Artykuł metodologiczny

Test transgenicznych gryzoni do ilościowego określania częstości mutantów męskich komórek rozrodczych

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51576

⸱

6 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada, Environmental Health Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Mutacje de novo w męskiej linii zarodkowej mogą przyczyniać się do niekorzystnych skutków zdrowotnych w kolejnych pokoleniach. W tym miejscu opisujemy protokół użycia transgenicznego modelu gryzoni do ilościowego określania mutacji w męskich komórkach rozrodczych wywołanych przez czynniki środowiskowe.

Streszczenie

Mutacje de novo pojawiają się głównie w męskiej linii zarodkowej i mogą przyczyniać się do niekorzystnych skutków zdrowotnych w kolejnych pokoleniach. Tradycyjne metody oceny indukcji mutacji komórek rozrodczych wymagają wykorzystania dużej liczby zwierząt, co czyni je niepraktycznymi. W związku z tym mutagenność komórek rozrodczych jest rzadko oceniana podczas badań chemicznych i oceny ryzyka. W niniejszym artykule opisujemy test mutacji męskich komórek rozrodczych in vivo przy użyciu transgenicznego modelu gryzonia, który jest oparty na niedawno zatwierdzonych wytycznych Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD). Metoda ta wykorzystuje test selekcji pozytywnej in vitro do pomiaru mutacji in vivo indukowanych w transgenicznym wektorze λgt10 zawierającym gen reporterowy bezpośrednio w komórkach rozrodczych narażonych samców. Dalej opisujemy, w jaki sposób wykrywanie mutacji w transgenie odzyskanym z komórek rozrodczych może być wykorzystane do scharakteryzowania specyficznej dla etapu wrażliwości różnych typów komórek spermatogennych na ekspozycję na mutageny poprzez kontrolowanie trzech parametrów eksperymentalnych: czasu ekspozycji (czas podawania), czasu między ekspozycją a pobraniem próbki (czas pobierania próbki) oraz populacji komórek zebranych do analizy. Ponieważ od jednego samca można pobrać dużą liczbę komórek rozrodczych, metoda ta ma wyższą czułość w porównaniu z tradycyjnymi metodami, wymaga mniejszej liczby zwierząt, a tym samym znacznie mniej czasu i zasobów.

Wprowadzenie

Sporadyczne mutacje DNA w linii zarodkowej mogą prowadzić do zmniejszenia sukcesu reprodukcyjnego, a jeśli są dziedziczone, mogą powodować choroby genetyczne lub zwiększoną predyspozycję do raka u potomstwa1-3. Istotne dowody wskazują, że duża część mutacji de novo jest dziedziczona z ojcowskiej linii zarodkowej4 oraz że liczba mutacji u potomstwa jest dodatnio skorelowana z wiekiem ojca w momenciepoczęcia5. Uważa się, że wyższy odsetek mutacji męskich jest wynikiem różnicy wieku podczas gametogenezy między płciami, większej liczby podziałów komórek spermatogennych w porównaniu z liczbą podziałów komórek oogenicznych w żeńskiej linii zarodkowej2 oraz postępującego spadku skuteczności naprawy DNA wraz z wiekiem u mężczyzn. Wszystkie te czynniki przyczyniają się do zwiększonego prawdopodobieństwa wystąpienia błędów replikacji w męskiej linii zarodkowej6. Jednak wpływ narażenia ojca na czynniki środowiskowe na częstość mutacji de novo pozostaje niepewny. Niemniej jednak wiadomo, że duża liczba czynników środowiskowych indukuje mutacje komórek rozrodczych u gryzoni7 i istnieje coraz więcej dowodów na to, że niektóre z tych czynników mogą również wpływać na ludzką linię zarodkową8. Pomimo tych obaw, substancje chemiczne są rutynowo testowane pod kątem ich zdolności do wywoływania mutacji w komórkach somatycznych w celach regulacyjnych i ogólnie zakłada się, że testy somatyczne są wystarczające do ochrony linii rozrodczej. W związku z tym substancje chemiczne rzadko są oceniane pod kątem ich zdolności do wywoływania mutacji komórek rozrodczych.

Jednym z powodów, dla których badanie mutagenności komórek rozrodczych zostało w dużej mierze pominięte w procesie podejmowania decyzji regulacyjnych, jest brak praktycznych metodologii. Tradycyjne metody oparte na gryzoniach, takie jak dominujące testy letalne9 i specyficzne locus10, szacują wskaźniki mutacji komórek rozrodczych poprzez ocenę zmutowanych fenotypów w zarodkach lub potomstwie narażonych rodziców. Testy te wymagają użycia bardzo dużej liczby zwierząt, czasu i zasobów w celu uzyskania statystycznie miarodajnych wyników.

Chociaż ostatnio pojawiło się kilka nowoczesnych metod ilościowego oznaczania mutacji komórek rozrodczych, wiele z nich ma braki pod względem praktyczności, efektywności i znaczenia biologicznego. Na przykład mutacje o długości powtórzeń w loci rozszerzonych prostych powtórzeń tandemowych (ESTR) można określić ilościowo w męskich komórkach rozrodczych przy użyciu metody PCR z pojedynczą cząsteczką15. Jednak wykonanie tej metody może być technicznie trudne i pracochłonne, a w przeciwieństwie do mutacji punktowych, biologiczne i zdrowotne znaczenie zmian w długości powtórzeń wysoce niestabilnych loci ESTR pozostaje niejasne16. Nowoczesne technologie sekwencjonowania całego genomu mogą dostarczyć wielu biologicznie znaczących danych, gdy zostaną zastosowane do problemu mutacji dziedzicznych4,17, ale wysokie koszty, wysokie poziomy błędów, związana z tym walidacja wymagana do potwierdzenia mutacji oraz wyzwania bioinformatyczne nadal ograniczają rutynowe stosowanie tej opcji w ramach możliwości testowania regulacyjnego18.

Tutaj opisujemy praktyczną metodę ilościowego oznaczania indukowanych mutacji bezpośrednio w komórkach rozrodczych transgenicznych samców myszy. Protokół ten jest opisany dla transgenicznego modelu MutaMouse, który ma wiele połączonych kopii rekombinowanego wektora fagowego λgt10 zawierającego gen reporterowy Escherichia coli lacZ zintegrowany z obiema kopiami chromosomu3 19 (Figura 1).

