Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Podsumowanie

Polipeptydy podobne do elastyny to biopolimery reagujące na bodźce, o różnych zastosowaniach, od oczyszczania białek rekombinowanych po dostarczanie leków. Protokół ten opisuje oczyszczanie i charakterystykę polipeptydów podobnych do elastyny oraz ich fuzji peptydów lub białek z Escherichia coli przy użyciu ich zachowania przemiany fazowej w dolnej temperaturze roztworu krytycznego jako prostej alternatywy dla chromatografii.

Streszczenie

Polipeptydy podobne do elastyny to powtarzalne biopolimery, które wykazują niższą temperaturę krytyczną roztworu podczas przemiany fazowej, istniejące jako rozpuszczalne unimery poniżej charakterystycznej temperatury przejścia i agregujące się w mikronowe koacerwatory powyżej ich temperatury przejścia. Konstrukcja polipeptydów podobnych do elastyny na poziomie genetycznym pozwala na precyzyjną kontrolę ich sekwencji i długości, co decyduje o ich właściwościach termicznych. Polipeptydy podobne do elastyny są wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w biodetekcji, inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków, gdzie temperaturę przejścia i architekturę biopolimeru ELP można dostosować do konkretnego zastosowania. Co więcej, zachowanie przemian fazowych w dolnej temperaturze krytycznej roztworu polipeptydów podobnych do elastyny umożliwia ich oczyszczanie przez ich reakcję termiczną, tak że ich selektywne koacerwowanie i rozpuszczanie umożliwia usunięcie zarówno rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń po ekspresji w Escherichia coli. Podejście to może być stosowane do oczyszczania samych polipeptydów podobnych do elastyny lub jako narzędzie do oczyszczania fuzji peptydów lub białek, w których rekombinowane peptydy lub białka genetycznie dołączone do znaczników polipeptydowych podobnych do elastyny można oczyścić bez chromatografii. Protokół ten opisuje oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny i ich fuzji peptydów lub białek oraz omawia podstawowe techniki charakterystyki w celu oceny zachowania termicznego czystych produktów polipeptydowych podobnych do elastyny.

Wprowadzenie

Elastynopodobne polipeptydy (ELP) to biopolimery złożone z powtarzającego się pentapeptydu VPGXG, gdzie X, reszta gościa, to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny. ELP wykazują zachowanie przejścia fazowego o niższej temperaturze krytycznej roztworu (LCST), tak że jednorodny roztwór ELP rozdzieli się na dwie fazy po podgrzaniu do LCST, co jest powszechnie nazywane odwrotną temperaturą przejścia (TT₎ w literaturze ELP¹. Obie fazy składają się z bardzo rozcieńczonej fazy globulki ELP i fazy osadowej bogatej w ELP. Osad bogaty w ELP powstaje w krótkim czasie po agregacji łańcuchów ELP w cząstki o rozmiarach mikronów, które następnie łączą się. To zachowanie występuje w zakresie kilku stopni Celsjusza i jest zazwyczaj odwracalne, ponieważ jednorodny roztwór jest odzyskiwany po powrocie do temperatury poniżej t_t.

ELP są zazwyczaj syntetyzowane w Escherichia coli (E. coli) ze sztucznego genu, który jest ligowany do plazmidu ekspresyjnego. Plazmid ten jest następnie przekształcany w linię komórkową E. coli, która jest optymalna dla ekspresji białek. Użyliśmy wyłącznie systemu wektorów pET T7-lac do ekspresji dużej różnorodności ELP w E. coli, chociaż inne systemy ekspresji w drożdżach^2-4, grzybach⁵ i roślinach^6-8 zostały również wykorzystane przez innych badaczy. Istnieje wiele podejść do genetycznej konstrukcji powtarzalnych genów ELP, w tym rekurencyjna ligacja kierunkowa (RDL)⁹, rekurencyjna kierunkowa ligacja przez rekonstrukcję plazmidu (PRe-RDL)¹⁰ i amplifikacja cyklu tocznego z rozszerzeniem nakładania się (OERCA)¹¹. Zdolność do inżynierii ELP na poziomie genetycznym daje możliwość wykorzystania technik rekombinacji DNA do tworzenia ELP o różnych architekturach (np. monobloki, dibloki, tribloki itp.), które mogą być dalej dołączane do funkcjonalnych peptydów i białek. Kontrola na poziomie genetycznym zapewnia również, że każdy ELP ulega ekspresji z dokładną długością i składem podyktowanym przez jego matrycę plazmidu genetycznego, co zapewnia doskonale monodyspersyjne produkty biopolimerowe.

Właściwości termiczne każdego ELP zależą od parametrów wewnętrznych biopolimeru, takich jak jego masa cząsteczkowa (MW) i sekwencja, a także czynników zewnętrznych, w tym jego stężenia w roztworze i obecności innych substancji rozstanowych, takich jak sole. Długość ELP¹² i jego skład pozostałości gościnnych ^1,13,14 to dwa ortogonalne parametry w konstrukcji ELP, które można wykorzystać do kontroli_Tt, gdzie hydrofobowe pozostałości gości i dłuższe łańcuchy skutkują niższym T_ts, podczas gdy hydrofilowe pozostałości gościnne i krótsze długości łańcuchów skutkują wyższym T_ts. Stężenie ELP jest odwrotnie proporcjonalne do T_t, w których roztwory o większym stężeniu ELP mają niższe T_ts¹². Rodzaj i stężenie soli mają również wpływ na ELP T_t, gdzie wpływ soli jest zgodny z serią Hofmeistera¹⁵. Aniony kosmotropowe (Cl^- i wyższe w serii Hofmeistera) obniżają ELP T_t, a zwiększenie stężenia soli wzmacnia ten efekt. Te wewnętrzne i zewnętrzne parametry można dostroić w celu uzyskania zachowania termicznego w docelowym zakresie temperatur, który jest wymagany dla określonego zastosowania ELP.

