkankę łączącą najądrze z jądrem i usunąć cały męski tor rozrodczy.
- Umieść cały męski tor rozrodczy pod mikroskopem preparacyjnym o zakresie powiększenia w rzędzie 5-40X.
3. Kaniulowanie najądrza
- Przyklej kaniulę do mikroskopu tak, aby 1-2 cm zwężonego (w kształcie stożka) końca było wolne i widoczne przez soczewkę.
- Weź parę kleszczyków zegarmistrzowskich #5 i delikatnie zaciśnij każdą stronę nasieniowodów i pociągnij nasieniowody na kaniulę, tak aby kaniula weszła do nasieniowodów.
- Weź kawałek niewchłanialnego czarnego plecionego jedwabiu (rozmiar 5-0) i zawiąż węzeł wokół kaniulowanych nasieniowodów. Upewnij się, że węzeł jest mocno zaciągnięty, aby utrzymać kaniulę wewnątrz nasieniowodów, gdy stosowane jest ciśnienie powietrza ze strzykawki.
4. Wsteczne lub wsteczne zaczerwienienie plemników najądrza ogonowego
- Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich #5 chwyć dystalny koniec najądrzy ogona i usuń osłonkę białawą, aby odsłonić pojedynczy kanalik najądrza.
- Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij kanalik, aby go odsłonić, a następnie rozsuń, aby stworzyć otwór do uwolnienia plemników.
- Delikatnie nacisnąć strzykawkę o pojemności 3 ml (mysz) lub 20 ml (szczur) tak, aby usunąć powietrze ze strzykawki do nasieniowodów. Przy odpowiednim ciśnieniu plemniki zaczną powoli wychodzić z pękniętego kanalika na dystalnym końcu najądrza ogona. W tym czasie przyłóż ssanie do ustnika, aby wciągnąć plemniki do szklanej naczynia włosowatego. Uwaga: Zazwyczaj u myszy można uzyskać 2-3 μl plemników w zależności od wieku zwierzęcia. Szczur daje średnio 30-40 μl.
5. Mycie i liza plemników w ramach przygotowań do proteomiki
- Usunąć plemniki ze szklanej kapilary do 1 ml roztworu BWW (37 °C), delikatnie w ustnik lub podłączając strzykawkę i wydmuchując powietrze tak, aby wypchnąć plemniki z powrotem poza naczynia włosowate.
- Po dyfuzji plemników przemyj 3x (300 x g, 5 min) 1 ml BWW w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Po ostatnim umyciu usunąć supernatant. Uwaga: W tym momencie plemniki można zamrozić do późniejszego wykorzystania.
- Rozpuszczaj białka za pomocą 4% CHAPS, 2 M tiomocznika i 50 mM Tris, pH 7,4 przez 1 godzinę z przerywanym wirowaniem.
- Po lizie komórek odwirować (10 000 x g, 20 min), pobrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Uwaga: W tym momencie można przeprowadzić kwantyfikację białka.
6. Redukcja wiązań dwusiarczkowych i alkilowanie
- Dodać 10 mM DTT jako końcowe stężenie do lizowanych białek, wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Dodać 50 mM idoacetamidu jako stężenie końcowe do lizy, wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
7. Opady
- Chloroform metanolowy wytrącić próbkę, dodając 1 objętość lizatu (na przykład 400 μl), dodać jedną objętość (400 μl) metanolu i 0,5 objętości (200 μl) chloroformu.
- Wirować próbkę i wirować (10 000 x g, 2 min).
- Należy pamiętać, że po odwirowaniu pojawią się dwie fazy. Odrzuć wszystkie oprócz 2 mm górnej warstwy (uważając, aby nie zakłócić interfejsu).
- Dodać 1 objętość (400 μl) metanolu, delikatnie odwrócić probówkę 1-2x do wymieszania i ponownie odwirować (10 000 x g, 15 min). Wyrzuć supernatant do odpadów i suchego na powietrzu granulatu przez 3-4 minuty.
8. Trawienie trypsyny
- Trypsynę rozpuścić w 25 mM wodorowęglanie amonu zawierającym 1 M mocznik w stosunku 50:1 (W/W; białko: trypsyna) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, najlepiej przy 700 obr./min na termomieszalniku.
- Wirować (10 000 x g, 15 min) do granulowania niestrawionego materiału. Przenieść supernatant do nowej probówki.
