Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Podsumowanie

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Streszczenie

Przewlekły stan zapalny jest głównym czynnikiem powodującym patologiczne uszkodzenia tkanek i cechą jednoczącą wiele przewlekłych chorób u ludzi, w tym nowotworowych, autoimmunologicznych i przewlekłych chorób zapalnych. Pojawiające się dowody wskazują na to, że przewlekły stan zapalny wywołany przez patogen przyczynia się do rozwoju i progresji chorób przewlekłych o wielu różnych objawach klinicznych. Ze względu na złożoną i wieloczynnikową etiologię chorób przewlekłych, projektowanie eksperymentów w celu udowodnienia związku przyczynowego i ustanowienia powiązań mechanistycznych jest prawie niemożliwe u ludzi. Zaletą stosowania modeli zwierzęcych jest to, że można kontrolować zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, które mogą wpływać na przebieg danej choroby. W związku z tym zaprojektowanie odpowiednich zwierzęcych modeli infekcji stanowi kluczowy krok w identyfikacji mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do przewlekłego stanu zapalnego.

Tutaj opisujemy mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogen w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych po zakażeniu doustnym patogenem Porphyromonas gingivalis, bakterią ściśle związaną z ludzką chorobą przyzębia. Zakażenie jamy ustnej myszy wolnych od specyficznych patogenów wywołuje miejscową reakcję zapalną powodującą zniszczenie zęba podtrzymującego kość wyrostka zębodołowego, co jest cechą charakterystyczną chorób przyzębia. W ustalonym mysim modelu miażdżycy zakażenie P. gingivalis przyspiesza odkładanie się blaszki zapalnej w zatoce aortalnej i tętnicy bezimiennej, czemu towarzyszy aktywacja śródbłonka naczyniowego, zwiększony naciek komórek odpornościowych i zwiększona ekspresja mediatorów stanu zapalnego w obrębie zmian. Szczegółowo opisujemy metodologie oceny stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych. Wykorzystanie myszy transgenicznych i zdefiniowanych mutantów bakteryjnych sprawia, że model ten jest szczególnie odpowiedni do identyfikacji zarówno czynników gospodarza, jak i drobnoustrojów zaangażowanych w inicjację, progresję i wynik choroby. Ponadto model może być wykorzystywany do badań przesiewowych pod kątem nowych strategii terapeutycznych, w tym szczepień i interwencji farmakologicznej.

Wprowadzenie

Przewlekłe zapalenie jest głównym czynnikiem powodującym patologiczne uszkodzenia tkanek i cechą jednoczącą wiele przewlekłych chorób u ludzi. Choroby te obejmują choroby nowotworowe, autoimmunologiczne i przewlekłe choroby zapalne¹. Etiologia wielu chorób przewlekłych pozostaje niejasna, ale uważa się, że jest złożona i wieloczynnikowa, obejmująca zarówno predyspozycje genetyczne, jak i wprowadzenie czynników środowiskowych. Podczas gdy utrwalacze stanu zapalnego pozostają nieuchwytne, profile komórkowe i molekularne aktywacji immunologicznej w znacznym stopniu pokrywają się z wzorcami obserwowanymi w odpowiedziach gospodarza na patogeny².

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że infekcja patogenami mikrobiologicznymi wpływa na rozwój i postęp przewlekłego stanu zapalnego oraz jego różnorodnych objawów klinicznych^2,3. Patogeny mogą wywoływać i utrzymywać przewlekły stan zapalny bezpośrednio poprzez osłabienie układu odpornościowego gospodarza i tworzenie uporczywych infekcji⁴. W przypadku braku trwałości drobnoustrojów infekcja może przyspieszyć przewlekły stan zapalny spowodowany reakcjami autoimmunologicznymi wywołanymi przez mimikrę molekularną na własne antygeny, zmianami w samoantygenach, które czynią je immunogennymi, lub uszkodzeniem, które uwalnia wcześniej zamaskowane antygeny gospodarza. Rzadko jednak identyfikowano konkretne patogeny jako uniwersalną przyczynę danej choroby przewlekłej. Większość dostępnych danych sugeruje raczej, że patogeny wykorzystują różne mechanizmy do wywoływania przewlekłego stanu zapalnego o szerokim spektrum objawów klinicznych i wyników choroby u genetycznie podatnego gospodarza³. W związku z tym szczegółowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których określone patogeny wywołują przewlekły stan zapalny, może mieć poważne implikacje dla zdrowia publicznego, a także leczenia i zapobiegania wielu chorobom przewlekłym.

Chociaż mechanizmy specyficzne dla gospodarza i patogenu przyczyniające się do indukcji i utrzymywania przewlekłego stanu zapalnego są słabo poznane, postępy w modelowaniu przewlekłego zapalenia wywołanego przez patogeny zaczęły pogłębiać nasze zrozumienie tych procesów. Model zakażenia jamy ustnej P. gingivalis jest unikalnym, dobrze scharakteryzowanym mysim modelem przewlekłego zapalenia wywołanego przez patogeny, który umożliwia analizę mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu przyczyniających się do przewlekłego stanu zapalnego w miejscach miejscowych (utrata masy ustnej) i ogólnoustrojowych (miażdżyca)^5,6.