Reagujące na bodźce zachowanie ELP jest przydatne w różnorodnych zastosowaniach, w tym w biosensoryce^16,17, inżynierii tkankowej¹⁸ i dostarczaniu leków^19,20. Dodatkowo, gdy ELP są łączone z peptydami lub białkami na poziomie genetycznym, ELP może służyć jako prosty znacznik oczyszczania, aby zapewnić niedrogą metodę wsadową do oczyszczania rekombinowanych peptydów lub białek, która nie wymaga chromatografii²¹. Modyfikacja procesu oczyszczania zapewnia utrzymanie aktywności peptydu lub białka połączonego z ELP. Fuzje peptydów lub białek ELP można oczyścić do zastosowań, w których znacznik ELP jest przydatny^22,23 lub alternatywnie, gdy wymagany jest wolny peptyd lub białko, można wprowadzić miejsce rozpoznawania proteazy między peptydem lub białkiem a ELP. Usunięcie znacznika ELP można następnie osiągnąć poprzez trawienie z wolną proteazą lub fuzję proteazy ELP, przy czym ta ostatnia zapewnia dodatkową łatwość przetwarzania, ponieważ ostatnia runda oczyszczania ELP może oddzielić znacznik ELP i fuzję proteazy ELP od docelowego peptydu lub białka w jednym kroku^24,25. Poniższy protokół opisuje procedurę oczyszczania ELP i fuzji peptydów lub białek ELP za pomocą ich właściwości termicznych oraz omawia podstawowe techniki charakteryzowania odpowiedzi termicznej produktów ELP.

Protokół

1. Wyrażenie ELP

1. Zaszczepić 3 ml sterylnej pożywki Terrific Broth za pomocą bulionu DMSO lub kolonii E. coli na płytce agarowej odpowiedniej do ekspresji białka, która zawiera pożądany plazmid kodujący ELP pod kontrolą promotora T7-lac. Dodać odpowiedni antybiotyk i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N) z ciągłym wstrząsaniem przy 200 obr./min.
2. Dodać 1 ml kultury O/N do 1 l sterylnego podłoża Terrific Broth w 4-litrowej kolbie. Dodać odpowiedni antybiotyk i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, wytrząsając w sposób ciągły z prędkością 200 obr./min. UWAGA: "Nieszczelna" ekspresja wyjściowa obserwowana w przypadku promotora T7-lac jest wystarczająca do ekspresji wielu ELP na wysokim poziomie, jeśli hodowla jest inkubowana przez 24 godziny. Można jednak zastosować bardziej konwencjonalne podejście, w którym ekspresja białka jest dodatkowo indukowana przez dodanie 0,2-1 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktozydu (IPTG), gdy gęstość optyczna kultury osiąga 0,6.
3. Przenieść kulturę z 4-litrowej kolby do 1-litrowej butelki wirówkowej i odwirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 2 000 x g.
4. Odrzucić supernatant. UWAGA: Jeśli wyhoduje się więcej niż 1 l kultury, można je skondensować, dodając kolejny litr kultury do granulki i powtarzając krok 1.3. Do 2 l kultury można skondensować w jednokomórkowym osadzie.
5. Zawiesić osad w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS), wodzie lub innym pożądanym buforze, aby osiągnąć 45 ml zawiesiny komórkowej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