Ten protokół jest również istotny dla innych modeli transgenicznych gryzoni (TGR) opartych na tych samych zasadach (mysz i szczur BigBlue, lub mysz plazmidowa lacZ, itp.) lub nieco innych genów reporterowych (gpt delta myszy i szczura, modele TGR recenzowane w Lambert et al.).20). Metoda ta opiera się na teście mutacji TGR opisanym w niedawno wydanej i zmienionej wytycznej OECD dotyczącej badań21 i omawiamy specjalne względy wymagane do uwzględnienia oceny mutacji w męskiej linii zarodkowej ze względu na unikalne cechy spermatogenezy. Krótko mówiąc, test polega na wystawieniu transgenicznych samców myszy na działanie substancji mutagennej, a następnie czasie pobierania próbek, w którym zmiany przedmutacyjne są utrwalane w stabilne mutacje. W wybranym czasie pobierania próbek myszy są poddawane eutanazji, a komórki rozrodcze są pobierane z najądrza ogona lub kanalików nasiennych. Jak omówiono poniżej, skutki mutagenne w różnych fazach spermatogenezy można określić, wybierając czas między ekspozycją a pobraniem próbki. Transgeniczne inserje, składające się z wielu kopii genomu faga λ na komórkę, są izolowane z genomowego DNA komórki rozrodczej i pakowane w puste kapsydy λ fagów, tworząc zakaźne cząstki fagów λ, które są następnie wykorzystywane do zakażenia gospodarza E. coli. Zainfekowane bakterie są hodowane na selektywnych pożywkach, które mogą odróżnić komórki zawierające wektor ze zmutowaną kopią lacZ od komórek zawierających lacZ typu dzikiego. Mutagenne działanie ekspozycji na męską linię zarodkową określa się poprzez porównanie częstości występowania zmutowanych transgenów między myszami kontrolnymi i leczonymi (Figura 2, przejrzana w Lambert i wsp.20). Dużą liczbę komórek rozrodczych można oznaczyć za pomocą jednej myszy, co nadaje temu testowi większą czułość w porównaniu z tradycyjnymi metodami, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby wymaganych zwierząt. A ponieważ nie jest wymagany żaden specjalistyczny sprzęt ani szkolenie, test ten stanowi praktyczną i wydajną opcję testowania mutacji komórek rozrodczych w większości nowoczesnych laboratoriów toksykologicznych/biologii molekularnej.

Jednym z podstawowych wymagań dla skutecznego zastosowania testu mutacji komórek rozrodczych TGR jest zrozumienie cyklu plemnikotwórczego (Rysunek 3). Czas rozwoju komórek rozrodczych myszy od komórek macierzystych w kanalikach nasiennych do spermatogonii, spermatocytów, spermatyd i wreszcie do dojrzałości plemników w najądrzu (tj. spermatogenezy) wynosi około 49 dni. Mutacja może wystąpić w różnych fazach tego cyklu i często jest specyficzna dla związku. Dwie kluczowe cechy, które mają szczególne znaczenie dla mutagenezy w męskich komórkach rozrodczych, to zaprzestanie syntezy DNA podczas wczesnej mejozy oraz postępująca utrata zdolności naprawy DNA6 podczas późnej fazy po mejjozie, dwa procesy, które są wymagane do indukcji i utrwalenia większości mutacji.

Ze względu na te unikalne cechy spermatogenezy, istnieją trzy kluczowe zmienne eksperymentalne dla przeprowadzenia testu mutacji komórek rozrodczych TGR: (1) czas podawania badanego związku; 2) czas pobierania próbek; oraz (3) wybór populacji komórek rozrodczych do pobrania do analizy (rysunek 3 i tabela 1). Czas podawania jest zmienną eksperymentalną, która określa, jak długo komórki docelowe są wystawione na działanie badanych związków. Długość czasu podawania może być również wykorzystana do ukierunkowania ekspozycji na określone typy komórek lub fazy spermatogenezy. Na przykład jednodniowe podawanie może być wykorzystane do określenia wpływu ostrej ekspozycji na jeden konkretny typ komórek. Podobnie, ekspozycja może być skoncentrowana na całej fazie spermatogennej, na przykład poprzez celowanie tylko w spermatocyty dzielące się meiotycznie lub mitotyczne dzielenie spermatogonii przy użyciu 2-tygodniowego czasu podawania i odpowiedniego czasu pobierania próbek. Przewlekłe i podprzewlekłe czasy podawania stosuje się do oceny skutków długotrwałego narażenia, aby zapewnić wystarczającą dystrybucję farmakokinetyczną badanego związku lub umożliwić wystarczającą akumulację mutacji pochodzących ze słabych mutagenów (na przykład 28-dniowy czas podawania zalecany w wytycznych OECD dotyczących badań).

Czas pobierania próbek jest krytyczną zmienną określającą, w jakiej fazie spermatogenezy znajdowały się komórki docelowe w momencie ekspozycji. Czas pobierania próbek określa, ile czasu, a tym samym ile dalej w cyklu plemnikotwórczym, przechodzą komórki po ekspozycji. Na przykład, aby zbadać wpływ na spermatogonię komórek macierzystych, wymagany jest czas pobierania próbek >49 dni w przypadku pobierania w pełni dojrzałych plemników lub >42 dni w przypadku pobierania niedojrzałych komórek rozrodczych z kanalików nasiennych, aby upewnić się, że wszystkie pobrane komórki miały wystarczająco dużo czasu, aby rozwinąć się z odsłoniętych komórek macierzystych. Ważne jest, aby zauważyć, że czas pobierania próbek wynoszący co najmniej 70 dni byłby preferowany w celu wykazania rzeczywistego działania komórek macierzystych, aby zapewnić wystarczający czas na farmakokinetyczną dystrybucję substancji toksycznej, na eliminację komórek narażonych w późniejszych fazach spermatogenezy oraz uwzględnić okres tymczasowej bezpłodności, który może wystąpić ~ 6 tygodni po ekspozycji na wysoce mutagenne związki22. Podobnie, czas pobierania próbek wynoszący 21 dni zapewniłby, że plemniki pobrane z najądrza ogona właśnie zakończyłyby mejozę w ostatnim dniu ekspozycji.

Komórki rozrodcze mogą być pobierane jako dojrzałe plemniki z ogona najądrza lub jako mieszanina różnych typów komórek spermatogennych z kanalików nasiennych. Dojrzałe plemniki pozostają w ogonie przez ~3 dni, co umożliwia określenie ze względną dokładnością typu komórki lub fazy spermatogenezy, z której pochodzą plemniki dla danego projektu eksperymentalnego. W związku z tym analiza plemników ogonowych pozwala na wysoce ukierunkowane badania efektów mutacji specyficznych dla danego etapu. Z drugiej strony, zawiesiny komórkowe pobrane z kanalików nasiennych zawierają mieszaninę różnych typów komórek rozrodczych w różnych fazach rozwoju, a tym samym oferują gorszą rozdzielczość fazy spermatogennej, w której powstały mutacje. Ponadto zawiesiny komórkowe odzyskane z kanalików nasiennych mają tendencję do zawierania nadreprezentacji spermatydów, a następnie spermatocytów i bardzo mało spermatogonii i komórek macierzystych (proporcje te są reprezentowane przez stopniowane białe paski na rycinie 3). Ponadto zawiesiny przygotowane z kanalików nasiennych mogą również zawierać różne komórki somatyczne. Tak więc, ponieważ obecnych jest tak wiele typów komórek, na efekty mutacyjne mogą wpływać różne komórki niedocelowe. Jednak pobieranie próbek z kanalików nasiennych stanowi ekonomiczną opcję jednoczesnego badania przesiewowego wielu typów komórek rozrodczych oraz łatwą integrację analizy komórek rozrodczych ze standardowym protokołem testowym OECD w kierunku mutacji somatycznych.