9. Wzbogacenie fosfopeptydem
- Przeprowadzić oczyszczanie i wzbogacanie fosfopeptydów z trawienia tryptycznego, jak opisano wcześniej18. Rozcieńczyć peptydy tryptyczne 10-krotnie w buforze DHB [bufor DHB składa się z: 350 mg/ml kwasu 2,5 dihydrobenzesulfonu (DHB), 80% (v/v) ACN (acetonitryl), 2% (v/v) TFA (kwas trifluorooctowy)] i nałożyć na suche kulki TiO2 (200 μg).
- Pozostaw na rotatorze w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
- Przemyć próbkę buforem DHB, odwirować i usunąć supernatant. Następnie przepłukać próbkę trzykrotnie buforem do przemywania [80% ACN (v/v), 2% TFA (v/v)] w celu usunięcia DHB.
- Po ostatnim wirowaniu należy bezpośrednio eluować fosfopeptydy za pomocą buforu elucyjnego, dodając 25 μl 2,5% roztworu wodorotlenku amonu o pH ≥ 10,5. Odwirować i usunąć supernatant. Natychmiast zneutralizować ~0,3 μl kwasu mrówkowego.
Wyniki
Jakość wyników dowolnej analizy proteomicznej jest w dużym stopniu zależna od materiału wyjściowego. Przy zastosowaniu nowoczesnej MS, nawet niewielkie zanieczyszczenia w przygotowanych próbkach są łatwo wykrywane. Dlatego w przypadku proteomiki komórek plemników kluczowe jest wybranie metody pozwalającej na uzyskanie wysokiej czystości spermatozoów. Jak zilustrowano na Rysunku 1, do odzyskiwania komórek plemników z ogona najądrza stosuje się technikę wstecznego przepłukiwania (backflushing). Polega ona na kaniulacji nasieniowodu za pomocą rurki PE, co umożliwia powolne przyłożenie ciśnienia powietrza z podłączonej strzykawki. Rysunek 1A przedstawia ogon najądrza wraz z nasieniowodem. Rysunek 1B to zbliżenie pokazujące sposób zawiązania nasieniowodu w miejscu wprowadzenia kaniuli. W ten sposób spermatozoony zostają uwolnione na odciętym końcu jednego z kanalików ogonowych najądrzy. Jak pokazano na Rysunku 2A, spermatozoony są ekstrahowane z obszarów wierzchołkowych ogona najądrza i zasysane do szklanej kapilary w stanie spoczynku (Rysunek 2B). Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami „swim-up”, z których najważniejszą jest możliwość przeprowadzenia analizy fosfoproteomicznej spermatozoonów przed i po aktywacji ruchliwości. Spermatozoony mogą być następnie wydmuchiwane do wybranego medium. Rysunek 2C (lewa strona) pokazuje wygląd plemników bezpośrednio po wydmuchaniu do medium BWW. Wiele komórek tworzy skupiska. Jednak po 10 min potwierdzona zostaje sprawność komórek, ponieważ wypływają one i rozprzestrzeniają się homogenicznie w roztworze (Rysunek 2C, komórki po prawej stronie). Ponieważ technika wstecznego przepłukiwania ma bardzo niewielki wpływ na komórki plemników, uzyskujemy ruchliwość bliską 100%, a komórki szybko rozpraszają się w medium bez zewnętrznej stymulacji. W typowym eksperymencie z przepłukiwaniem wstecznym, liczba plemników odzyskanych od myszy szwajcarskiej wynosi od 1-5 x 106 komórek. Wartość ta jest silnie zależna od wieku zwierzęcia i może się różnić w zależności od szczepu myszy. U szczura norweskiego zazwyczaj otrzymujemy 200 x 106 spermatozoonów, ± 20%. Rysunek 2D przedstawia czystość spermatozoonów uzyskanych z ogona najądrza szczura.