2. Oczyszczanie ELP: Wstępne kroki i pierwsza runda cyklu odwrotnego przejścia

1. Sonikować zawieszone osady komórkowe przez łącznie 9 minut w cyklach po 10 sekund "włączenia" i 20 sekund "wyłączenia" przy mocy wyjściowej 85 W, utrzymując próbkę na lodzie. Na krótko pozostawić próbkę do ostygnięcia na lodzie, a następnie powtórzyć 9-minutowy cykl jeszcze raz. UWAGA: Jeśli przewiduje się, że ELP będzie miał bardzo niskie_Tt, interwał "wyłączenia" można zwiększyć do 40 sekund, aby uniknąć podgrzewania roztworu powyżej TT_.
2. Przenieść lizat do probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml.
3. Dodać 2 ml 10% (w/v) polietylenoiminy (PEI) na każdy litr kultury i wstrząsnąć do wymieszania. UWAGA: PEI jest dodatnio naładowanym polimerem, który pomaga w kondensacji ujemnie naładowanych zanieczyszczeń genetycznych. Nie wykonuj tego kroku, jeśli ELP jest naładowany ujemnie, ponieważ PEI może również skondensować i usunąć produkt ELP.
4. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g.
5. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml i wyrzucić osad.
6. Opcjonalny etap "wypalania": Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 10 minut w celu denaturacji zanieczyszczeń białkowych, a następnie przenieść do temperatury 4 °C lub do lodu, aż ELP zostanie całkowicie rozpuszczony. Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej z okrągłym dnem o pojemności 50 ml i wyrzucić osad. UWAGA: Nie wykonuj tego kroku, jeśli peptyd lub białko jest połączone z ELP i oczekuje się, że ulegnie denaturacji w stanie podwyższonego ciepła. Może to spowodować, że przejście ELP stanie się nieodwracalne pod wpływem ciepła lub może zniszczyć aktywność stopionego ugrupowania.
7. Indukować przejście ELP z dodatkiem krystalicznego NaCl (nieprzekraczającego 3 M). Alternatywnie, cytrynian sodu (nieprzekraczający 0,3 M) może być stosowany do ELP, które mają wyższą_Tts lub niską wydajność. UWAGA: Roztwór powinien stać się mętny po rozpuszczeniu soli, co wskazuje na oddzielenie faz ELP od roztworu. Bardzo hydrofilowe ELP o wysokiej T t s mogąwymagać pewnego stopnia ogrzewania, w połączeniu z dodatkiem soli, w celu wywołania separacji faz ELP w tej wstępnej indukcji przejścia ELP.
8. Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut przy 16 000 x g (gorące wirowanie). UWAGA: Należy obserwować osad ELP, którego wielkość zależy od wydajności ekspresji ELP. Ten granulat ELP może początkowo wydawać się nieprzezroczysty, ale po schłodzeniu będzie wydawał się półprzezroczysty i może mieć brązowy kolor. Granulka ELP stanie się bardziej bezbarwna w miarę postępu oczyszczania i usuwania zanieczyszczeń.
9. Odrzucić supernatant i dodać 1-5 ml pożądanego buforu do osadu. Zawiesić osad poprzez pipetowanie lub ustawienie probówki tak, aby obracała się w temperaturze 4 °C. UWAGA: Wymagana objętość buforu będzie zależała od wielkości osadu ELP, a tym samym od wydajności ekspresji ELP, gdzie należy dodać wystarczającą ilość buforu, aby umożliwić rozwiązanie osadu ELP. ELP o wysokiej zawartości cysteiny czerpią korzyści z oczyszczania w wodzie za pomocą 10 mM chlorowodorku tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP-HCl) o pH 7 w celu wyeliminowania interakcji dwusiarczkowych z białkami zanieczyszczającymi. ELP o wysokiej zawartości ładunku czerpią korzyści z oczyszczania w pH dostosowanym do neutralizacji ich ładunku i zmniejszenia oddziaływań elektrostatycznych z białkami zanieczyszczającymi.
10. Przenieść zawieszony roztwór ELP w podwielokrotnościach o objętości 1 ml do czystych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
11. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g (wirowanie na zimno). Należy obserwować niewielką ilość nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
12. Przenieść supernatant do czystej probówki i wyrzucić osad.

3. Oczyszczanie ELP: Kolejne rundy cyklu odwrotnego przejścia

1. Indukować przejście ELP za pomocą ciepła i/lub dodania NaCl. Próbki mogą być inkubowane w bloku grzewczym lub w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze powyżej_tt. Jeśli jednak ELP jest połączony z białkiem (co wyklucza użycie ciepła) lub jeśli ELP ma wysoki T_t, którego nie można osiągnąć samym ciepłem, można dodać kroplami 5 M roztwór NaCl w celu wywołania przejścia ELP. UWAGA: Roztwór powinien zmętnieć, wskazując na separację faz ELP od roztworu.
2. Wirować przez 10 minut przy 16 000 x g (gorące wirowanie). Jeżeli w kroku 3.1 użyto ciepła, należy przeprowadzić ten etap wirowania w temperaturze wyższej niż wymagana do wywołania przejścia ELP. Jeśli w kroku 3.1 użyto samego NaCl, wykonaj ten etap wirowania w temperaturze RT. UWAGA: Należy obserwować osad ELP.
3. Odrzucić supernatant, dodać 500-750 μl pożądanego buforu i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie lub ustawienie probówki tak, aby obracała się w temperaturze 4 °C.
4. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 16 000 x g (wirowanie na zimno). Należy obserwować niewielką ilość nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
5. Przenieść supernatant do czystej probówki i wyrzucić osad.
6. Powtarzaj kroki od 3.1 do 3.5, aż w kroku 3.4 nie zaobserwuje się żadnych osadów zanieczyszczeń.