Powtórzę, w zależności od potrzeb badacza, czas podawania, czas pobierania próbek i populacja pobranych komórek mogą być dostosowane do badania skutków ekspozycji w różnych typach komórek i na różnych etapach spermatogenezy. Dzięki starannemu doborowi tych zmiennych, eksperymenty mogą być projektowane do ukierunkowanych badań mechanistycznych lub do bardziej ogólnych celów testowania regulacyjnego.

Aby osiągnąć biegłość w teście, zalecamy użycie ostrego doustnego podania 100 mg/kg N-etylo-N-nitrozomocznika (ENU), a następnie 70-dniowego czasu pobierania próbek jako kontroli pozytywnej. Analiza plemników ogona jest zatem ukierunkowana na spermatogonialne komórki macierzyste (ryc. 3), które zazwyczaj wykazują 4-5-krotny wzrost częstości mutacji (MF) w porównaniu z grupą kontrolną po tej wysoce mutagennej dawce ENU. Należy zauważyć, że dawka ta wywołuje bezpłodność 6 tygodni po ekspozycji, dlatego może nie być odpowiednią dawką kontrolną w przypadku krótszych okresów pobierania próbek. Dawka ta spowoduje również wykrywalny wzrost MF w większości tkanek somatycznych20. Reprezentatywne wyniki przedstawione poniżej uzyskano po schemacie ostrej ekspozycji +70 z zastosowaniem trzech dawek ENU do 100 mg/kg włącznie.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące hodowli, utrzymania i obchodzenia się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami Health Canada.

1. Ekspozycje zwierząt

  1. Losowo rozmieść transgeniczne samce myszy (w wieku 8-12 tygodni) do grup kontrolnych i grup leczonych (min = 5 na grupę). Myszy należy potraktować badanym związkiem i odpowiednią kontrolą odpowiednią drogą narażenia dla wybranego czasu podawania. Wybierz odpowiedni czas pobierania próbek w zależności od rodzaju komórki spermatogennej (ryc. 3).
  2. Po upływie czasu pobierania próbek należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu izofluoranowym (lub inną odpowiednią metodą). Ostrożnie wyciągnij jądra z nacięcia w jamie brzusznej lub mosznie i wytnij najądrza ogona. (Ryc. 4, aby wyświetlić szczegółowy film przedstawiający pobieranie najądrzy, patrz Duselis i wsp.24). Alternatywnie, zbierz jądra, jeśli analizujesz komórki kanalików nasiennych. Zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

2. Izolacja i trawienie plemników ogona

  1. Rozmrozić najądrza ogona na lodzie. Rozmrożoną kaudę przenieść na szalkę Petriego i dokładnie zmielić skalpelem lub żyletką.
  2. Dodać 700 μl D-PBS o temperaturze pokojowej do szalki Petriego. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl o szerokim otworze, uwolnij plemniki z ogona, pobierając i uwalniając zawiesinę, aż D-PBS stanie się mętny od plemników (około 10 razy). UWAGA: Aby przygotować końcówkę do pipet o szerokim otworze, należy odciąć 2-3 mm od końca plastikowej końcówki do pipety.
  3. Przefiltruj zawiesinę przez filtr siatkowy ze stali nierdzewnej do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Przemyć szalkę Petriego dodatkowymi 700 μl D-PBS i przenieść do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml przez filtr siatkowy. Usuń siatkę, umieść rurkę na lodzie.
  4. Powtórzyć kroki 2.1-2.3 dla pozostałych próbek.
  5. Wirować próbki przy 11 000 x g przez 3 min. Ostrożnie zdekantować supernatant. Unikaj naruszania pelletu.
  6. Dodać 1,0 ml zimnego 1x soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC). Wirować, aż granulka zostanie całkowicie ponownie zawieszona. Czasami zajmie to kilka rund wirowania.
  7. Dodać 15 μl 10% SDS. Odwróć/energicznie potrząśnij przez 30 sekund, aby rozbić komórki nieplemnikowe. Zbyt delikatne potrząsanie spowoduje niewystarczające zakłócenia, a granulka nie uformuje się prawidłowo w następnym kroku.
  8. Wirować z prędkością 11 000 x g przez 2 min. Luźna, "puszysta" osadka wskazuje na niepełne rozerwanie komórek somatycznych z powodu niewystarczającego wstrząsania w kroku 2.7. Jeśli tak się stanie, po prostu ponownie potrząśnij próbką i ponownie zawiruj, aż utworzy się ciasna granulka. Ostrożnie zdekantować supernatant. Unikaj naruszania pelletu. Ponownie krótko odwirować i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  9. Dodaj 940 μl 0,2x zimnego SSC i wiruj, aż osad zostanie ponownie zawieszony. Ten śrut może być bardzo trudny do ponownego zawieszenia i może zająć kilka rund wirowania. Czasami grudki plemników są nieuniknione.
  10. Dodać 120 μl β-merkaptoetanolu, 100 μl 10% SDS, 20 μl 0,5M EDTA, pH 8 i 20 μl proteinazy K (60 mg/ml, przygotowanej na świeżo). Dobrze wymieszać i trawić przez noc z rotacją w temperaturze 37 °C. Przejść do ekstrakcji fenolem/chloroformem.

3. Ekstrakcja fenolu/chloroformu DNA z plemników ogonowych

UWAGA: Ponieważ jądrowe DNA w późnych fazach spermatyd i dojrzałych plemników jest skompleksowane protaminami i jest wysoce skondensowane w porównaniu do DNA komórek somatycznych, konwencjonalne metody izolacji kwasów nukleinowych nie wygenerują DNA o wystarczającej wydajności i czystości, aby test mutacji działał efektywnie. Wielokrotne ekstrakcje fenolu i chloroformu po agresywnym trawieniu są wymagane w celu uwolnienia i oczyszczenia DNA plemników (w oparciu o metody z15).