P. gingivalis to Gram-ujemny, beztlenowy patogen jamy ustnej związany z ludzką chorobą przyzębia, przewlekłą chorobą zapalną spowodowaną infekcją, charakteryzującą się niszczeniem tkanki podporowej zębów⁷. Oprócz patologii w początkowym miejscu zakażenia, coraz więcej dowodów wskazuje na to, że przewlekły stan zapalny wywołany przez P. gingivalis przyczynia się do rozwoju i progresji chorób ogólnoustrojowych, w tym miażdżycy⁵, choroby charakteryzującej się przewlekłym zapaleniem ściany naczynia tętniczego. Zakażenie jamy ustnej myszy P. gingivalis wolnych od specyficznych patogenów wywołuje miejscową reakcję zapalną, która prowadzi do zniszczenia kości wyrostka zębodołowego⁸. P. gingivalis można odzyskać z pyska zakażonych myszy do 42 dni po zakażeniu⁸ i myszy rozwijają wysoki poziom miana przeciwciał w surowicy swoistych dla patogenu⁹. W ustalonym mysim modelu miażdżycy przy użyciu myszy Apolipoproteina-E^-/- (ApoE^-/-), zakażenie jamy ustnej P. gingivalis wywołuje przewlekły stan zapalny, który napędza odkładanie się blaszki zapalnej w zatoce aortalnej¹⁰ i tętnicy nienazwanej¹¹. Postępujący stan zapalny w tętnicy nienazwanej myszy zakażonych P. gingivalis można monitorować u żywych zwierząt za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo. Histologicznie zmiany tętnicze u myszy zakażonych P. gingivalis wykazują zwiększoną akumulację lipidów, której towarzyszy aktywacja śródbłonka naczyniowego, zwiększony naciek komórek odpornościowych i zwiększona ekspresja mediatorów stanu zapalnego¹². Zastosowanie tego modelu u myszy z nokautem wyjaśniło rolę składników sygnalizacyjnych gospodarza i mediatorów stanu zapalnego, a także specyficznych interakcji komórkowych, które napędzają immunopatologię indukowaną przez P. gingivalis ^12. Ponadto eksperymenty z wykorzystaniem zdefiniowanych mutantów bakteryjnych zidentyfikowały krytyczne czynniki wirulencji P. gingivalis przyczyniające się do przewlekłego stanu zapalnego w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych¹⁵.

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologie oceny przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez P. gingivalis w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych. Udostępniamy szczegółowy protokół analizy zaniku kości wyrostka zębodołowego za pomocą mikrotomografii komputerowej przy użyciu oprogramowania Amira. Ponadto określamy przydatność seryjnego rezonansu magnetycznego żywych zwierząt in vivo do oceny postępującego stanu zapalnego w obrębie tętnicy nienazwanej. Uwzględniamy metodologie wizualizacji i kwantyfikacji blaszki zapalnej w zmianach tętniczych oraz opisujemy ich charakterystykę histologiczną. Wykorzystanie myszy transgenicznych i zdefiniowanych mutantów bakteryjnych sprawia, że model ten jest szczególnie odpowiedni do identyfikacji zarówno czynników gospodarza, jak i drobnoustrojów zaangażowanych w inicjację, progresję i wynik choroby. Ponadto model może być wykorzystywany do badań przesiewowych pod kątem nowych strategii terapeutycznych, w tym szczepień i interwencji farmakologicznej.

Protokół

1. Wzrost i rozwój bakterii

1. Zamrożone wywary P. gingivalis 381 należy rozprowadzić na beztlenowych płytkach agaru z krwią i inkubować przez 3 - 5 dni w komorze beztlenowej (10% H₂/10% CO₂/80% N₂) w temperaturze 37 °C.
2. Użyj organizmów wyhodowanych na płytkach, aby zaszczepić 5 ml płynnych kultur bulionu z naparu z mózgu i serca (BHI) uzupełnionego ekstraktem drożdżowym (0,5%), heminą (10 μg/ml) i menadionem (1 μg/ml). Po wzroście O/N przenieść 5 ml kultur do 45 ml BHI.
3. Inkubować 50 ml płynnych kultur beztlenowo przez dodatkowe 18 – 24 godziny i zbierać w środkowej lub późnej fazie logarytmicznej. UWAGA: Czystość kultury powinna być zawsze weryfikowana za pomocą barwienia metodą Grama przed wprowadzeniem bakterii do zwierząt.
4. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 7 000 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i dokładnie zawiesić osad komórek bakteryjnych w 5 ml PBS za pomocą pipety serologicznej. Dodać dodatkowe 45 ml PBS i wirować przy 7 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie, co daje w sumie trzy prania.
5. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS tak, aby rozcieńczenie kultury w stosunku 1:10 miało gęstość optyczną 1,0 przy 660 nm (średnica zewnętrzna ₆₆₀ wynosząca 1 jest równoważna 10,9 jtk/ml). Odważyć wystarczającą ilość karboksymetylocelulozy (średnia lepkość), aby uzyskać 2% w/v roztworu (np. 0,1 g na 5 ml kultury). Powoli dodawaj karboksymetylocelulozę do zawiesiny bakteryjnej podczas wirowania, aby uniknąć zbrylania.

2. Infekcja jamy ustnej

UWAGA: Jak pokazano na rysunku 1, przy użyciu odpowiedniego modelu mysiego i schematu infekcji jamy ustnej, P. gingivalis wywołuje przewlekłe zapalenie i immunopatologię w miejscach miejscowych (jama ustna) i ogólnoustrojowych (tętnice).