4. Przetwarzanie po oczyszczeniu (opcjonalnie)

1. W razie potrzeby należy przeprowadzić dializę próbki w odpowiednim buforze w celu usunięcia nadmiaru soli z oczyszczonego roztworu ELP. UWAGA: ELP przeznaczone do liofilizacji należy dializować w stosunku do ddH₂O O/N w temperaturze 4 °C.
2. W razie potrzeby liofilizować ELP do długotrwałego przechowywania, zamrażając roztwór w temperaturze -80 °C przez 30 minut przed liofilizacją O/N. UWAGA: Liofilizacja nie powinna być stosowana w przypadku ELP z dołączonymi białkami.
3. W razie potrzeby odzyskaj wolny peptyd lub białko z fuzji peptydów lub białek ELP, usuwając znacznik ELP:
   1. Trawić fuzję peptydu lub białka ELP za pomocą biotynylowanej proteazy (zgodnie z zaleceniami dostawcy proteazy) lub z fuzją ELP proteazy odpowiadającą miejscu proteazy genetycznie zaprojektowanemu między peptydem lub białkiem a ELP.
   2. W razie potrzeby usunąć biotynylowaną proteazę za pomocą kulek zmodyfikowanych streptawidyną (zgodnie z zaleceniami dostawcy proteazy).
   3. Indukować przejście rozszczepionego ELP i/lub fuzji proteazy ELP przez kroplowe dodawanie 5 M roztworu NaCl.
   4. Wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 16 000 x g. UWAGA: Należy obserwować osad ELP.
   5. Zebrać supernatant i wyrzucić osad ELP. Dializować supernatant w stosunku do żądanego buforu lub użyć filtra odśrodkowego do przeprowadzenia wymiany buforu w celu usunięcia wysokiego stężenia soli z czystego roztworu peptydu lub białka.
   6. Potwierdź całkowite rozszczepienie wolnego peptydu lub białka ze znacznika ELP za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE).

5. Charakterystyka: SDS-PAGE

1. Przygotować próbki ELP do SDS-PAGE, mieszając 10 μl ELP rozcieńczonego w wodzie z 10 μl buforu do próbki zawierającego 2-merkaptoetanol. UWAGA: 40 μg ELP jest często wystarczające do oceny wielkości i czystości produktu ELP.
2. Inkubować próbkę w temperaturze 100 °C przez 2 minuty, a następnie naładować ją na żel poliakrylamidowy wraz z drabinką białkową o odpowiedniej wielkości.
3. Uruchom żel pod napięciem 180 V, aż barwnik zbliży się do dna żelu (około 45 min).
4. Żel należy zabarwić roztworem 0,5 M CuCl₂ przez 5 minut, jednocześnie kołysząc. UWAGA: ELP zazwyczaj nie są wizualizowane przez barwienie Coomassie Brilliant Blue, ponieważ niektóre sekwencje ELP nie wchodzą w interakcje z tym barwnikiem. Coomassie Brilliant Blue oddziałuje głównie z resztami argininy i słabo oddziałuje z innymi resztami zasadowymi - histydyną i lizyną - oraz resztami aromatycznymi - tryptofanem, tyrozyną i fenyloalaniną²⁶. Tak więc ELP i fuzje peptydów lub białek ELP mogą być barwione Coomassie Brilliant Blue tylko wtedy, gdy ich pierwszorzędowa sekwencja zawiera wystarczającą liczbę tych specyficznych reszt.
5. Sprawdzić, czy MW pasma ELP odpowiada MW teoretycznej MW oczekiwanej od genu ELP i czy nie ma żadnych zewnętrznych prążków zanieczyszczeń. UWAGA: Niektóre ELP migrują z pozorną MW do 20% wyższą niż oczekiwane^{MW 9,27}.

6. Charakterystyka: Spektrometria mas czasu przelotu wspomagana matrycowo desorpcją/jonizacją laserową (MALDI-TOF-MS)

1. Przygotować roztwór ELP w 50% wodnym roztworze acetonitrylu zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego, aby osiągnąć stężenie ELP około 25 μM. UWAGA: Roztwór ten powinien być wolny od soli, dlatego ELP należy dializować w stosunku do_H2Opo oczyszczeniu.
2. Przygotować roztwór matrycowy nasyconego kwasu synapinowego w 50% wodnym roztworze acetonitrylu zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego.
3. Dodać 1 μl roztworu ELP do 9 μl roztworu matrycy, aby uzyskać stężenie ELP około 2,5 pmol/μl. UWAGA: Mieszaninę tę można dodatkowo rozcieńczyć roztworem matrycy w celu optymalizacji sygnału MALDI-TOF.
4. Umieść 1-2 μl mieszaniny ELP na metalowej płytce MALDI i pozostaw miejsce do całkowitego wyschnięcia.
5. Uzyskaj widma 5-10 za pomocą MALDI-TOF, aby określić stosunek masy do ładunku (m/z) ELP i wywnioskować jego zmierzone MW.