  1. Przenieś trawienie plemników do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  2. Dodać 2 ml mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1). Obracaj rurkę z prędkością 22 obr./min przez 3 min.
  3. Wirować przy 1 600 x g przez 10 minut i przenieść wodną warstwę wierzchnią wraz z rozmytą warstwą granicy faz do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3 3x, ale zmieniając czasy obrotu odpowiednio na 3 min, 4 min i 6 min. W ostatnim powtórzeniu unikaj przenoszenia jakiejkolwiek "rozmytej" warstwy interfejsu.
  5. Po 4 ekstrakcji dodać 70 μl 3M NaAc o pH 5,2 na 1 ml ekstraktu wodnego i 2 ml chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1). Obracaj rurkę z prędkością 22 obr./min przez 12 min.
  6. Wirować przy 1 600 x g przez 10 minut i przenieść wodną warstwę wierzchnią do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  7. Wytrącić DNA, dodając 2 objętości absolutnego etanolu i delikatnie obracając rurkę na bok, delikatnie kołysząc.
  8. Zbierz DNA, nawijając je na końcówkę zgrzewanej termicznie pipety pastwiskowej. Wypłucz DNA, obracając końcówkę pipety w 70% etanolu i susz na powietrzu przez 5 minut.
  9. Po ekstrakcji rozpuścić osad DNA w 40 - 100 μl buforu Tris-EDTA o pH 8. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Pozostawić DNA do rozpuszczenia w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa dni przed przystąpieniem do testu mutacji lacZ. W przypadku wystąpienia problemów z rozpuszczalnością, DNA można rozpuścić w temperaturze 65 °C przez 15 minut przed użyciem. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru przy A260 i upewnić się, że stężenie rozpuszczonego DNA mieści się w przedziale 200-2,000 ng/μl.

4. Izolacja i trawienie komórek rozrodczych z kanalików nasiennych

  1. W przypadku zamrożenia jądra rozmrażać na lodzie (około 1 godziny). Przenieść testis na zmieloną szklaną płytkę.
  2. Przytrzymaj jeden koniec jądra parą kleszczy. Na drugim końcu jądra przebić otwór w torebce nabłonka za pomocą innej pary kleszczy lub nożyczek preparacyjnych (ryc. 5A). Przeciśnij kanaliki nasienne przez nakłucie i wyrzuć torebkę nabłonkową (ryc. 5B).
  3. Dodać 500 μl D-PBS o temperaturze pokojowej do zdekapslowanych kanalików nasiennych.
  4. Ustaw wałek tkankowy (guma silikonowa ściśle dopasowana do swobodnie obracającej się rurki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm lub podobnego urządzenia) tak, aby jeden koniec stykał się z płytką pod przybliżonym kątem 5-10° (rysunek 5C). Nie wywierając żadnego nacisku, delikatnie przesuwaj wałek do przodu iz powrotem po kanalikach, aż zostaną spłaszczone, a D-PBS stanie się mętny z uwolnionymi komórkami (około 5-10 razy).
  5. Dodaj kolejne 500 μl D-PBS na kanaliki i delikatnie przetocz przez kanaliki jeszcze kilka razy.
  6. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, minimalizując ilość przenoszonych kanalików (ryc. 5D).
  7. Powtórz kroki 4.5-4.6, aby w razie potrzeby zebrać więcej komórek.
  8. Odczekaj 1-2 minuty, aż przypadkowo zebrane kanaliki osiądą na dnie probówki. Przenieść D-PBS do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml, pozostawiając osadzone kanaliki (około 100 μl D-PBS). Niewielką porcję tej zawiesiny można sprawdzić pod mikroskopem (kontrast fazowy) w celu oceny składu populacji komórek.
  9. Wirować komórki w temperaturze 11 000 x g przez 30 sekund. Ostrożnie zdekantować supernatant, nie naruszając osadu. W tym momencie w tym momencie osad komórkowy można w tym momencie zamrozić w temperaturze -80 °C.
  10. W razie potrzeby rozmrozić komórki. Przenieść do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do lizy (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg/ml proteinazy K, 1% SDS). Trawienie przez noc w inkubatorze z rotacją w temperaturze 37 °C.
  11. Przejdź do ekstrakcji fenolem/chloroformem.

5. Ekstrakcja fenolu/chloroformu DNA z komórek rozrodczych kanalików nasiennych

UWAGA: Mniej agresywna ekstrakcja jest używana do izolowania DNA komórek rozrodczych kanalików nasiennych, ponieważ te typy komórek nie przeszły jeszcze przez kondensację jądrową.

  1. Dodać 5 ml mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1) do nocnego trawienia komórek kanalików nasiennych. Obracaj rurkę z prędkością 22 obr./min przez 20 min.
  2. Wirować przy 1 600 x g przez 10 minut i przenieść wodną warstwę wierzchnią, unikając "rozmytej" warstwy międzyfazowej, do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Dodać 100 μl 5 M NaCl na 5 ml ekstraktu wodnego (zwykle odzyskuje się 5 ml)
  4. Dodać 5 ml chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1). Obracaj rurkę z prędkością 22 obr./min przez 12 min.
  5. Wirować przy 1 600 x g przez 10 minut i przenieść wodną warstwę wierzchnią do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Wytrącić DNA, dodając 2 objętości absolutnego etanolu i delikatnie obracając i odwracając probówki.
  7. Zbierz DNA, nawijając je na końcówkę zamkniętej pipety pastwiskowej. Wypłucz DNA, obracając końcówkę pipety w 70% etanolu i susz na powietrzu przez 5 minut.
  8. Rozpuść DNA w 40-100 μl buforu Tris-EDTA, pH 8. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Pozostawić DNA do rozpuszczenia w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa dni przed przystąpieniem do oznaczania mutacji lacZ (patrz krok 3.9). W przypadku wystąpienia problemów z rozpuszczalnością, DNA można rozpuścić w temperaturze 65 °C przez 15 minut przed użyciem. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru w temperaturze A260 i upewnić się, że stężenie wynosi od 200 do 2 000 ng/μl.

6. Test mutacji LacZ

Zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze może wpływać na wydajność pakowania, a także na wzrost płytki nazębnej i nacinanie. Dlatego tak ważne jest, aby przeprowadzić test lacZ przy użyciu odpowiednich środków aseptycznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu reakcji pakowania, kultury gospodarza i pożywki wzrostowej.