Poza samą próbką, jednym z głównych problemów dotyczących przygotowania próbek jest wydajność trawienia trypsyną. Wytrącanie białek odgrywa kluczową rolę nie tylko w usuwaniu niepożądanych detergentów i soli, z których oba są niekompatybilne z MS, ale także w denaturacji białek. Ustaliliśmy, że najlepiej sprawdza się wytrącanie metanolowo-chloroformowe. Zgłaszano nie tylko, że procedura ta pozwala na lepsze wytrącanie białek o niskiej zawartości niż inne metody, w tym wytrącanie TCA19, ale posiada ona również dodatkowe zalety. Po wytrącaniu TCA często konieczna jest ponowna regulacja pH po zawieszeniu osadu TCA, który może pozostać dość kwasowy. Choć osad TCA można przemyć roztworami o wysokiej zawartości fazy organicznej w celu usunięcia kwasu, zwiększa to stopień manipulacji próbką i niepowtarzalność wyników. Brak neutralizacji kwasu spowoduje niską wydajność peptydów tryptycznych. Wytrącanie metanolowo-chloroformowe jest nie tylko szybkie, ale nie zakwasza próbki. Rycina 3 przedstawia osad białkowy typowo obserwowany przy 100 µg próbki pomiędzy dolną a górną fazą międzyfazową.
Izolację fosfopeptydów można przeprowadzić na kilka sposobów; jednak powtarzalność zależy od tego, w jaki sposób próbka była traktowana aż do tego etapu włącznie. Jedną z bardziej powszechnych i rozwijających się metod jest zastosowanie TiO2, opracowaną pierwotnie przez grupę Martina Larsena18,20,21. Mimo że opisano ją jako proces do zastosowania w mikrokolumnach, możemy uzyskać powtarzalne dane, stosując chromatografię okresową. Powodzenie tego procesu w dużym stopniu zależy od buforu eluującego, który musi mieć odpowiedni skład; w przeciwnym razie fosfopeptydy nie zostaną w ogóle eluowane.
Przedstawiono powtarzalność protokołu oraz reprezentatywne dane dla fosfopeptydów wzbogaconych TiO2 z plemników ogona najądrza w stanie niepochodnym (Rysunek 4 góra) i pochodnym (Rysunek 4 dół) w zakresie m/z 650-670. Wykazaliśmy, że jest to technika niezwykle powtarzalna, nawet przy zastosowaniu powtórzeń biologicznych17. Niebieskie smugi pojawiające się w czasie to peptydy eluujące z nanokolumny C18 wraz ze wzrostem stężenia acetonitrylu. Wyraźnie widać, że w populacji ruchliwej (pokazano n=3, zazwyczaj analizuje się n=8) występuje grupa peptydów o masie monoizotopowej w zakresie około 651,5 Da, która jest całkowicie nieobecna w zakresie niepochodnym. Następnie do identyfikacji tego peptydu wykorzystuje się tandemową spektrometrię mas.
Rysunek 1: Kaniulacja ogona najądrza. (A) Zdjęcie ogona najądrza. Kaniulę przytwierdza się taśmą, aby odsłonić około 1-2 cm wcześniej przygotowanego końca. Jest on wprowadzany do przewodów nasiennych za pomocą precyzyjnej pęsety zegarmistrzowskiej nr 5. (B) Kaniulę mocuje się, zawiązując cienką nić jedwabną wokół odcinka obejmującego zarówno przewód nasienny, jak i kaniulę. Od myszy pobiera się około 2-3 µl komórek i płynu z ogona najądrza w stężeniu 1 x 106/µl. Od szczura (pokazano na zdjęciu) uzyskuje się około 30-40 µl płynu o podobnym stężeniu.
Rysunek 2: Kapilara szklana użyta do pobierania kompetentnych plemników z najądrza. (A) Pojedynczy kanalik z wierzchołka ogona najądrza zostaje wyizolowany i przerwany. Pokazano przybliżone miejsce, w którym odbywa się ta czynność. (B) Góra obrazu przedstawia pustą szklaną kapilarę, a dół kapilarę pobraną od wcześniej przepłukanego szczura. Nie stwierdzono zanieczyszczenia krwią i odnotowano minimalne zanieczyszczenie komórkami nabłonka. (C) Ponieważ plemniki w płynie najądrzowym nie są jeszcze rozcieńczone, nie rozpoczęły procesu aktywacji. W momencie wstępnego wypchnięcia plemników do roztworu BWW, wypływają one w postaci zwartej „nitki” (lewa strona). Kompetencję komórek można łatwo stwierdzić, ponieważ po 10 min większość plemników wypływa do roztworu bez żadnego zewnętrznego pobudzenia (prawa strona). (D) Obraz alikwoty komórek z ogona najądrza bezpośrednio po ich wypłynięciu demonstruje czystość komórek.