7. Charakterystyka: Zmętnienie zaprogramowane temperaturowo i dynamiczne rozpraszanie światła

1. Oznaczyć T ELP za pomocą mętności zaprogramowanej temperaturowo:
   1. Przygotować serię rozcieńczeń (np. od 5 do 100 μM) roztworów ELP w żądanym buforze.
   2. Za pomocą spektrofotometru UV-Vis z kontrolowaną temperaturą zmierz gęstość optyczną (O.D.) przy 350 nm w zakresie temperatur (np. 20-80 °C) przy szybkości ogrzewania 1 °C/min. UWAGA: Jeśli nie obserwuje się wzrostu średnicy zewnętrznej, T_t może przekroczyć górną granicę temperatury przyrządu. Pozorne T_t można zmniejszyć przez dodanie NaCl. Zacznij od 1 M NaCl i zwiększaj w krokach co 0,5 M, aż do wykrycia przejścia ELP w mierzalnym zakresie temperatur.
   3. Sprawdzić odwracalność przejścia ELP, mierząc spadek średnicy zewnętrznej w tym samym zakresie temperatur przy szybkości chłodzenia 1 °C/min.
   4. Określić T homopolimeru ELP, identyfikując punkt przegięcia profilu zmętnienia (średnica zewnętrzna wykreślona w funkcji temperatury). UWAGA: Temperaturę tę można łatwo zdefiniować na podstawie pochodnej krzywej OD, gdzie temperatura odpowiadająca maksimum pochodnej jest zdefiniowana jako T_t. Bardziej złożone architektury ELP będą charakteryzować się bardziej skomplikowanymi profilami zmętnienia i powinny być dalej analizowane zgodnie z opisem w sekcji 7.2.
2. Dodatkowa charakterystyka ELP, które wykazują bardziej złożone właściwości termiczne (np. kopolimery diblokowe ELP, które samoorganizują się w sferyczne miceli) uzyskuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS):
   1. Przygotować roztwór ELP w żądanym buforze i przepuścić próbkę przez filtr o wielkości porów 20-450 nm. UWAGA: Wybór wielkości porów filtra będzie zależał od obecności, wielkości i stabilności wszelkich zespołów ELP w roztworze. Najmniejszy możliwy rozmiar porów filtra jest preferowany w celu wyeliminowania zanieczyszczeń, takich jak kurz, które obniżają jakość pomiarów DLS. Większy rozmiar porów filtra powinien być stosowany, gdy występuje znaczny opór podczas przepuszczania roztworu ELP przez mniejsze rozmiary porów filtra.
   2. Zmierzyć promień hydrodynamiczny (R_H) w zakresie temperatur odpowiadającym obszarowi zainteresowania określonemu w profilu zmętnienia. UWAGA: Unimery ELP mają zazwyczaj R_H<10 nm, zespoły nanocząstek mają R_H~20-100 nm, a agregaty mają R_H>500 nm. Każdy wzrost wilgotności względnej powinien odpowiadać wzrostowi średnicy zewnętrznej przy 350 nm mierzonemu za pomocą spektrofotometrii UV-Vis w funkcji temperatury, która jest proporcjonalna do wielkości cząstki.

Wyniki

Tutaj opisujemy reprezentatywne wyniki dla oczyszczania i charakterystyki homopolimeru ELP oraz kopolimeru diblokowego ELP. Po 24 godzinach od ekspresji w E. coli, komórki są zbierane przez wirowanie i poddawane lizie przez sonikację. Zazwyczaj po sonikacji następuje subtelna zmiana koloru, potwierdzająca wystarczającą lizę komórek (ryc. 1A). Po dodaniu PEI, składniki genomowe i szczątki komórkowe są zbierane przez wirowanie, oddzielając dużą osadę nierozpuszczalnych zanieczyszczeń od rozpuszczalnego ELP w supernatancie (ryc. 1B). ELP jest dalej oczyszczany przez odwrotny cykl przejścia (ITC), który wykorzystuje zachowanie LCST do oddzielenia ELP zarówno od rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (Rysunek 2)²⁸. Przemiana fazowa ELP jest wyzwalana przez dodanie ciepła i/lub soli. Wirowanie powoduje utworzenie się osadu na dnie probówki, który składa się z ELP i niektórych nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (rysunek 1C). Ten etap – określany jako wirowanie na gorąco – usuwa rozpuszczalne zanieczyszczenia z supernatantu, podczas gdy osad ELP jest zatrzymywany i ponownie zawieszany w zimnym buforze. Rozpuszczony ELP jest ponownie odwirowywany w temperaturze 4 °C. Ten etap – określany jako wirowanie na zimno – odrzuca osad nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, podczas gdy supernatant zawierający rozpuszczalny ELP zostaje zatrzymany. Powtarzanie cyklu naprzemiennego wirowania na gorąco i na zimno zwiększa czystość ELP, ale kosztem nieznacznie malejącej wydajności, ponieważ resztkowy ELP jest tracony podczas każdej rundy ITC w probówkach wirówkowych i na końcówkach pipet.

Pomyślne oczyszczanie ELP oraz fuzji peptydów lub białek ELP zostało potwierdzone przez SDS-PAGE. Małe porcje pobrane w trakcie procesu oczyszczania wskazują na stopniowe oczyszczanie ELP z lizatu E. coli. ELP ulega nadekspresji w surowym lizacie E. coli, a zanieczyszczenia zmniejszają się wraz z kolejnymi rundami ITC (ryc. 3). Oczyszczony ELP pojawia się jako pojedyncze pasmo w pobliżu przewidywanego teoretycznego MW.

ELP_{T t} charakteryzuje się mętnością zaprogramowaną temperaturowo. Profil zmętnienia homopolimeru ELP wykazuje pojedynczy gwałtowny wzrost średnicy zewnętrznej przy 350 nm (około 2,0 jednostki powyżej wartości wyjściowej dla stężenia ELP 25 μM) (Rysunek 4A). Skany zmętnienia chłodzenia potwierdzają odwracalny charakter przejścia ELP, gdy średnica zewnętrzna wraca do linii bazowej, gdy temperatura spada poniżej T_t (rysunek 4B). Kopolimery diblokowe ELP wykazują bardziej złożony profil zmętnienia w porównaniu z homopolimerowymi ELP. Średnica zewnętrzna zwykle najpierw wzrasta do 0,1-0,5 jednostki powyżej wartości bazowej, po czym gwałtownie wzrasta do 2,0 jednostek powyżej wartości wyjściowej (rysunek 5A). Pomiary DLS dostarczają informacji o zmianie wilgotności względnej w odniesieniu do temperatury, potwierdzając informacje uzyskane z profilu zmętnienia (rysunek 5B).