  1. Dzień przed testem: Przygotować dolny agar i posiew przez noc
    1. Na próbkę wymagane jest osiem płytek (4 płytki do oceny mutantów, 4 płytki do liczenia miana) zawierających 8 ml dolnego agaru każda na próbkę (tj. 64 ml na próbkę). Dolny agar jest identyczny zarówno dla płytki zmutowanej, jak i płytki do liczenia miana. Przygotować dolny agar w ilości wystarczającej do liczby przetwarzanych próbek. Aseptycznie przelać na szalki Petriego o średnicy 90 mm (8 ml na szalkę) i pozostawić agar do zestalenia. UWAGA: Dolne płytki agarowe można przygotować do 1 tygodnia wcześniej.
    2. Do probówki o pojemności 50 ml dodać 10 ml bulionu LB, 100 μl 20% roztworu maltozy, 25 μl ampicyliny (20 mg/ml) i 20 μl kanamycyny (5 mg/ml). Zaszczepić bakterią E. coli (lacZ-/galE-)25 i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 240 obr./min.
  2. Dzień 1: Komórki subkultury
    1. Subhodowla komórek, przygotowując rozcieńczenie nocnej kultury w stosunku 1:100 w świeżym LB (bez antybiotyków). Na próbkę potrzebna jest objętość 8 ml subkultury. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 240 obr./min przez około 3,5 godziny, aż OD600 = 1.
    2. Gdy OD600 = 1, podzielić zawiesinę komórek równomiernie na probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 300 x g w temperaturze 15 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w połowie pierwotnej objętości (tj. 4 ml na próbkę) LB zawierającej 10 mMMgSO4. Odłóż komórki na bok, aż będą potrzebne [krok 6.2.4.3].
  3. Dzień 1: Pakowanie DNA w cząstki faga lambda
    1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 30 °C.
    2. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 10 μl przenieś 4 μl DNA do probówki o pojemności 1,5 ml. UWAGA: Ten krok można wykonać dzień lub więcej wcześniej, aby skrócić czas przygotowania.
    3. Rozgrzej pierwszą probówkę (czerwoną) z zestawu do ekstrakcji fagów (1 probówka na każde 2 próbki). Krótko zakręć, aby zebrać ekstrakt na dnie tuby.
    4. Przenieść 4,8 μl ekstraktu z opakowania z pierwszej probówki do próbki DNA i wymieszać, delikatnie mieszając końcówką pipety. Krótko odwirować próbki w probówkach. Inkubować przez 1,5 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C.
    5. Rozgrzej drugą (niebieską) probówkę z ekstraktem opakowania (1 tubka na ~15 próbek). Krótko zakręć, aby zebrać ekstrakt na dnie tuby.
    6. Przenieść 4,8 μl ekstraktu z opakowania z drugiej probówki do próbki DNA i wymieszać, delikatnie mieszając. Krótko odwirować próbki w probówkach. Inkubować przez dodatkowe 1,5 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C.
    7. Ponownie zawiesić upakowane cząstki fagów w buforze SM o pojemności 500 μl i mieszać, obracając przez 30 minut z prędkością 20 obr./min.
    8. Po obróceniu należy krótko zawirować próbki i odwirować przy 11 000 x g przez 30 sekund, aby pobrać próbki na dnie probówek. Cząsteczki fagów są gotowe do infekcji [krok 6.2.4].
  4. Dzień 1: Przygotuj górny agar
    1. Przygotować oddzielny górny agar dla płytek mianowych i płytek selekcyjnych mutantów. Każda próbka wymaga 4 płytek mianowych i 4 zmutowanych płytek. Każda płytka wymaga 8 ml górnego agaru. Dodać środek selektywny fenylo-β-D-galaktopiranozyd (P-Gal) tylko do górnego agaru selekcyjnego ze mutacją. Przygotować oba górne agary z wyprzedzeniem (w dniu testu) i utrzymać w temperaturze 50 °C przed dodaniemMgSO4 do obu górnych agarów i P-Gal do zmutowanego agaru selekcyjnego.
  5. Dzień 1: Infekowanie komórek za pomocą pakowanego faga i posiewanie
    1. Oznaczyć dwie probówki o pojemności 50 ml na próbkę: 1 probówka ze "zmutowanym" pierwiastkiem na próbkę i 1 probówka z "mianem" na próbkę
    2. Oznaczyć 8 płytek agarowych na próbkę: 4 "zmutowane" płytki na próbkę i 4 płytki "mianowe" na próbkę
    3. Podwielokrotność 2 ml zawieszonych komórek [z kroku 6.2.1.2] do każdej probówki.
    4. Dodać 500 μl upakowanych cząstek fagów [z kroku 6.2.2.8] do "zmutowanej" probówki o pojemności 50 ml (zawierającej komórki). Delikatnie wymieszaj i pozwól cząsteczkom faga infekować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Po 30 minutach na krótko zawirować zakażone komórki i przenieść 15 μl zakażonych komórek do odpowiedniej probówki o pojemności 50 ml z "mianem" (zawierającej komórki).
    6. Do próbki miana płytki dodać 30 ml ciepłego (50 °C) górnego agaru z "mianem" (NIE zawierającym P-Gal) do probówki o średnicy 50 ml z "mianem". Natychmiast rozprowadzić mieszaninę agar/komórka na 4 płytki "miana" (~8 ml na płytkę). Pracuj szybko, aby górny agar nie ostygł w pipetach i staraj się nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.
    7. Następnie ułóż "zmutowane" próbki. Upewnij się, że P-Gal jest dodany do górnego agaru "selekcja mutantów". Dodać 30 ml ciepłego agaru "selekcja mutantów" (zawierającego P-Gal) do "zmutowanej" probówki o pojemności 50 ml. Natychmiast rozprowadź mieszaninę agaru/komórek na 4 "zmutowane" płytki (~8 ml na płytkę).
    8. Pozostawić płytki do zastygnięcia (~15 min), a następnie odwrócić i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  6. Dzień 2: Liczenie tabliczek
    1. Po całonocnej inkubacji policz liczbę blaszek na płytkach ze mutantem i mianem. W przypadku dużej liczby blaszek należy policzyć tylko część płytki, aby oszacować całkowitą liczbę (np. często 1/4 płytki mianowej będzie miała od 100 do 200 blaszek). Podczas liczenia części talerza należy policzyć co najmniej 100 tabliczek na talerzu.
    2. Oblicz liczbę jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) na μl komórek. Odbywa się to poprzez podzielenie liczby blaszek na płytkach "mianowych" przez objętość posianych komórek (15 μl).
    3. Liczbę PFU/μl należy wykorzystać do oszacowania całkowitej liczby PFU w całkowitej objętości zakażonych komórek posianych na "zmutowanych" płytkach (PFU/μl *[2 ml komórek + 0,5 ml upakowanych cząstek fagowych – 15 μl dla płytek mianowych]).
    4. Oszacuj MF, dzieląc całkowitą liczbę zmutowanych blaszek zliczonych na 4 "zmutowanych" płytkach przez szacowaną całkowitą liczbę PFU w całkowitej objętości zakażonych komórek oznaczonej na podstawie płytek "mianowych".
  7. Gdy spontaniczny lacZ MF jest rzędu 3 x 10-5 w grupie kontrolnej, tak jak w przypadku komórek rozrodczych MutaMouse, wytyczne OECD zalecają co najmniej 125 000 do 300 000 niezmutowanych PFU na zwierzę poddać badaniu przesiewowemu pod kątem mutacji w celu uzyskania wiarygodnego sygnału wyjściowego. Inne modele transgeniczne mogą mieć niższy spontaniczny MF, w którym to przypadku wymagana byłaby większa liczba PFU. Można przeprowadzić statystyczny test mocy w celu określenia minimalnej liczby PFU i zwierząt wymaganych do uzyskania pożądanej rozdzielczości. Dane z wielu powtórzeń mogą być łączone w celu spełnienia tego minimalnego wymogu PFU, pod warunkiem że nie prowadzą one do znacząco różnych częstości występowania mutacji.