1. Podawać sulfametoksazol (0,87 mg / ml) i trimetoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) samcom myszy w wieku od sześciu do 8 tygodni ad libitum w wodzie pitnej przez 2 tygodnie, aby zmniejszyć normalną florę. Roztwór antybiotyku należy przechowywać w butelkach ze szkła oranżowego i chronić przed światłem, aby zapobiec degradacji.
2. Aby uniknąć sedymentacji roztworu antybiotyku, należy wstrząsać butelkami raz lub dwa razy dziennie (tj. rano i późnym popołudniem). Wymieniaj na świeżo przygotowany roztwór co 3 - 5 dni.
3. Po dwóch tygodniach zastąp roztwór antybiotyku konwencjonalną wodą pitną. Pozwól na 2-dniowy okres odpoczynku od antybiotyków przed infekcją jamy ustnej.
4. Załadować zawiesinę P. gingivalis/nośnika do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml z dołączoną igłą do karmienia. Ręcznie przytrzymuj mysz, chwytając za kark z tyłu szyi. Upewnij się, że uchwyt jest wystarczająco mocny, aby ograniczyć ruchomość głowy myszy.
5. Zakażenie myszy poprzez miejscowe stosowanie P. gingivalis na policzkowej powierzchni szczęki. Ustawić igłę do karmienia tak, aby była wyrównana z powierzchnią policzkową prawych zębów trzonowych szczęki i wysunąć 50 ul zawiesiny bakteryjnej. Roztwór delikatnie rozprowadzić wzdłuż dziąsła przez 1 minutę za pomocą kulki igły do karmienia.
6. Pozwól myszy odpocząć przez okres od 30 sekund do 1 minuty przed powtórzeniem procedury na lewej szczęce. Myszy kontrolne otrzymują antybiotyk przed leczeniem i doustne zgłębnik z samym nośnikiem (2% karboksymetylocelulozy w PBS).
7. Zbadanie przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogen w miejscach lokalnych spowodował utratę kości wyrostka zębodołowego poprzez zakażenie myszy 3 razy w odstępach 2-dniowych. Ofiaruj myszy 6 tygodni później w celu oceny utraty masy kostnej za pomocą mikrotomografii komputerowej.
8. Aby zbadać przewlekły stan zapalny wywołany przez patogen w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych, zakażaj myszy ApoE^-/- podatne na miażdżycę 5 razy w tygodniu przez 3 tygodnie><. UWAGA: Progresję choroby w tętnicy nienazwanej monitoruje się za pomocą seryjnego rezonansu magnetycznego in vivo. Obrazuj myszy w różnych punktach czasowych i poświęć 6-16 tygodni później. W momencie ofiarowania należy ocenić globalne obciążenie miażdżycowe za pomocą analizy en face i określić ubytek kości wyrostka zębodołowego za pomocą mikrotomografii komputerowej. Scharakteryzuj zmiany miażdżycowe za pomocą histologii i immunohistochemii.