Rysunek 1. Wstępne oczyszczanie ELP. Po 24 godzinach od ekspresji komórki E. coli są zbierane przez odwirowanie i ponownie zawieszane w PBS. A) Komórki są poddawane lizie za pomocą sonikacji, której towarzyszy subtelna zmiana koloru, tak że lizat ciemnieje po sonikacji. B) Po dodaniu PEI w celu skondensowania zanieczyszczeń DNA, lizat jest odwirowywany, a duża osadka nierozpuszczalnych zanieczyszczeń jest oddzielana od rozpuszczalnego ELP w supernatancie. C) Przejście ELP jest indukowane przez dodanie ciepła i/lub soli, a wirowanie tworzy półprzezroczystą osadkę ELP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Cykl przejścia odwrotnego. ELP jest oczyszczany za pomocą LCST zarówno z rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Zaczynając od lizatu bogatego w ELP (1), przejście ELP jest indukowane przez dodanie ciepła i/lub soli, a ELP jest rozdzielane przez odwirowanie (gorące wirowanie) (2). Osad ELP jest zatrzymywany (3a), podczas gdy supernatant zawierający rozpuszczalne zanieczyszczenia jest odrzucany (3b). ELP zawiesza się ponownie w zimnym buforze (4) i ponownie odwirowuje w temperaturze 4 °C (zimne wirowanie) (5). Osad zawierający nierozpuszczalne zanieczyszczenia jest odrzucany (6a), podczas gdy supernatant zawierający rozpuszczalny ELP jest zatrzymywany (6b). Cykle naprzemiennych gorących i zimnych wirowań są powtarzane aż do osiągnięcia pożądanej czystości, zgodnie z ustaleniami SDS-PAGE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza SDS-PAGE produktów oczyszczania ELP. Pomyślne oczyszczenie ELP jest potwierdzone przez SDS-PAGE. Nadekspresja ELP jest widoczna w surowym lizacie E. coli po sonikacji (2). Po dodaniu PEI i odwirowaniu rozpuszczalny ELP jest w dużej mierze zatrzymywany w supernatance (3), chociaż część ELP jest tracona w wyrzuconych osadach nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (4). Supernatant po pierwszym gorącym wirowaniu zawiera znaczne ilości rozpuszczalnych zanieczyszczeń (5). Supernatant następujący po pierwszym wirowaniu na zimno wskazuje na dobre oddzielenie ELP od nierozpuszczalnych zanieczyszczeń (6). Dodatkowe cykle gorących (7) i zimnych wirowania (8) usuwają odpowiednio resztkowe rozpuszczalne i nierozpuszczalne zanieczyszczenia, aż do momentu, gdy końcowe gorące (9) i zimne spiny (10) supernatantów nie wykażą żadnych obcych pasm zanieczyszczeń, potwierdzając zadowalającą czystość produktu ELP. Ten homopolimer ELP, o sekwencji SKGPG-(VGVPG)_80-Y, ma oczekiwaną masę cząsteczkową 33,37 kDa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Charakterystyka homopolimeru ELP za pomocą mętności zaprogramowanej temperaturowo. ELP T_t jest oznaczany przez monitorowanie średnicy zewnętrznej przy 350 nm przy jednoczesnym zwiększaniu temperatury w tempie 1 °C/min. A) Homopolimery ELP wykazują pojedynczy gwałtowny wzrost średnicy zewnętrznej, który określa_{ich T t} przy danym stężeniu. B) Odwracalność przejścia ELP jest weryfikowana przez monitorowanie średnicy zewnętrznej przy 350 nm roztworu o stężeniu 25 μ M przy jednoczesnym obniżeniu temperatury, przy czym odwracalność potwierdza się przez powrót średnicy zewnętrznej do linii podstawowej. Ten homopolimer ELP ma sekwencję SKGPG-(VGVPG)_80-Y. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Charakterystyka kopolimeru diblokowego ELP za pomocą zaprogramowanej temperaturowo turbidymetrii i dynamicznego rozpraszania światła. ELP, które ulegają samoorganizacji w skali nano, takie jak kopolimery diblokowe ELP, które samoorganizują się w sferyczne miceli, wykazują bardziej złożone profile zmętnienia. A) Umiarkowany wzrost średnicy zewnętrznej wskazuje na przejście od unimerów do miceli, przed szybkim wzrostem średnicy zewnętrznej, który wskazuje na całkowitą agregację ELP w agregaty w skali mikronowej. B) Pomiary DLS potwierdzają zachowanie wywnioskowane z profilu zmętnienia dla roztworu o stężeniu 25 μM, dostarczając informacji o zmianie wilgotności względnej_w odniesieniu do temperatury. Tutaj unimer ELP ma R_H ~ 8 nm, a micela ma R_H ~ 25 nm. Ten kopolimer diblokowy ELP ma sekwencję GCGWPG-(VGVPG)₆₀-(AGVPGGGVPG)_30-PGGS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

ELP oferują niedrogi i wolny od chromatografii sposób oczyszczania poprzez wykorzystanie ich zachowania fazowego reagującego na bodziec. Podejście to wykorzystuje zachowanie LCST ELP i fuzji peptydów lub białek ELP w celu wyeliminowania zarówno rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń po ekspresji genetycznie kodowanych ELP w E. coli. Ta łatwość oczyszczania może być wykorzystana do produkcji ELP do różnych zastosowań lub może być wykorzystana do oczyszczania rekombinowanych peptydów lub białek, w których ELP może działać jako znacznik oczyszczający, który można usunąć w procesie po oczyszczeniu.