7. Statystyki

Jednostką eksperymentalną do analizy jest mysz. Dane uzyskane z tego testu na ogół nie mają rozkładu normalnego. W związku z tym należy wybrać metodę statystyczną do analizy na podstawie charakterystyki rozkładu danych.

UWAGA: Standardowe analizy parametryczne (np. ANOVA) mogą być stosowane, jeśli zastosuje się odpowiednią transformację danych w celu wyrównania wariancji odpowiedzi w całym zakresie obserwacji. Analizy Poissona lub regresji dwumianowej są często bardziej odpowiednie. Można również zastosować analizę nieparametryczną. Rutynowo stosujemy regresję Poissona przy użyciu procedury uogólnionego modelu liniowego (tj. Proc GENMOD) w SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC), jak opisano przez Lemieux i wsp. 26.

Wyniki

Przy średniej liczbie 200 000 placków na zwierzę, w grupach kontrolnych zazwyczaj obserwujemy średnią tła MF wynoszącą około 2,8 x 10-5 w męskich komórkach płciowych, przy odchyleniu standardowym 1,7 x 10-5 (na podstawie danych z ośmiu niezależnych eksperymentów). Przy takiej liczbie placków, poziomie tła i wariancji, grupy dawek z n = 5 zwierząt w każdej są wystarczające do wykrycia 2-krotnego wzrostu MF z mocą >0,8.

Wyniki są zazwyczaj przedstawiane w formacie tabelarycznym lub graficznym. Tabela 2 oraz Rysunek 6 przedstawiają reprezentatywne wyniki dla plemników z ogona nasiadnika samców MutaMouse (n = 5 na grupę), które zostały poddane jednorazowej ostrej dawce doustnej 0, 25, 50 i 100 mg/kg N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), a następnie poddane pobraniu próbek po 70 dniach. Ten 70-dniowy okres umożliwia pomiar zdarzeń mutacyjnych, które wystąpiły w plemnikach będących w czasie ekspozycji komórkami macierzystymi spermatogoniami (Rysunek 3). Typowe gęstości plamiek na płytkach mutacyjnych i mianowanych przedstawiono na Rysunku 7. Jak pokazano w Tabeli 2 i na Rysunku 6, ostra ekspozycja na ENU wywołała istotny, zależny od dawki wzrost MF komórek macierzystych spermatogoniami. Niska dawka spowodowała istotny 2,6-krotny wzrost w porównaniu z grupą kontrolną, która miała bazowe MF na poziomie 2,6 x 10-5. Maksymalna indukcja wystąpiła przy wysokiej dawce, która wywołała 4,4-krotny wzrost względem kontroli.

Przykład tego testu przeprowadzonego na komórkach zarodkowych kanalików nasiennych można znaleźć w pracy Douglasa et al.27, w której określono MF w komórkach zarodkowych kanalików w różnych odstępach czasu po powtarzanych przez 5 dni wstrzyknięciach domięśniowych 50 mg/kg ENU. W tym badaniu częstość mutacji w komórkach kanalików nasiennych wzrastała do 15 dni po zastosowaniu preparatu, a następnie pozostała na stałym poziomie.

Schemat ekspozycjiPobrana tkankaPobrany typ komórek (komórka docelowa)Faza komórki docelowej na początku ekspozycjiFazy przebiegłe podczas ekspozycji
Acute+70CaudaDojrzałe plemnikiKomórka macierzystaKomórka macierzysta
14+21CaudaDojrzałe plemnikiSpermatogoniaSpermatyda
14+35CaudaDojrzałe plemnikiKomórka macierzystaSpermatocyt
28+3CaudaDojrzałe plemnikiSpermatocytSpermatocyt
Spermatyda
Dojrzałe plemniki
KanalikiKomórka macierzystaKomórka macierzystaKomórka macierzysta
SpermatogoniaSpermatogoniaSpermatogonia
SpermatocytSpermatocyt
SpermatydaSpermatyda
28+49CaudaDojrzałe plemnikiKomórka macierzystaKomórka macierzysta
KanalikiKomórka macierzysta
Spermatogonia
Spermatocyt
Spermatyda		Komórka macierzystaKomórka macierzysta

Tabela 1. Typy komórek i fazy spermatogenezy, które są celem transgenicznego testu mutacyjnego u gryzoni w różnych schematach eksperymentalnych.

Grupa dawkowaniaZwierzę nrMutant PFUCałkowita liczba PFUMF (x 10-5)Śr. MF (x 10-5)Krotność zmianywartość p
Kontrola151802452.82.61.0-
241378352.9
3113856722.9
424313960.5
561524133.9
25 mg/kg61716235310.56.92.60.0002
7141500949.3
841544012.6
991544015.8
10121969786.1
50 mg/kg111715572710.99.33.6<0.0001
12111358478.1
132519349912.9
14121338599.0
15142528075.5
100 mg/kg162617096815.211.54.4<0.0001
172823458411.9
18101452896.9
193529223612.0
202219084811.5

Tabela 2. Częstość mutacji lacZ w plemnikach z ogona naskrotnia u transgenicznych myszy samców narażonych doraźnie na ENU w fazie komórek macierzystych spermatogoniów (czas podania = 1 dzień, czas pobrania próbek = 70 dni). PFU = jednostka tworząca plak, MF = częstość mutacji.

Mapa genetyczna faga Lambda, pokazująca LacZ i cII, schemat wyróżniający segmenty genów i pary zasad.
Rycina 1. Schematyczny obraz konstrukcji faga λgt10.

Schemat procesu częstotliwości mutacji przedstawiający etapy ekstrakcji DNA, pakowania wirusów oraz infekcji bakterii.
Rysunek 2. Schemat testu mutacji komórek zarodkowych u gryzoni transgenicznych.

