Do przyszłych zastosowań jako łatka do naprawy częściowych zerwań więzadła krzyżowego przedniego (ACL), ludzkie komórki pochodzące z ACL zostały wyizolowane z tkanki uzyskanej podczas procedur rekonstrukcyjnych, namnażone in vitro i wyhodowane na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Następnie przeprowadzono adhezję komórkową i morfologię, aby potwierdzić biokompatybilność na powierzchni rusztowania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uraz ACL jest często spotykanym problemem u osób aktywnych. Nawet częściowe zerwanie tego wewnątrzstawowego więzadła kolana prowadzi do braków biomechanicznych, które upośledzają funkcję i stabilność. Obecne opcje leczenia częściowych zerwań ACL obejmują zarówno nieoperacyjne, zachowawcze leczenie, jak i wiele opcji chirurgicznych, takich jak: modyfikacja termiczna, naprawa pojedynczego pęczka, całkowita rekonstrukcja i rekonstrukcja uszkodzonej części więzadła natywnego. Niewiele badań, jeśli w ogóle, wykazało, że jakakolwiek pojedyncza metoda leczenia jest konsekwentnie lepsza, a w wielu przypadkach pacjenci nadal wykazują trwałą niestabilność i inne choroby współistniejące.
Celem tego badania jest zidentyfikowanie potencjalnego źródła komórek do wykorzystania w rozwoju łatki inżynierii tkankowej, która mogłaby zostać zaimplementowana do naprawy częściowo zerwanego ACL. Opracowano nowatorski protokół do ekspansji komórek pochodzących od pacjentów poddawanych rekonstrukcji ACL. Aby wyizolować komórki, zmieloną tkankę hACL uzyskaną podczas rekonstrukcji ACL trawiono w roztworze kolagenazy. Ekspansję przeprowadzono przy użyciu pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S). Komórki były następnie przechowywane w temperaturze -80 ºC lub w ciekłym azocie w pożywce zamrażającej składającej się z DMSO, FBS i pożywki ekspandującej. Po rozmrożeniu komórki pochodzące z hACL zostały następnie wysiane na rusztowanie inżynierii tkankowej, PLAGA (kwas polimlekowo-ko-glikolowy) i polistyren kontrolny do hodowli tkankowej (TCPS). Po 7 dniach wykonano SEM w celu porównania adhezji komórkowej do PLAGA w porównaniu z kontrolnym TCPS. Morfologię komórkową oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Mikrofotografie SEM (Scanning Electron Microscope) wykazały, że komórki rosły i przylegały zarówno do powierzchni PLAGA, jak i TCPS, a do 7 dnia zlewały się na całej powierzchni. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało normalne, nienaprężone wzorce morfologiczne na obu powierzchniach. Technika ta jest obiecująca pod kątem zastosowań w regeneracji i rekonstrukcji ACL.
Wprowadzenie
Więzadło krzyżowe przednie (ACL) jest często uszkadzane więzadło wewnątrzstawowe kolana. Rocznie w Stanach Zjednoczonych zgłaszanych jest około 200 000 urazów (ACL). Ponad 75% pacjentów doświadczających urazu ACL decyduje się na ortopedyczną chirurgię rekonstrukcyjną 1,2,3,4. Interwencja chirurgiczna jest często wskazana ze względu na z natury słaby potencjał gojenia3. Rekonstrukcja ACL jest zwykle wykonywana za pomocą autoprzeszczepu lub ścięgna alloprzeszczepu. Autoprzeszczep i przeszczep allogeniczny stanowią złoty standard w rekonstrukcji, ponieważ mogą pochwalić się wysokimi wskaźnikami sukcesu, a naprawa szwów pierwotnych, inna opcja leczen....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Odzyskanie chirurgiczne
Uwaga: Uzyskano zgodę IRB na pobranie kikuta ACL podczas operacji rekonstrukcji ACL. Przyznano zwolnienie z IRB, ponieważ używany kikut ACL był na ogół wyrzucany jako odpad chirurgiczny. Do pobrania kikuta ACL wykorzystano 20 pacjentów.
- Podać pacjentowi znieczulenie ogólne i przedoperacyjne antybiotyki zgodnie z protokołem instytucji.
- Załóż opaskę uciskową i napompuj 100 mg powyżej skurczowego ciśnienia krwi.