Oczyszczanie ELP obejmuje wstępne etapy lizy E. coli i usunięcia genomowych i nierozpuszczalnych szczątków komórkowych z surowego lizatu hodowlanego (ryc. 1), a następnie usunięcie pozostałości rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń przez ITC (ryc. 2). Wirowanie po wyzwoleniu przejścia ELP przez dodanie ciepła lub soli oddziela ELP od rozpuszczalnych zanieczyszczeń w supernatancie, w kroku zwanym gorącym wirowaniem. Po ponownym rozpuszczeniu ELP, roztwór jest ponownie odwirowywany w temperaturze poniżej t_t w celu usunięcia nierozpuszczalnych osadów zanieczyszczających, w kroku zwanym zimnym wirowaniem. Naprzemienne wirowanie na gorąco i na zimno poprawia czystość roztworu ELP w każdym cyklu, przy niewielkim koszcie uzyskania plonu. Wydajność oczyszczania różni się w zależności od ELP T_, długości i skondensowanych peptydów lub białek. Zazwyczaj protokół ten daje 100 mg oczyszczonego ELP na litr kultury E. coli, jednak plony mogą sięgać nawet 500 mg/l. Ostateczna czystość produktu ELP jest potwierdzona przez SDS-PAGE (rysunek 3). MW oczyszczonego ELP powinna być ściśle zgodna z teoretyczną MW kodowaną przez gen ELP. Jednak niektóre ELP migrują w SDS-PAGE z pozorną MW do 20% wyższą niż oczekiwane^{MW 9,27}. Bardziej precyzyjną analizę ELP MW można uzyskać za pomocą MALDI-TOF-MS, który może również dostarczyć dodatkowych informacji na temat czystości produktu ELP wraz z ortogonalnymi technikami analitycznymi, takimi jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).

Po oczyszczeniu ELP T_t jest mierzony za pomocą mętności zaprogramowanej pod kątem temperatury. Technika ta monitoruje średnicę zewnętrzną roztworu ELP podczas wzrostu temperatury. _{T t} jest zależny od stężenia, dlatego zaleca się scharakteryzowanie szeregu stężeń istotnych dla zamierzonego zastosowania ELP. W przypadku homopolimerów ELP profil zmętnienia wykazuje pojedynczy gwałtowny wzrost, który odpowiada przejściu ELP od agregatów jednomerowych do agregatów w skali mikronowej (rysunek 4A). T_t definiuje się jako temperaturę odpowiadającą punktowi przegięcia w profilu zmętnienia, precyzyjnie wyznaczoną jako maksimum pierwszej pochodnej średnicy zewnętrznej w odniesieniu do temperatury. Odwracalność przejścia fazowego ELP potwierdza spadek średnicy zewnętrznej w stosunku do wartości wyjściowej, gdy temperatura jest obniżana poniżej T_t (rysunek 4B). Profil zmętnienia wraz ze wzrostem i spadkiem temperatur będzie różnił się wielkością i kinetyką ze względu na osiadanie koacerwatów ELP i zmienną histerezę rozpuszczania ELP. Fuzje peptydów lub białek ELP podobnie wykazują zachowanie LCST w ten sposób, w którym peptyd lub białko połączone z ELP wpływa_{na TT.} W przypadku fuzji białek ELP przejście jest odwracalne poniżej temperatury topnienia białka. Podczas gdy turbidymetria zaprogramowana temperaturowo jest doskonałą metodą wstępnej charakterystyki termicznej produktów ELP, alternatywne techniki, takie jak różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC), mogą być również stosowane do pomiaru ELP T_t.

ELP o bardziej złożonej architekturze wykazują bardziej skomplikowane zachowania termiczne, które można również scharakteryzować za pomocą zmętnienia zaprogramowanego w temperaturze. Na przykład kopolimery diblokowe ELP wykazują charakterystyczny profil zmętnienia odpowiadający ich samoorganizacji w sferyczne micele w krytycznej temperaturze micelizacji wywołanej temperaturą. W przypadku takich kopolimerów diblokowych ELP średnica zewnętrzna zwykle najpierw wzrasta o 0,1-0,5 jednostki powyżej linii podstawowej, wskazując na przejście od unimerów do miceli, po czym gwałtowny wzrost średnicy zewnętrznej (do 2,0 jednostek powyżej linii podstawowej) w wyższej temperaturze wskazuje na tworzenie się agregatów w skali mikronowej (rysunek 5A). Dodatkowe informacje na temat samoorganizujących się struktur ELP wyzwalanych temperaturą uzyskuje się za pomocą DLS, techniki, która mierzy_wilgotność względną zespołów ELP w roztworze. Zmiany wilgotności_{względnej są} ściśle zgodne ze zmianami średnicy zewnętrznej mierzonymi za pomocą mętności (ryc. 5B). Unimery ELP zwykle wykazują R_H<10 nm, podczas gdy zespoły nanocząstek wykazują R_H~20-100 nm, a agregaty wykazują R_H>500 nm. Dodatkowe informacje o samoorganizujących się nanocząstkach ELP, takie jak liczba agregacji i morfologia, można uzyskać za pomocą statycznego rozpraszania światła lub kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej 17,23,29.