Oś czasu dojrzewania plemników, schemat ekspozycji faz komórkowych, synteza DNA, projekt eksperymentalny dla jąder.
Rysunek 3. Schemat spermatogenezy u myszy oraz typów i faz komórek będących celem testu mutagenezy u gryzoni transgenicznych w różnych projektach eksperymentalnych. UWAGA: Stopniowane białe paski reprezentują względną proporcję typów komórek obecnych w zawiesinach komórkowych przygotowanych z kanalików nasiennych (tzn. spermatydy > spermatocyty > spermatogonia > komórki macierzyste). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający odsłonięcie jądra i najądrza za pomocą nacięcia nożyczkami.
Rysunek 4. Pobieranie ogona najądrza u myszy. A) Wykonać nacięcie w obrębie brzucha w kierunku moszny. B) Zidentyfikować poduszkę tłuszczową najądrza. C) Delikatnie pociągnąć poduszkę tłuszczową, aby wysunąć jądra i najądrza. D) Zlokalizować i wyciąć ogon najądrza.

Przygotowanie próbki tkanki do analizy mikroskopowej, sekwencja przedstawia ekstrakcję, manipulację i krojenie.
Rycina 5. Przygotowanie zawiesiny komórek zarodkowych z kanalików nasiennych. A) Wykonuje się nacięcie torebki nabłonkowej jądra, odsłaniając kanaliki nasienne. B) Kanaliki nasienne są wyciskane z torebki. C) Wałek do tkanek jest delikatnie prowadzony po kanalikach pod kątem 5-10°, aby uwolnić zawarte w nich komórki zarodkowe. D) Zawiesina komórek zarodkowych jest zbierana do dalszej obróbki.

Wykres częstotliwości mutacji w zależności od dawki; częstotliwość mutacji wzrasta wraz z dawką w mg/kg, analiza naukowa.
Rycina 6. Graficzna prezentacja częstotliwości mutantów lacZ w plemnikach myszy MutaMouse, których komórki macierzyste zostały poddane ostrej ekspozycji na ENU (n = 5). Każdy trójkąt reprezentuje MF jednego zwierzęcia.* p <0.05 określone za pomocą regresji Poissona.

Porównanie wzrostu bakterii na płytkach agarowych; mutant vs miano; analiza hodowli drobnoustrojów.
Rycina 7. Reprezentatywne płytki agarowe z testu mutacji u gryzoni transgenicznych z plakami utworzonymi na trawniku bakterii gospodarza E. coli. A) Płytki „mutant” będą miały bardzo mało plaków (oznaczonych strzałkami), szczególnie w grupach dawki kontrolnej, gdzie na niektórych płytkach sporadycznie nie wystąpią żadne plaki. B) Płytki „miano” mogą zawierać setki plaków.

Dyskusja

W porównaniu z tradycyjnymi metodami, test mutacji komórek rozrodczych TGR zapewnia szybszy, bardziej ekonomiczny i bardziej czuły sposób ilościowego określania indukowanych mutacji komórek rozrodczych in vivo . Oceniając transgen MF bezpośrednio w plemnikach, w przeciwieństwie do potomstwa, liczba zwierząt, czas i zasoby wymagane do oceny mutagenności linii zarodkowej dowolnego pojedynczego związku są znacznie zmniejszone. Jeśli chodzi o czułość, byliśmy w stanie wykryć znaczący 2,6-krotny wzrost MF spermatogonii stem cell po ekspozycji na 25 mg/kg ENU przy użyciu tylko 5 zwierząt na grupę dawkowania. W przeciwieństwie do tego, specyficzny test locus nie był w stanie wykryć żadnej znaczącej zmiany MF przy tej samej dawce przy użyciu >3 000 myszy w grupie narażonej i > 500 000 myszy kontrolnych28.

Oprócz przydatności zarówno do badań mechanistycznych, jak i regulacyjnych, metoda ta daje możliwość badań porównawczych między wskaźnikami mutacji w linii somatycznej i zarodkowej. Najnowsze dowody sugerują, że w przypadku niektórych czynników mutacje komórek rozrodczych mogą być indukowane w stężeniu niższym niż wymagane dla mutacji somatycznej. Na przykład długotrwałe narażenie na N-hydroksymetyloakrylaamid, metabolit rakotwórczego akrylamidu12 w żywności, zwiększa częstość dominujących śmiertelnych mutacji komórek rozrodczych u myszy bez wpływu na częstość występowania mikrojąder w czerwonych krwinkach, co jest tradycyjną miarą cytogenetycznego uszkodzenia komórek somatycznych13. Dodatkowo, narażenie myszy zarówno na dym tytoniowy głównego nurtu, jak i bocznego powoduje podwyższone częstości mutacji w tandemowych powtórzeniach loci DNA w plemnikach w dawkach, które nie zwiększają częstości mikrojąder krwi14. Odkrycia te podważają założenie, że badania genotoksyczności somatycznej zawsze chronią linię zarodkową i wzmacniają zapotrzebowanie na bardziej wydajne i opłacalne metody ilościowego określania częstości mutacji komórek rozrodczych. Dowody na istnienie preferencyjnych mutagenów komórek rozrodczych są jednak nadal słabe, głównie ze względu na brak dostępnych danych umożliwiających porównanie wskaźników mutacji w tkankach komórek somatycznych i rozrodczych. Test mutacji TGR umożliwia równoległe testowanie i porównywanie wskaźników indukowanych mutacji w wielu tkankach przy użyciu tego samego transgenu. W związku z tym porównawcze badania mutacji z wykorzystaniem testu TGR pomogłyby wypełnić luki w danych dotyczące możliwości preferencyjnego wpływu na komórki rozrodcze.

Jednoczesna ocena mutacji somatycznych i rozrodczych na potrzeby badań regulacyjnych również poprawiłaby wydajność poprzez zmniejszenie liczby wymaganych zwierząt. Wytyczne OECD dotyczące mutacji somatycznych zalecają 28-dniowy czas podawania, a następnie trzydniowy czas pobierania próbek (28+3). Analiza plemników ogona może wykazywać słabą czułość w tym punkcie czasowym, ponieważ jest ukierunkowana na komórki narażone głównie podczas faz spermatogenezy spermatocytów i spermatyd (ryc. 3). Komórki w tych fazach nie syntetyzują DNA i stopniowo tracą zdolność do naprawyDNA6. Co więcej, pobranie próbek plemników ogonowych w tym momencie nie wykryłoby mutacji występujących w spermatogonii i komórkach macierzystych. W związku z tym, w celu włączenia do projektu 28+3, wytyczne OECD zalecają pobieranie komórek rozrodczych z kanalików nasiennych. Ta mieszana populacja zawiera komórki pochodzące z syntezy DNA i napraw sprawnych typów komórek, w tym komórek macierzystych, i są narażone na działanie w większości faz spermatogennych. Jednak ze względu na mieszany charakter tych komórek, analiza komórek kanalików nasiennych nie dostarcza informacji specyficznych dla fazy. Ponadto istnieje obawa, że obecność komórek niebędących komórkami docelowymi może wpływać na obserwowane MF (np. fałszywie dodatnie wywołania mutagenu komórek rozrodczych z powodu zanieczyszczenia zmutowanych komórek somatycznych lub rozcieńczenie sygnału zmutowanej komórki rozrodczej z komórek rozrodczych z niedoborem naprawy DNA). Obecnie nie ma wystarczających danych, aby stwierdzić, czy wyniki z komórek kanalików nasiennych w wieku 28 + 3 oferują taką samą czułość i swoistość jak plemniki ogona w późniejszych punktach czasowych. Nasze laboratorium porównuje obecnie indukowane MF w komórkach kanalików nasiennych i plemnikach ogona pobranych po różnych okresach pobierania próbek, aby rozwiązać ten problem. Zwracamy uwagę, że wytyczne OECD sugerują alternatywny czas pobierania próbek wynoszący 28 dni dla wolno dzielących się tkanek, takich jak wątroba, które mogą być również odpowiednie do analizy komórek rozrodczych. Niemniej jednak dostępne dane są nadal niewystarczające i obecnie nie jesteśmy w stanie zalecić jednego projektu eksperymentalnego do jednoczesnej analizy komórek somatycznych i komórek rozrodczych przy użyciu testu mutacji TGR do badań regulacyjnych.