- Ułóż pacjenta w pozycji leżącej. Wykonaj poziome przednio-boczne nacięcie kolanem w zgięciu 30-45° dla portalu 5 mm i włóż artroskopowy trokar i kamerę do worka nadrzepkowego p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model roboczy pobierania chirurgicznego, trawienia tkanek i izolacji komórek pochodzących z ludzkiego więzadła krzyżowego przedniego (hACL) przedstawiono na Rysunku 1. Komórki migrowały z eksplantatów i przylgnęły do kolb T-25. Komórki te hodowano przez 3 dni, a następnie poddano wizualizacji pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 2). Do 7. dnia uzyskano konfluentną monowarstwę. Obecność zdrowych, żywotnych komórek wskazała na pomyślne pobranie i hodowlę komórek pochodzących z hACL.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Głównym celem tego badania rusztowania hACL/2D było wykorzystanie uzyskanych komórek w plastrze do zwiększenia pierwotnej naprawy częściowych rozdarć ACL. Nieoperacyjne leczenie częściowych zerwań ACL może obejmować krótki okres unieruchomienia, usztywnienia, progresywny program rehabilitacji i regularne kontrole 13,16,17. Jednak wiele badań pokazuje, że leczenie zachowawcze u sportowców wiązało się ze słabymi wynikami i niepowodzeniami. Buckley i wsp. ocenili 25 pacjentów z częściowymi zerwaniami ACL.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować funduszowi startowemu i grantowi badawczemu wydziału chirurgii z Southern Illinois University, School of Medicine; oraz grantowi Memorial Medical Foundation.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Kolagenaza | Gibco | 17018-029 | Przechowywać pod adresem 4 ° C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Sklep pod adresem 4 °C. Ciepły w 37 ° C kąpiel wodna przed użyciem. |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 10082 | Przechowywać w -80 i #176; C |
| Penicylina/Streptomycyna | Lonza | 17-602E | Sklep pod adresem 4 ° |
| Probówki wirówkowe C - 15 ml | Kolby Corning | 430790 | |
| T-25 | BD Falcon | 3013 | |
| Mieszanina trypsyny-versenu | Lonza | 17-161E | Przechowywać pod adresem 4 °C. Ciepło w 37 i #176; C kąpiel wodna przed użyciem. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Ciecz palna. Może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. |
| Fiolki kriogeniczne | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Przechowywać w temperaturze -80 ° C |
| Dyski TCPS | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichlorometan | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Możliwe zagrożenie rakiem. Przechowywać w suchym, chłodnym miejscu. |
| Papier Bytac | gobin performance plastics | 1420652 | |
| Fiolka scyntylacyjna | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Przechowywać pod adresem 4 i #176; C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mysie przeciwciało anty-&beta-aktynowe (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Sklep pod adresem -20 ° C |
| kozie przeciwciało anty-myszy (2° Ab) | Sygnalizacja komórkowa | 4408 | Przechowuj pod adresem -20 i # 176; C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Przechowuj pod adresem -20 ° C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Aldehyd glutarowy | Fisher Scientific | BP2547-1 | Działa toksycznie przez drogi oddechowe i po połknięciu. Powoduje oparzenia wszystkimi drogami narażenia. |
| Hexamethyldisilazan | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Łatwopalna ciecz i para. Powoduje oparzenia wszystkimi drogami narażenia. |
| Sterylne nożyczki | McKesson | 25-716 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5804R | |
| Mikroskop świetlny | Olympus | CK40 | |
| Kąpiel wodna | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Szklane płytki Petriego | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch został użyty do cięcia 12 mm krążków |
| Kacodylate Bufor | Sigma Aldrich | 97068 | Ciecz łatwopalna, rakotwórcza i drażniąca. |
| Tetratlenek osmu | Sigma Aldrich | 201030 | Wysoce toksyczny |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Szkodliwy po połknięciu |
| Etanol | Decon Labs | 2705 | Przechowywać z dala od źródeł ciepła, iskier, płomieni i innych form zapłonu. |
| Znieczulenie ogólne/regionalne | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidokaina, 0,25% Bupiwakaina, Środki znieczulające do indukcji i leczenia podtrzymującego | |
| Antybiotyki | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g dożylnie |
| Trokar artroskopowy | Smith i siostrzeniec | ||
| Kamera artroskopowa | Smith i siostrzeniec | ||
| Chwytak artroskopowy i gorzka golarka | Arthrex | ||
| 4,5 mm | Arthrex | ||
| stali nierdzewnej | Arthrex | ||
| Napylarka do napylania | Polaron | E5400 |
Bibliografia
- Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
- Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