3. Mikrotomografia komputerowa (mikrotomografia komputerowa)

1. Przygotowanie próbki
   1. Poświęć myszy w pożądanym punkcie czasowym po infekcji. Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO₂ lub inną metodą zatwierdzoną przez placówkę dla zwierząt.
      UWAGA: Pobrać krew przez nakłucie serca, oddzielić surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy IgG anty-P. gingivalis zgodnie z opisem w innym miejscu⁹.
   2. Użyj dużej pary nożyczek do dekapitacji, aby zranić głowę myszy u podstawy czaszki. Usuń miąższ za pomocą kleszczy i umieść czaszkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml 4% buforowanego paraformaldehydu. Utrwalić próbkę na 24 - 48 godzin w temperaturze 4°C.
   3. Po utrwaleniu dokładnie spłukać próbkę PBS.
   4. Wykonaj biopsje bloku szczęki.
   5. Przechowywać półszczękę w 70% EtOH stopnia histologicznego w temperaturze 4 °C do czasu oceny za pomocą mikrotomografii komputerowej.
2. Akwizycja obrazu
   1. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą stacjonarnego skanera mikroCT. Ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego na prąd 114 μA i napięcie 70 kV. Załaduj poszczególne półszczęki do naczynia obrazowego i skanuj w rozdzielczości 12 μm we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych.
      UWAGA: Załaduj jednocześnie kilka półszczęk do naczynia obrazowego.
   2. Wykonaj wstępne skanowanie w niskiej rozdzielczości, które pozwala użytkownikowi wyznaczyć granice akwizycji obrazu i ograniczyć skanowanie do obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą systemu.
      UWAGA: Intensywność szkliwa sprawia, że korona zębów trzonowych szczęki jest łatwa do odróżnienia. Używając zębów trzonowych jako przewodnika, luźno ustaw granice obrazowania, aby objąć trzy zęby trzonowe i otaczającą je kość wyrostka zębodołowego. Ta funkcja jest również używana do rozróżniania poszczególnych półszczęk podczas skanowania wielu próbek w tym samym naczyniu.
   3. Po zakończeniu skanowania przekonwertuj pliki obrazów RAW (. ISQ) w wysokiej jakości dicomy (. DCM).
3. Analiza obrazu
   W tym protokole analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania do wizualizacji, przetwarzania i analizy danych. Najpierw użyj morfologicznych punktów orientacyjnych, aby utworzyć płaszczyznę najlepiej dopasowaną do połączenia cementowo-szkliwnego (CEJ). Następnie użyj , aby przekształcić półszczękę w standardową orientację w celu późniejszego pomiaru objętości kości wyrostka zębodołowego.
   1. Otwórz oprogramowanie i kliknij ikonę "Otwórz dane" znajdującą się w lewym górnym rogu puli. Możesz też użyć opcji Plik > Otwórz dane.
   2. Wybierz stos obrazów DICOM i kliknij przycisk Wczytaj. Zostanie wyświetlone okno DICOM Loader (Moduł ładujący DICOM). Kliknij przycisk OK.
   3. Obserwuj zestaw danych jako zieloną ikonę w puli. Zwróć uwagę, że kliknięcie obiektu danych powoduje wyświetlenie dodatkowych przycisków w obszarze przycisków w górnej części puli. Wybranie ikony powoduje również wyświetlenie pewnych informacji o rekordzie danych w obszarze właściwości.
   4. Każda ikona w Puli zawiera menu podręczne, z którego można wybrać różne moduły. Aktywuj menu kontekstowe, klikając białą strzałkę w prawym rogu ikony danych. W module wyświetlacza wybierz opcję Isosurface (Wyświetl > Isosurface). Ikona Isosurface pojawi się w obszarze Basen. Po wybraniu tej opcji w obszarze Właściwości pojawią się dodatkowe ustawienia.
   5. Ustaw Styl rysowania na przezroczysty, a Próg na 2 000. Upewnij się, że przyciski kompaktowania i próbkowania w dół są zaznaczone w obszarze opcji. W obszarze Średnia upewnij się, że x, y i z są ustawione na wartość 2. Kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować plik isosurface.
      UWAGA: Obserwuj przezroczystą rekonstrukcję 3D połowia szczęki w przeglądarce 3D. Zaletą korzystania z przezroczystego stylu rysowania do rekonstrukcji obrazu jest to, że korzenie zębów trzonowych można łatwo zidentyfikować. Będzie to ważne przy ustawianiu próbki w standardowej orientacji.
   6. Wybierz zieloną ikonę danych, a następnie w obszarze Właściwości wybierz ikonę przycinania. Obserwuj okno wyświetlające wymiary i współrzędne danych. Na razie odłóż to na bok. Zwróć uwagę, że w przeglądarce 3D pojawia się obwiednia z zielonymi zakładkami w każdym rogu.
   7. Wybierz przycisk Interakcja na pasku narzędzi przeglądarki. Zmień rozmiar obwiedni, klikając i przeciągając zielone rogi. Upewnij się, że pudełko obejmuje obszar zainteresowania (ROI) i eliminuje jak najwięcej martwej przestrzeni i zanieczyszczeń. Zmniejszy to zapotrzebowanie obliczeniowe na komputer.
   8. Użyj przycisku Trackball na pasku narzędzi przeglądarki, aby obrócić obiekt w przeglądarce 3D, upewniając się, że zwrot z inwestycji jest całkowicie objęty obwiednią. Gdy wszystko będzie zadowalające, kliknij OK w oknie przycinania odłożonym na bok w kroku 8.
   9. Wybierz ikonę danych i w module wyświetlacza wybierz opcję Ukośny wycinek (OBS). (Wyświetlacz > OBS)
   10. Wybierz OBS. W obszarze właściwości ustaw typ mapowania na liniowy, zakres okna danych od -200 do 10 000, a próbkowanie na najdokładniejsze. Teraz wybierz obróć w opcjach. Obserwuj przełącznik obracania na środku OBS.
   11. Wybierz przycisk interakcji na pasku narzędzi przeglądarki i użyj uchwytów przełącznika, aby dostosować płaszczyznę cięcia przekroju. Utwórz płaszczyznę strzałkową, która biegnie równolegle do korzeni zębów i prostopadle do powierzchni zgryzowej zębów. Płaszczyzna powinna przecinać trzy zęby trzonowe (M1-M3), jak pokazano na rysunku 2.
   12. Wyłącz obracanie i duplikuj OBS (obiekt>zduplikowany obiekt). Pojawi się nowy OBS o nazwie OBS 2. Włącz obracanie dla OBS 2.
   13. Użyj uchwytu obracania, aby zmienić orientację OBS 2 tak, aby był prostopadły do OBS 1 (patrz Rysunek 2).
   14. Wyłącz obracanie dla OBS 2 i utwórz 3 zduplikowane plasterki. Będą one nosiły nazwy OBS 3, 4 i 5.