Jedną z cech tego testu, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, że zdarzenia mutacyjne są oceniane na transgenie innym niż mysie. Istnieje jednak wiele dowodów sugerujących, że transgen reaguje na mutageny środowiskowe w podobny sposób jak geny endogenne20. Ponadto, ponieważ dokładne pochodzenie niezależnych zdarzeń mutacyjnych jest trudne do ustalenia, wyniki są na ogół podawane jako częstość mutacji (w przeciwieństwie do częstości mutacji). Rzeczywista częstość mutacji może być rozwiązana, jeśli wyniki zostaną skorygowane o ekspansję klonalną (tj. podział i namnażanie pojedynczej zmutowanej komórki, które mogą przyczyniać się do obserwowanej częstości mutantów transgenowych) za pomocą sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie zmutowanych transgenów może być przeprowadzone w celu scharakteryzowania mutacji lacZ i identyfikacji mutantów, które mogą pochodzić ze zdarzeń ekspansji klonalnej, chociaż znacznie zwiększa to czas i koszt analizy. Oprócz genu lacZ , wektor transgeniczny λgt10 zawiera alternatywny, zależny od temperatury gen reporterowy mutacji: wariant genu λ cII , który jest krótszy (294 pz w porównaniu z 3021 pz lacZ, ryc. 1) i łatwiejszy do zsekwencjonowania29. Sekwencjonowanie pozwala również na analizę spektrum indukowanych mutacji, zapewniając wgląd w mechanizm mutacji danego związku. Skrajnym przykładem ekspansji klonalnej jest wystąpienie mutacji "jackpot" (tj. mutacji transgenowych na bardzo wczesnym etapie rozwoju narządu, które przyczyniają się do dramatycznie podwyższonego MF, czasami od setek do tysięcy razy większego niż tło). Zwierzęta lub tkanki z mutacją "jackpot" powinny zostać usunięte z analizy.

Test, który opisaliśmy, ma szerokie zastosowanie do innych modeli TGR, takich jak mysz i szczur BigBlue oraz mysz plazmidowa lacZ , z których wszystkie zawierają podobne wektory reporterowe mutacji (omówione w20). Zdecydowana większość przeprowadzonych do tej pory badań na komórkach rozrodczych, w których zastosowano podobne metody, koncentrowała się prawie wyłącznie na dobrze scharakteryzowanych mutagenach, takich jak ENU i promieniowanie (przegląd w30 przypadkach). Oczekuje się, że wraz z niedawnym wydaniem wytycznych OECD dotyczących badań TGR, test ten będzie coraz bardziej popularny w badaniach przesiewowych substancji chemicznych i ocenie regulacyjnej. Włączenie testu mutacji komórek rozrodczych TGR do zestawu testów regulacyjnych wypełni istniejącą lukę, umożliwiając skuteczną ocenę indukcji mutacji w komórkach rozrodczych11. Co więcej, test ten może być stosowany do pomiaru MF w praktycznie każdej tkance, zapewniając odpowiedni środek do porównywania względnej wrażliwości komórek somatycznych i komórek rozrodczych na indukcję mutacji przez czynniki środowiskowe przy identycznych genetycznych punktach końcowych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez inicjatywy Kanadyjskiego Systemu Regulacyjnego dla Biotechnologii (CRSB) i Planu Zarządzania Chemikaliami (CMP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MutaMouseCovance-
E. coli (lacZ-/galE-)Covance-Zobaczodniesienie 25 w rękopisie
ChloroformCaledon3001-2-40
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)Gibco14190-250
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M, pH 8Sigma-Aldrich03690 FLUKA
Caledon2/10/7900
Baza bulionowa Lennon LBInvitrogen12780-029
Filtr siatkowy ze stali nierdzewnejSigma-AldrichS3770
Ekstrakt z opakowania transpackAgilent Technologies200220
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Alkohol etylowy, bezwodny (EtOH)Alkoholehandlowe-Ampicilina
Gibco11593-027przygotować 20 mg/ml w dH2O
KanamycinGibco11815-024przygotować 5 mg/ml w dH2O
PhenolInvitrogen15509-097Nasycić w 0,1 M Tris-HCl zgodnie z zaleceniami producenta
Fenylo-β-D-galaktopiranozyd (P-Gal)Sigma-AldrichP6501rozpuścić 3 g na 10 ml dimetyloformamidu
Proteinaza KInvitrogen25530-031przygotować 60 mg/ml roztworu dH2O tuż przed użyciem, 20 &mikro; l na próbkę
Octan sodu (NaAc)Fisher ScientificBP333-500przygotować 3 M roztwór roztworu, pH 5,2
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL4390przygotować 10% roztwór w dH2O
1 M MgSO424,6 g MgSO4· 7H2O na 100 ml dH2O, autoklaw, przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku
Rosół5,0 g LB zasada, 6,4 g NaCl na 1 l dH2O. Autoklaw i chłodny
sól fizjologiczna cytrynian sodu (SSC)150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodowy, pH 7,0 
Bufor5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4· 7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5,0 ml żelatyny (2% w/v), na 1 l dH2O, autoklaw, przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku
Bufor10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8
Alkohol izoamylowy LB SM TE

Bibliografia

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184(2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutacja kom rek linii p ciowejm skie kom rki linii p ciowejtypy kom rek spermatogennychselekcja pozytywna in vitropakowanie fag w lambdapomiar cz stotliwo ci mutacjinara enie na mutagen chemicznywytyczne OECD dotycz ce testowaniatoksykologia genetyczna

Powiązane artykuły