Ze względu na możliwość przestrajania właściwości termicznych ELP, różne konstrukcje ELP uzyskuje się zakres T_ts. Ważne jest, aby pamiętać, że nieodłączne_{T t} będzie miało wpływ na optymalizację protokołu oczyszczania dla każdego ELP, gdzie ekstremalnie niskie lub_{wysokie T t}s będzie wymagało największej modyfikacji tego standardowego protokołu. ELP o ekstremalnie wysokich temperaturach przejścia mogą nie nadawać się do oczyszczania przy takim podejściu. Jeśli projekt nowych ELP i fuzji peptydów lub białek ELP może zagrozić odpowiedzi termicznej ELP, można dołączyć prosty znacznik histydyny do alternatywnego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu. Dodatkowo, charakterystyka sekwencji ELP może wymagać modyfikacji tego protokołu, jeśli pozostałość gościa jest ładowana. Manipulacja pH buforu może być stosowana jako metoda zmiany całkowitego ładunku ELP w celu wyeliminowania oddziaływań elektrostatycznych z zanieczyszczeniami¹⁷. Ponadto protokół ten jest odpowiedni dla szczególnych okoliczności fuzji ELP z peptydami i białkami, gdy podejmowane są odpowiednie środki w celu zapewnienia, że proces oczyszczania nie zaburza aktywności skonoperowanej części. Uwagi w całym protokole dotyczące takich modyfikacji służą ukierunkowaniu oczyszczania ELP, które mogą stanowić takie wyzwania w odniesieniu do problemów związanych z_Tt, ładunkiem lub fuzją.

Oczyszczanie ELP za pomocą ich zachowania LCST stanowi proste i wolne od chromatografii podejście do oczyszczania większości ELP i fuzji peptydów lub białek ELP ulegających ekspresji w E. coli. Podsumowany tutaj protokół pozwala na oczyszczanie ELP w ciągu jednego dnia przy użyciu sprzętu, który jest wspólny dla większości laboratoriów biologicznych. Mamy nadzieję, że łatwość oczyszczania ELP i ich fuzji zachęci do coraz większej różnorodności projektów ELP do nowych zastosowań w materiałoznawstwie, biotechnologii i medycynie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wektory ekspresyjne pET-24a(+) pET-25b(+)	Novagen	69749-3 69753-3	T7-lac z opornością na kanamycynę (pET-24) lub ampicylinę (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) kompetentne komórki	Edge BioSystems	45363	Competent E. coli do ekspresji białek rekombinowanych.
Terrific Broth (TB) Pożywka do uprawy w suchym proszku	MO BIO Laboratories	12105	Pożywka jest odtwarzana w DI H2O i sterylizowana w autoklawie przed użyciem.
Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	IPTG jest odtwarzany w DI H2O, sterylnie filtrowany i dodawany do kultur w celu wywołania zwiększonej ekspresji.
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)	Calbiochem	524650	Te tabletki PBS po rozpuszczeniu w 1 l DI H2O, dają 10 mM bufor fosforanowy ze 140 mM NaCl i 3 mM KCl o pH 7,4 w temperaturze 25 °C.
Roztwór polietylenoiminy (PEI) (~50% w/v)	MP Biomedicals	195444	PEI jest przygotowywany jako 10% (w/v) roztwór w dejonizowanym H2O.
Probówki wirówkowe szybkoobrotowe Nalgene Oak Ridge, 50 ml	Thermo Scientific	3138-0050	Te probówki z okrągłym dnem wytrzymują wirowanie z dużą prędkością 30-50 ml.
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491	Podstawowy roztwór TCEP-HCl przygotowuje się w temperaturze 100 mM w DI H2O i dostosowuje do pH 7,0. W przypadku ELP o wysokiej zawartości cysteiny roztwór podstawowy tego środka redukującego dodaje się do osadu ELP, aby osiągnąć 10 mM w H2O.
Gotowy żel Tris-HCl żel, 4-20% liniowy gradient poliakrylamidowy żel, 10 dołków, 30 μ l	Bio-Rad Laboratories	161-1105	Te liniowe żele gradientowe zapewniają dobrą wizualizację ELP o zakresie MW.
Chlorek miedzi dwuwodny (CuCl2· 2H2O)	Fisher Scientific	C454-500	Przefiltrowany roztwór 0,5 M przygotowuje się do barwienia ujemnego żeli poliakrylamidowych Tris-HCl.
Filtr strzykawkowy Anotop 10: 0,02 i mu; M 0,1 Μ M 0,2 Μ m	Whatman	6809-1002 6809-1012 6809-1022	Te filtry strzykawkowe o średnicy 10 mm umożliwiają przygotowanie małych objętości do pomiarów DLS.
Filtr Millex-HV: 0,45 μ m	EMD Millipore	SLHVX13NK	Te filtry strzykawkowe o średnicy 13 mm umożliwiają przygotowanie małych objętości roztworów z dużymi zespołami nanocząstek do pomiarów DLS.