4. Punkty wskazywania dla płaszczyzny Best Fit
   UWAGA: Kroki 3.4.1-3.4.5 opisują położenie 8 punktów wzdłuż CEJ, tworząc płaszczyznę najlepszego dopasowania. Wybierz cztery punkty z wycinków strzałkowych, a pozostałe cztery z wycinków koronalnych (patrz rysunek 3). Podczas wybierania punktów znajdujących się na wycinkach strzałkowych w ppkt 3.4.6 może być konieczne dostosowanie OBS 1.
   1. Wyrównaj OBS 1 ze środkiem najbardziej mezjalnego pierwiastka M1 w płaszczyźnie strzałkowej. Wyrównaj OBS 2 ze środkiem najbardziej mezjalnego korzenia M1 w płaszczyźnie koronalnej.
   2. Wyrównaj OBS 3 ze środkiem korzenia policzkowo-dystalnego M1 w płaszczyźnie koronalnej. W razie potrzeby wyreguluj OBS 1 tak, aby był w przybliżeniu wyśrodkowany z korzeniem policzkowo-dystalnym M1 w płaszczyźnie strzałkowej podczas wybierania punktów w kroku 20.
   3. Wyrównaj OBS 4 z furkacją korzeni policzkowych M2. OBS 4 powinien być wyśrodkowany między korzeniami policzkowo-mezjalnymi i policzkowo-dystalnymi M2. W razie potrzeby wyreguluj OBS 1 tak, aby był w przybliżeniu wyśrodkowany z korzeniem policzkowo-dystalnym M2 w płaszczyźnie strzałkowej podczas wybierania punktów w kroku 20
   4. Dostosuj OBS 5 tak, aby biegł wzdłuż środka M3 w płaszczyźnie koronalnej. W razie potrzeby dostosuj OBS 1 tak, aby był w przybliżeniu wyśrodkowany z najbardziej dystalnym pierwiastkiem M3 w płaszczyźnie strzałkowej podczas wybierania punktów w kroku 20.
   5. Zduplikuj dowolny z OBS (OBS 6) i wybierz opcję Dopasuj do punktów w oknie właściwości. Przełącznik dopasowania do punktów umożliwia badaczowi wybranie 3 lub więcej punktów na obiektach 2D lub 3D w przeglądarce, a następnie obliczanie płaszczyzny najlepszego dopasowania. W tym przypadku OBS 2D opisane w poprzednich krokach służą do wybrania 8 punktów wzdłuż CEJ.
   6. Ukryj OBS 6 w przeglądarce 3D, klikając pomarańczowe pole w prawym rogu ikony danych. Ukryj izopowierzchnię w przeglądarce 3D, aby CEJ był widoczny na wszystkich przekrojach 2D. Kliknij z wciśniętym Shift i wybierz 8 punktów wzdłuż CEJ, jak opisano powyżej.
      UWAGA: Jeśli Shift nie zostanie przytrzymany podczas wybierania punktów, płaszczyzna zostanie automatycznie obliczona po pierwszych trzech punktach.
   7. Po wybraniu wszystkich 8 punktów spraw, aby OBS 6 był widoczny. Zwróć uwagę, że jest to wycinek osiowy, który biegnie w przybliżeniu równolegle do płaszczyzny zgryzowej.
5. Transformacja i reorientacja UWAGA: Płaszczyzna najlepszego dopasowania służy do przekształcania danych w standardową orientację dla kolejnych pomiarów objętościowych.
   1. Kliknij pozycję Ikona danych>Compute>ApplyTransform. Ikona ApplyTransform pojawi się w obszarze puli. Kliknij biały kwadrat w rogu ikony ApplyTransform, wybierz odniesienie i kliknij OBS 6.
   2. W obszarze Właściwości wybierz standard dla metody interpolacji i rozszerzony dla trybu. Zastosuj przekształcenie.
   3. Utwórz izopowierzchnię i koronalny OBS dla nowego pliku danych. Obróć OBS w kierunku osiowym tak, aby był w przybliżeniu prostopadły do M1 (pokazano na rysunku 2). Użyj guzków zębów trzonowych i krzywizn zgryzu jako przewodnika.
   4. Użyj tej płaszczyzny, aby przekształcić dane, jak w krokach 3.5.1 i 3.5.2. Zapisz przekształcony plik danych.
6. Segmentacja i pomiar objętości kości
   UWAGA: Poniższe kroki opisują segmentację i pomiar kości wyrostka zębodołowego. Określa się przekrój odpowiadający płaszczyźnie najlepiej dopasowanej do CEJ i wybiera płaszczyznę odniesienia. Kość wyrostka zębodołowego między CEJ a płaszczyzną odniesienia na powierzchni policzkowej zębów trzonowych jest segmentowana i mierzona. Najbardziej mezjalny korzeń M1 i najbardziej dystalny korzeń M3 służą jako punkty orientacyjne w punktach końcowych. Ustawienie płaszczyzny odniesienia 15-20 warstw poniżej CEJ daje optymalne wyniki. Włączenie dodatkowych wycinków wprowadza zmienność, która maskuje różnice w objętości kości między grupami leczonymi.
   1. Otwórz Edytor segmentacji i utwórz nową etykietę dla przekształconych danych.
   2. Utwórz nowy materiał i nazwij go kością wyrostka zębodołowego.
   3. W obszarze Powiększenie i okno danych ustaw zakres danych od -200 do 10 000.
   4. W obszarze Wyświetlanie i maskowanie wybierz ikony celownika 2D, MPR 3D i renderowania objętościowego 3D. Ustaw zakres danych od 2 500 do 8 000. Włącz maskowanie danych.
   5. Wybierz ustawienie wyświetlania Czterech widzów z paska narzędzi przeglądarki. Wyświetlacz jest podzielony na cztery ćwiartki, co pozwala na jednoczesne badanie kaskadowych, czołowych i osiowych stosów obrazów, a także renderowanej objętości 3D.
   6. Użyj wszystkich czterech ćwiartek, aby zidentyfikować ostatni plasterek, w którym szkliwo jest widoczne na powierzchniach policzkowych M1 i M3. Lokalizacja ta odpowiada płaszczyźnie najlepiej pasującej do CEJ. Zapisz numer wycinka osiowego.
   7. W płaszczyźnie osiowej kontynuuj 15-20 plastrów w kierunku grzebienia kości wyrostka zębodołowego. Reprezentuje płaszczyznę odniesienia.
   8. Użyj dowolnej kombinacji narzędzi do segmentacji, aby wybrać kość wyrostka zębodołowego na powierzchni policzkowej zębów trzonowych między CEJ a płaszczyzną odniesienia. Użyj najbardziej mezjalnego korzenia M1 i najbardziej dystalnego korzenia M3 jako punktów orientacyjnych punktu końcowego.
   9. Gdy wszystko będzie zadowalające, dodaj zaznaczenie do kości wyrostka zębodołowego pod listą materiałów.
   10. Wróć do puli obiektów. Nowa ikona z rozszerzeniem ". Etykiety" powinny być dołączone do ikony danych obrazu. Wybierz ikonę Etykiety, a następnie z menu rozwijanego wybierz pozycję Materials>MaterialStatistics.
   11. W obszarze właściwości wybierz Materiał i naciśnij Zastosuj. Pojawi się tabela wyświetlająca kilka parametrów dla każdego materiału na liście materiałów. Zapisz objętość kości wyrostka zębodołowego.