Rycina 3: Wytrącanie metanolowo-chloroformowe. Po solubilizacji spermatozoonów, frakcję rozpuszczalną poddaje się wytrącaniu metanolowo-chloroformowemu, aby zapewnić denaturację białek i usunięcie substancji zanieczyszczających. Osad białkowy pojawia się na granicy faz metanol/woda i chloroformu. Górną warstwę usuwa się ostrożnie, aby nie naruszyć osadu. Zwykle pozostawia się około 2-3 mm górnej fazy, aby zapobiec utracie białka.
Rysunek 4: Typowy profil fosfopeptydów wzbogacony o TiO2. Zgodnie z opisanym protokołem wyizolowano plemniki z ogona najądrza w stanie nieruchomym (góra, N = 3) lub ruchliwym (dół, N = 3). Wykazano obecność klastra peptydów o masie monoizotopowej ~651,5 Da w populacjach ruchliwych, przy jego całkowitym braku w populacjach nieruchomych (strzałka). Porównania tego rodzaju określa się mianem „bezznakowania (opartych na MS)”. Masa peptydu oraz czas retencji są następnie wykorzystywane do ukierunkowania związku w tandemowej spektrometrii mas w celu identyfikacji białka, z którego pochodził dany peptyd.
Dyskusja
Kluczowymi etapami udanej i powtarzalnej analizy proteomicznej plemników są: 1) czystość materiału wyjściowego; 2) usuwanie niechcianych soli i detergentów; 3) denaturacja białek w pełnym zakresie, aby umożliwić trypsynie trawienie wysokiej wydajności białek oraz 4) minimalizacja obchodzenia się z próbkami w celu zmniejszenia strat peptydu.
Aby skutecznie przepłukać ogon najądrza, konieczne jest zlokalizowanie obszaru, z którego plemniki wyjdą. Zarówno w przypadku szczurów, jak i myszy, jest to wierzchołek obszaru wklęsłego, w środku obszaru ogonowego najądrza (patrz ryc. 2A). Jeśli zbliżysz się do nasieniowodów, płukanie wsteczne jest łatwiejsze, a wskaźnik sukcesu jest na ogół wyższy. Wiąże się to jednak z utratą liczby plemników. Alternatywnie, jeśli ktoś próbuje przesunąć się bardziej proksymalnie do ciała, wówczas ciśnienie wymagane do przepchnięcia plemników z powrotem przez przewody najądrza jest często tak wysokie, że nieuchronnie dochodzi do uszkodzenia najądrza.
Płukanie wsteczne najądrza jest tradycyjnie wykonywane przy użyciu nasyconego wodą oleju mineralnego i zbilansowanego roztworu soli w samej strzykawce jako pożywki do usuwania plemników22-25. Obie procedury są potencjalnie problematyczne dla LC-MS. Po pierwsze, minerał prawdopodobnie zablokuje nanokolumny nano-C18, które są zasadniczo używane na całym świecie do analizy proteomicznej i należy zachować ostrożność, aby żadna z nich nie została przeniesiona do przodu. W takim przypadku niemożliwe jest kontynuowanie, a próbka jest zasadniczo utracona. Można to przezwyciężyć poprzez zastosowanie BWW lub innych zrównoważonych roztworów soli w strzykawce, jednak chociaż jest to skuteczne, wkrótce zauważyliśmy, że wiele plemników staje się ruchliwych, gdy tylko roztwór BWW wejdzie w kontakt i zmiesza się z komórkami najądrza ogona. Aby obejść ten problem, po prostu przepłukujemy plemniki powietrzem. Nie tylko jakość plemników jest porównywalna z metodami płynnymi, ale ich ilość jest identyczna.