4. Ocena miażdżycy

1. Rozwarstwienie aorty
   1. Poświęć mysz przez uduszenie CO₂ w pożądanym punkcie czasowym po infekcji.
   2. Umieść mysz na stronie grzbietowej, przyklej taśmę i przetrzyj mysz 70% EtOH. Przeciąć skórę po stronie brzusznej od środka brzucha do tuż nad wyrostkiem ksylifoidalnym.
   3. Przetnij skórę brzucha, aż widoczny będzie wyrostek ksylifoidalny. Podnieś wyrostek ksylufowy za pomocą małej pary kleszczy, wykonaj nacięcia po obu stronach klatki piersiowej i przetnij przeponę. Następnie wykonaj dwa nacięcia po obu stronach klatki piersiowej, aby odsłonić serce.
   4. Wykrwawić mysz za pomocą strzykawki insulinowej 27 G umieszczonej w wierzchołku prawej komory. Podczas pobierania krwi należy okresowo obracać igłę, aby zapobiec zablokowaniu otworu przez ścianę komory. Zazwyczaj za pomocą tej metody można uzyskać 0,8 - 1 ml krwi.
   5. sup>UWAGA: Oddzielić surowicę i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy IgG anty-P. gingivalis, jak opisano w innym miejscu⁹
   6. Użyj nożyczek, aby usunąć prawe przedsionek.
   7. Zlokalizuj lewą komorę po tylnej stronie serca. Wprowadzić igłę 21 G do wierzchołka lewej komory, skosem igły skierowanym do środka komory i powoli przepłukać układ krążenia 3 - 5 ml utrwalacza tkankowego.
   8. Odetnij tłuszcz i grasicę otaczające serce.
   9. Usuń płuca.
   10. Zlokalizuj łuk aorty z trzema gałęziami i usuń otaczające warstwy tłuszczu, aby uzyskać lepszą ekspozycję.
   11. Kontynuuj preparację aorty od łuku do podstawy przepony.
   12. Usuń wątrobę i przemieszcz tkankę jelitową, aby odsłonić aortę zstępującą. Wypreparuj dystalną aortę aż do gałęzi tętnicy nerkowej.
   13. Przeciąć tętnice nerkowe i kontynuować rozwarstwienie w dół do rozwidlenia jelita krętego.
   14. Gdy aorta jest wolna od większości tkanek łącznych, wróć na szczyt aorty i odetnij samą górną część trzech gałęzi aorty nad sercem.
   15. Obierz serce do góry, przecinając leżącą pod spodem tkankę tłuszczową, aby oddzielić serce od ciała.
   16. Przytrzymaj serce kleszczami i pociągnij w górę, przecinając tkankę łączną, która może być nadal przyczepiona, a następnie kontynuuj w dół do nerek i podążaj w dół do nóg i odetnij w najniższym możliwym punkcie.
   17. Utrwal aortę w 10% Formalinie przez 1 godzinę, a następnie przepłucz PBS przez 1 godzinę. Alternatywnie, przechowuj aortę w 10% Formalin O/N, spłucz w PBS następnego dnia i kontynuuj sekcję.
   18. Umieść aortę na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej PBS.
   19. Za pomocą lunety preparacyjnej ostrożnie usuń tkankę przybyszową z aorty.
   20. Gdy aorta jest wolna od nadmiaru tłuszczu i tkanki, odetnij dolne dwie trzecie serca. Zacznij odklejać mięsień sercowy na końcu serca po przeciwnej stronie łuku aorty. Powoli powinna pojawić się bańka aorty, która będzie miała białe zabarwienie.
   21. Kontynuuj staranną sekcję za pomocą dwóch kleszczy, aż bańki aorty będą wolne od tkanki mięśnia sercowego.
   22. Umieść oczyszczoną aortę w czarnej tacce preparacyjnej i przykryj PBS.
2. Przypinanie aorty
   1. Utrzymuj aortę pokrytą PBS przez cały czas przypinania.
   2. Ułóż aortę w pozycji anatomicznej z bańkami aorty po lewej stronie.
   3. Umieść tymczasowe szpilki minutowe w 5 miejscach, zaczynając od 1) górnej części aorty, 2) poniżej trzeciej gałęzi łuku, 3) w połowie aorty zstępującej, 4) w pobliżu dolnego końca aorty zstępującej, 5) powyżej gałęzi tętnicy udowej.
   4. Za pomocą bardzo cienkich nożyczek sprężynowych przeciąć lewą stronę aorty, zaczynając od lewej gałęzi tętnicy udowej aż do aorty do dolnej gałęzi aorty wstępującej.
   5. Ciąć od lewej strony najniższej bańki aortalnej w szczelinie i kontynuować cięcie, aż dojdzie do przecięcia cięcia wzdłuż pionowego cięcia aorty.
   6. Przetnij aortę poziomo, aby dotrzeć do punktu najniższej gałęzi aorty wstępującej
   7. Przeciąć w górę po prawej stronie do górnej gałęzi aorty.
   8. Odetnij każdą gałąź, aby odsłonić jej wewnętrzną powierzchnię.
   9. Usuń niektóre z tymczasowych szpilek i zastąp je stałymi szpilkami w celu przypięcia całej aorty w anatomicznym miejscu bez fałdowania, rozciągania aorty. Celem jest odsłonięcie wewnętrznej powierzchni aorty.
   10. Kontynuuj szpilkowanie, aż cała wewnętrzna powierzchnia aorty zostanie odsłonięta i wyraźnie widoczna z góry oraz wolna od wizualnych zakłóceń ze strony szpilek.
3. Barwienie lipidów i kwantyfikacja zmian
   1. Przygotować roztwór barwiący Sudan IV (5 mg/ml w 70% izopropanolu). Dobrze wymieszaj i przefiltruj, aby upewnić się, że nie ma kryształów.
   2. Zakryj przypiętą aortę w roztworze Sudan IV na 50 min.
   3. Myć 70% izopropanolem przez 1 - 5 min. Delikatnie płukać aortę ddH20, aż woda spływająca z aorty przestanie być czerwona.
   4. Zakryj aortę PBS. Przechwytuj obrazy aorty za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości podłączonej do mikroskopu preparacyjnego i zapisuj jako cyfrowe pliki obrazów (. Format TIFF). Umieść linijkę obok każdego obrazu, aby pomóc w kalibracji.
   5. Użyj oprogramowania ImageJ, aby określić obszar błony wewnętrznej i obszar zmian chorobowych. Ręcznie obrysuj powierzchnię błony wewnętrznej, aby określić powierzchnię. Obszar zmiany można obliczyć za pomocą automatycznego progowania kolorów. Wymaga to ustawienia progu w celu zdefiniowania intensywności koloru, która odróżnia zmiany chorobowe od normalnych obszarów.
   6. Oblicz procent powierzchni błony wewnętrznej pokrytej zmianami miażdżycowymi.

5. Ocena histologiczna zmian miażdżycowych

1. Zbierz łuk aorty z tkanką serca i zanurz w O.C.T. w jednorazowej formie bazowej.
2. Pobrać 5 μm seryjnych kriosekcji co 50 μm w zatoce aortalnej i tętnicy innominacyjnej za pomocą kriostatu ustawionego na -17 °C i zamontować skrawki tkanek na szkiełkach mikroskopowych. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
3. W celu oceny histologicznej wybarwić hematoksyliną i eozyną przy użyciu odpowiednich procedur.

6. Charakterystyka immunohistochemiczna zmian miażdżycowych.

Poniższe kroki opisują ogólny protokół oparty na przeciwciałach, rutynowo stosowany do oceny zmian miażdżycowych u myszy zakażonych P. gingivalis. Protokół ten wymaga optymalizacji dla każdego przeciwciała lub odczynnika.

1. Wyjmij szkiełka z zamrażarki i utrwalaj na 2 minuty w lodowatym utrwalaczu (acetonie lub innym utrwalaczu).
2. Pozwól, aby slajdy dotarły do RT i oznacz je pisakiem odpornym na rozpuszczalniki.
3. Przepłukać szkiełka 3x w PBS, aby usunąć matrycę zamrażania tkanek
4. Zablokować endogenną aktywność peroksydazy przez inkubację szkiełek w 0,3% roztworze H₂O₂ w PBS przez 10 minut.
5. Płukać szkiełka 3x w PBS przez 2 minuty za każdym razem.
6. Zablokować niespecyficzne wiązanie przez inkubację w buforze blokującym (10% surowicy króliczej w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:50 w 10% surowicy króliczej.
8. Nanieść rozcieńczone przeciwciało na skrawki tkanki na szkiełku.
9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Płucz szkiełka 3x w PBS przez 2 minuty każda.
11. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe przeciw szczurom w stosunku 1:100 w 10% surowicy króliczej.
12. Nakładać na skrawki tkanek na szkiełku i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
13. Płucz szkiełka 3x w PBS przez 2 minuty każda.
14. Przygotować roztwór substratu DAB, dodając 1 kroplę chromogenu DAB do każdego 1 ml buforu DAB.
15. Opróżnij PBS ze szkiełek i nałóż roztwór substratu DAB. Pozostaw szkiełka do inkubacji przez 5 minut lub do momentu osiągnięcia pożądanej intensywności koloru.
16. Umyć 3x w wodzie po 2 min.
17. Barwnik przeciwdziałający hematoksylinie.
18. Odwodnić się poprzez 4 zmiany alkoholu (95% 1 min, 95% 1 min, 100% 1 min i 100% 5 min).
19. Klarowny w 3 zmianach ksylenu.
20. Szkiełko nakrywkowe za pomocą roztworu montażowego i przeanalizować jakościowo za pomocą mikroskopii. W celu analizy ilościowej uzyskaj obrazy i oblicz obszar barwienia za pomocą ImageJ przy użyciu automatycznego progu.