Fosfoproteomika jest prawdopodobnie jednym z niewielu sposobów ustalenia, które szlaki sygnałowe występują w plemnikach po wytrysku. Jedną z głównych ścieżek, które badamy, jest proces kapacytacji. Plemniki muszą przejść "kapacytację", zanim będą w stanie związać się z komórką jajową. W praktyce osiąga się to zasadniczo poprzez inkubację plemników przez pewien czas (mysz 40 minut; szczur 1,5 godziny; człowiek 3-24 godziny) w roztworze BWW z albuminą surowicy. Wcześniej my i inni wykazaliśmy rolę kilku kinaz zaangażowanych w kapacytację. Co ciekawe, delecja PKAμII wytwarza myszy, których plemniki pływają spontanicznie in vitro, ale nie mogą ulegać hiperaktywacji26. To ostatnie jest cechą charakterystyczną pojemności, dzięki której plemniki zmieniają swój wzorzec pływania z dużej prędkości, niskiej amplitudy, na niską prędkość i częstotliwość uderzeń o wysokiej amplitudzie. Wykazaliśmy, że dalsze kinazy zaangażowane w ten proces obejmują pp60-cSRC (SRC)13,27 , c-yes28 i c-ABL14. Co ciekawe, hamowanie SRC zatrzymuje fosforylację tyrozyny zależną od pojemności13. Można to jednak przezwyciężyć za pomocą kwasu okadaikowego, co sugeruje, że SRC nie jest bezpośrednio zaangażowany w ogólny początek fosforylacji tyrozyny 29 , ale może regulować fosfatazę29. Problem z używaniem BWW jako pożywki do wypychania plemników z najądrza polega na tym, że po aktywacji plemniki myszy potrzebują tylko około 40 minut, aby się zdolić. Biorąc pod uwagę, że izolacja plemników może trwać 5 minut/mysz i często w eksperymencie wykorzystuje się kilka myszy, plemniki będą na różnych etapach dojrzałości na początku eksperymentu. Aby temu zaradzić, można użyć ciśnienia powietrza, aby wepchnąć plemniki z najądrza ogona do szklanej kaniuli. Nie tylko wszystkie plemniki są nieaktywne i zasadniczo takie, jakie można by znaleźć w środowisku ogonowym, ale umożliwia to porównanie fosfoproteomiki nieruchliwej i ruchliwej.
Obchodzenie się z próbkami do celów fosfoproteomiki powinno być ograniczone do minimum podczas porównywania plemników w dwóch różnych stanach funkcjonalnych. Zastosowanie chloroformu metanolowego w porównaniu z innymi tradycyjnymi metodami wytrącania białek 1) zmniejsza potrzebę dodatkowych etapów mycia, 2) usuwa prawie wszystkie ślady soli i tłuszczów oraz 3) ma udowodnioną zdolność do wytrącania białek o niskiej obfitości w porównaniu z TCA19. Zaleca się wytrącanie białka przed trawieniem trypsyny, ponieważ nie tylko pomaga to w denaturacji białka (co wspomaga trawienie trypsyny), ale także usuwa wiele niekompatybilnych metabolitów MS obecnych w komórce.
Porównanie fosfopeptydów w nasieniu można przeprowadzić na wiele sposobów. Na poziomie podstawowym można przeprowadzić proste porównanie zidentyfikowanego fosfopeptydu w jednej próbce z tym w innej próbce w procesie znanym jako "zliczanie spektralne". Jednak krytyka tego podejścia była głównie dlatego, że wczesne badania proteomiczne wykorzystywały niskie powtórzenia (w celu pełniejszego omówienia patrz Lundren i wsp.30). Bardziej wyrafinowanym podejściem jest przyjrzenie się intensywności masy macierzystej peptydu i porównanie jej z innymi próbkami (porównanie bez znaczników). W przykładzie pokazanym na rysunku 4 można zobaczyć peptyd nieobecny w plemnikach nieruchliwych (ryc. 4 u góry), ale obecnych w ruchliwych (ryc. 4 na dole) plemnikach o sile m/z 650-670. Proces ten, określany jako kwantyfikacja bez etykiet w oparciu o MS, jest strategią bez etykietowania.
Alternatywną strategią powszechnie stosowaną w celu zmniejszenia liczby przebiegów wymaganych do kwantyfikacji proteomicznej jest użycie izotopów. Ponieważ masa izotopu jest różna, spektrometr mas może być używany do porównywania intensywności peptydów eluujących. Jednak w przeciwieństwie do większości innych typów komórek, niektóre znakowanie izotopowe nie mogą być stosowane do plemników. Na przykład dodanie stabilnych izotopów (jeden ciężki izotop jest dodawany do jednej próbki, podczas gdy lżejsza wersja jest dodawana do innej) może być stosowane w hodowli tkankowej. Kiedy izotopy zostaną włączone do białka, można przeprowadzić analizę proteomiczną poprzez połączenie dwóch próbek (multipleksowanie). Jednak w przypadku plemników nie można tego zrobić, po prostu ze względu na fakt, że 1) znakowanie izotopów wymaga kilku pasaży (do 8) w hodowli tkankowej i 2) plemniki nie mają transkrypcji i translacji genów jądrowych, a zatem i tak nie mogą włączyć izotopów do całego swojego białka. Jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest zamówienie myszy znakowanych radioaktywnie, jednak są one notorycznie drogie. Alternatywnym podejściem jest użycie znacznika chemicznego. Zrobiono to, gdy myszy nieuzdolnione porównano z myszami uzdolnionymi do pracy. W tym przypadku zastosowano znaczniki D0 i D3 do rozróżnienia jednej próbki od drugiej w spektrometrzemas 31. Inne podejścia mogą obejmować zastosowanie iTRAQ (znacznik izobaryczny do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej), w którym lizyny są znakowane chemicznie izotopami o różnej masie; iCAT (znacznik powinowactwa kodowany izotopem), w którym cysteiny są znakowane izotopami o różnej masie oraz znakowane ciężką i lekką wodą.
W każdym przypadku należy jednak pamiętać o jednej rzeczy. Państwo członkowskie podaje tylko to, co jest obecne w próbce, a to jest odzwierciedleniem wszystkiego, co do tej pory stało się z tą próbką. Minimalizacja obsługi próbek przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności na każdym etapie jest niezbędna do udanej analizy proteomicznej.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować NHMRC za rozwój kariery oraz APP1066336 wsparcia grantowego, które wsparło tę pracę.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,5-dihydroksy-1,4-benzochinon | Aldrich | 195464 | |
| Zestaw do oznaczania ilościowego 2-D | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
| Albumina z surowicy bydlęcej | Sigma | A7030 | |
| Roztwór amoniaku 25% | Merck | 1.05432 | |
| Wodorowęglan amonu | Sigma | A6141 | |
| Chlorek | wapniaSigma | C5080 | |
| CHAPS 3-[3-(cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian | Research Organics | 1300C | |
| Chloroform | BDH | 10077.6B | |
| Wodorofosforan disodowy | Merck | 1.06580 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
| Kwas mrówkowy | Sigma | O6440 | |
| Glukoza | Sigma | G6152 | |
| Glutamina-L | Sigma | G7513 | |
| Hepes (wolny kwas) | Sigma | H3375 | |
| Kwas wolny od kwasu jodooctowego | Sigma | I4386 | |
| Kwas mlekowy | Sigma | L1750 | |
| Chlorek magnezu | Res. Org. | 0090M | |
| Metanol | Merck | 10158.6B | |
| Percoll (sterylny) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
| Inhibitor fosfatazy Koktajl Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
| Chlorek potasu | Sigma | P9333 | |
| Wodorowęglan potasu | Sklep medyczny | CH 600 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | S3817 | |
| Chlorek sodu | Sigma | S7653 | |
| Diwodorofosforan sodu | Merck | 1.06346 | |
| Wodorowęglan sodu | BDH | 10247.4V | |
| Pirogronian sodu | Sigma | S8636 | |
| Tris, ultra czysty | gatunek Amresco (Astral) | AM0497 | |
| Trypsin Gold, klasa masowa | Promega | V5280 | |
| Mocznik | Sigma | U5128 | |
| Chlorek | Sigma | Z0173 | |
| 0,4 mm Rurka polietylenowa | Goodfellow | ET317100 | |
| 30 G Igła | Terumo | NN2038R | |
| 3 ml 3 ml | Terumo | SS035 | |
| 4,2 mm Rurka polietylenowa | Goodfellow | ET317640 | |
| Pleciony jedwab (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
| Kwas trichlorooctowy | Sigma | 299537 | |
| koraliki TiO2 (z rozebranej kolumny) | Titansphere | 6HT68003 | |
| Rurka Eppendorf | Eppendorf | 22431081 | |
| C7B30 | Sigma | C0856 |
Bibliografia
- Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
- Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
- Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
- Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
- Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
- Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
- Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
- Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
- Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
- Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
- Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
- Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
- Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
- Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
- Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
- Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. , Freeman. (1971).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
- Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
- Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
- Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
- Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
- Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
- Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
- Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
- Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
- Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
- Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
- Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
- Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).
Przedruki i uprawnienia