7. Rezonans magnetyczny

1. Przygotowanie zwierząt do rezonansu magnetycznego
   1. Znieczulij myszy przed eksperymentami MRI. Przeprowadzić wstępną indukcję znieczulenia, używając 4% odparowanego izofluoranu przez 2-3 minuty w komorze indukcyjnej. Utrzymuj znieczulenie w okresie obrazowania, używając ciągłego przepływu 0,5 - 2% odparowanego izofluoranu dostarczanego przez stożek nosowy lub maskę.
   2. Po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia (tj. braku reakcji na uszczypnięcie palca), umieść mysz w uchwycie na zwierzę z nosem włożonym w stożek nosowy. Istnieje kilka rodzajów dostępnych na rynku uchwytów na zwierzęta, które można wykorzystać w celu zminimalizowania potencjalnego ruchu podczas obrazowania. Używamy specjalnie zaprojektowanego uchwytu z drążkiem do gryzienia.
   3. Monitoruj oddech i cykl pracy serca oraz synchronizuj z akwizycją obrazu za pomocą poduszki oddechowej (umieszczonej na brzuchu myszy) wyposażonej w system monitorowania i bramkowania małych zwierząt.
   4. Przymocuj mysz i system monitorowania do uchwytu na zwierzę za pomocą folii laboratoryjnej.
2. Akwizycja danych MRI
   1. Umieść uchwyt na zwierzę głową myszy do przodu w pozycji leżącej na plecach w pionowej sondzie 30 mm (Micro 2.5) utrzymywanej w temperaturze 23°C i w skanerze MRI 11.7 T z pionowym otworem.
   2. Wyrównaj uchwyt ze środkiem cewki RF.
   3. Przeprowadź proces podkładkowania za pomocą pojedynczej sekwencji impulsów.
   4. Korzystając z sekwencji RZADKIE, uzyskaj obrazy zwiadowcze wzdłuż trzech orientacji ortogonalnych, aby utworzyć obrazy osiowe, koronalne i strzałkowe.
   5. Wykonaj angiografię rezonansu magnetycznego (MRA) o niskiej rozdzielczości przy użyciu sekwencji echa gradientowego 3D o następujących parametrach: grubość płyty = 1,5 cm; kąt odwrócenia = 45°; czas powtarzania = 20 ms; czas echa = 2,2 ms; pole widzenia = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matryca = 64 × 64 × 64; liczba średniej = 1. Całkowity czas skanowania: 2∼3 min. Celem tego skanowania jest upewnienie się, że obrazy są pozyskiwane w obszarze docelowym (tętnicy nienazwanej).
   6. Wykonaj rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości tętnicy nienazwanej z niezałączoną sekwencją echa gradientowego 3D, używając następujących parametrów: grubość płyty = 1,5 cm; kąt odwrócenia = 45°; czas powtórzenia = 20 ms; czas echa = 2,2 ms; pole widzenia = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matryca = 128 × 128 × 128; liczba średniej = 4. Całkowity czas skanowania wyniósł ∼25 min.
   7. Uzyskaj ciągłe obrazy osiowe tętnicy bezimiennej 0,5 mm poniżej rozwidlenia podobojczykowego.
3. Analiza danych MRI
   1. Wykonuj rekonstrukcję i analizę obrazu za pomocą oprogramowania do obrazowania powiązanego ze skanerem. Osiągnij rekonstrukcję 3D obrazów MRA za pomocą projekcji o maksymalnej intensywności.
   2. Użyj bifurkacji podobojczykowej jako markera anatomicznego, aby wyrównać dane uzyskane od różnych myszy lub tej samej myszy w różnych punktach czasowych. Wybierz docelowy przekrój poprzeczny tętnicy nienazwanej w odległości od 0,3 do 0,5 mm poniżej bifurkacji podobojczykowej.
   3. Zdefiniuj i oblicz pole świetlne wybranego przekroju za pomocą ImageJ. Pomiary powinny być wykonywane w sposób zaślepiony przez dwóch niezależnych obserwatorów. Sprawdź odtwarzalność pomiaru, obliczając współczynniki korelacji międzyklasowej.
   4. W przypadku badań podłużnych z obrazowaniem seryjnym należy znormalizować obszar światła do obszaru światła uzyskanego na początku badania (pierwsza puszka w badaniu) dla każdej myszy. Wyraź wyniki jako zmianę obszaru świetlnego w czasie.
   5. Wykonaj odpowiednie analizy statystyczne (tj. test t-studenta) w celu określenia istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi.

Wyniki

Używając odpowiedniego modelu myszy i schematu infekcji jamy ustnej, P. gingivalis wywołuje przewlekłe zapalenie i immunopatologię w miejscach miejscowych (jama ustna) i ogólnoustrojowych (tętnice) (Rysunek 1).

U myszy infekcja jamy ustnej P. gingivalis wywołuje miejscową reakcję zapalną, która prowadzi do zniszczenia zęba podtrzymującego kość wyrostka zębodołowego⁸. Myszy zakażone P. gingivalis rozwijają odpowiedzi przeciwciał surowicy na...

Dyskusja

Model infekcji jamy ustnej P. gingivalis stanowi cenne narzędzie do badania przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogen w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych. Ten unikalny model pozwala na scharakteryzowanie zarówno mechanizmów specyficznych dla gospodarza, jak i patogenu, przyczyniających się do przewlekłego stanu zapalnego i immunopatologii. Ponadto model może być wykorzystywany do badań przesiewowych pod kątem nowych strategii terapeutycznych, w tym immunizacji i interwencji farmakologicznej. Kr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie do analizy Amira	Visualization Sciences Group
Komora beztlenowa DW Model naukowy MG500	Mikrobiologia Międzynarodowa
BHI	Becton-Dickinson
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadion (witamina K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Ekstrakt drożdżowy	Becton-Dickinson	212750
Karboksymetyloceluloza (średnia lepkość)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfametoksazol i trimetoprim zawiesina doustna 200 mg/40 mg na 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μ CT 40	Scanco
HistoChoice	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Spektrometr Avance 11,7T z pionowym otworem	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Szczur anty-myszy F4/80	Serotec	MCA497R
Szczur anty-mysz TLR2	eBioscience	13-9021-80
Luneta sekcyjna Leica
S4 Kriostat HM 550	Microm